朱珍真 郎麗巍 王紅艷 朱姍薇 韓曉彤 張翠英 曹艷茹 魏振滿(mǎn),*

(1 中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心藥學(xué)部藥物試驗(yàn)中心，北京 100039；2 成都雅途生物技術(shù)有限公司，成都 610041)

隨著細(xì)菌耐藥程度日趨上升，其中葡萄球菌及腸球菌都具有較高水平的耐藥性[1-2]，由其引起的敗血癥、急性肺炎以及皮膚和軟組織感染等嚴(yán)重感染疾病，增加了患者的痛苦[3]，針對(duì)此類(lèi)感染，研發(fā)新型抗生素已經(jīng)迫在眉睫。

目前，萬(wàn)古霉素、利奈唑胺、達(dá)托霉素等抗生素是臨床上治療耐藥菌感染的常用藥。但是隨之而來(lái)的是細(xì)菌對(duì)這些藥物的的敏感性呈逐年下降的趨勢(shì)，再加之萬(wàn)古霉素、利奈唑胺等藥物具有較大的毒副作用，使其在臨床上的應(yīng)用受到一定程度的限制[4-5]。

B7011是成都雅途生物技術(shù)有限公司自主研發(fā)的半合成第二代糖肽類(lèi)抗生素，本研究的前期試驗(yàn)中，我們檢測(cè)了B7011和萬(wàn)古霉素對(duì)目標(biāo)菌株的體外抗菌活性，測(cè)得B7011對(duì)MSSA、MRSA、VRE的MIC值分別為≤0.125、≤0.125和0.015μg/mL，均顯著低于萬(wàn)古霉素(1、1和＞256μg/mL，表明B7011具有較好的體外抗菌活性。本研究以VRE、MSSA和MRSA感染敗血癥小鼠為動(dòng)物模型，研究B7011對(duì)敗血癥小鼠的保護(hù)作用。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)藥品

試驗(yàn)藥：B7011，成都雅途生物技術(shù)有限公司研制；批號(hào)：121210-2，效價(jià)：97%；對(duì)照藥：萬(wàn)古霉素(vancomycin)，美國(guó)禮來(lái)制藥公司研制；批號(hào)：c060864，效價(jià)：100%。

1.2 試驗(yàn)菌株

革蘭陽(yáng)性菌3株。其中MSSA為標(biāo)準(zhǔn)菌株，其菌號(hào)：ATCC29213；而MRSA以及VRE為臨床分離的耐藥菌株；以上菌株均由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心微生物室提供。

1.3 培養(yǎng)基與孵育條件[6-7]

葡萄球菌：恒溫35℃，在M-H培養(yǎng)基中孵育18h；屎腸球菌：恒溫35℃，在含有5%綿羊血的M-H培養(yǎng)基中孵育20～24h。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

ICR種小鼠，體重控制在18～22g，性別見(jiàn)具體實(shí)驗(yàn)方法，由北京市斯貝福試驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供；動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(京)2011-0004；動(dòng)物飼養(yǎng)地點(diǎn)：原中國(guó)人民解放軍第三〇二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)技術(shù)保障研究中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室許可證號(hào)：SYXK(軍)2012-0010。

1.5 保護(hù)劑

高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司，生產(chǎn)日期：2013年4月8日。用純化水配置成濃度為5%的混懸液，高壓后放于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 試驗(yàn)方法

2.1 增毒實(shí)驗(yàn)方法[6-8]

為了得到可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物80%～100%死亡的菌濃度，即最小致死劑量(minimum lethal dose,MLD)菌濃度，需要對(duì)致病菌進(jìn)行增毒。增毒方法為：于試驗(yàn)前1d將試驗(yàn)用菌接種于10mL MH液體培養(yǎng)基中，按照“1.3項(xiàng)”所列要求進(jìn)行培養(yǎng)。用保護(hù)劑將培養(yǎng)好的菌原液做10-1、10-2倍稀釋?zhuān)?duì)雄性ICR小鼠進(jìn)行腹腔注射，注射劑量為每只0.5mL，注射后觀察。在無(wú)菌條件下解剖感染后剛死亡或?yàn)l死小鼠，取心臟血涂于MH固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)菌，再以此菌繼續(xù)感染小鼠，按此方法重復(fù)實(shí)驗(yàn)2～3次，得到MLD菌濃度。

2.2 免疫低下小鼠的建模[6-9]

由于VRE毒力較弱，故用腹腔注射VRE菌液造成小鼠急性敗血癥時(shí)，需在感染前先將試驗(yàn)小鼠制備成免疫低下小鼠，以提高感染的成功率。制備方法為：分別于第1天和第4天，對(duì)ICR小鼠進(jìn)行一次皮下注射環(huán)磷酰胺，注射劑量為200mg/kg/次，通過(guò)此方法，可以使小鼠的白細(xì)胞值降至100～150×109/L，末次注射環(huán)磷酰胺16h后再腹腔注射感染VRE菌液，可以保證模型對(duì)照組的死亡率在80%以上。

2.3 藥液稀釋方法[10]

采用孫瑞元介紹的低比值系列稀釋方法，即相臨兩個(gè)劑量組的藥液以0.65～0.7倍進(jìn)行稀釋?zhuān)还蚕♂?～7個(gè)濃度。藥物劑量可以通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)獲得。在正式試驗(yàn)中，最高藥物劑量應(yīng)盡量保證感染鼠存活率達(dá)到70%～100%，最低藥物劑量應(yīng)盡量使得感染鼠的存活率低于30%。

2.4 ED50(50%有效劑量)動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)[6-7]

將體重為18～20g的ICR種小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，每組10只，雌雄各半。禁食后，取5%高活性干酵母混懸液配制的MLD濃度的菌液，按每只0.5mL的劑量，以腹腔注射的方式建立感染模型。注射后1h，通過(guò)尾靜脈注射給予不同濃度的藥物，劑量為每只0.2mL。感染后連續(xù)觀察7d，記錄各給藥組、陽(yáng)性對(duì)照組以及MLD和0.1 MLD感染組小鼠死亡數(shù)，將給藥劑量和對(duì)應(yīng)的小鼠死亡數(shù)導(dǎo)入DAS 2.1.1軟件進(jìn)行半數(shù)有效劑量的運(yùn)算，得到試驗(yàn)藥和對(duì)照藥的ED50、ED5、ED95，以及兩藥藥效學(xué)參數(shù)比較P值結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)MSSA致小鼠急性感染敗血癥模型的保護(hù)作用

B7011對(duì)MSSA-ATCC 29213致小鼠急性敗血癥模型的保護(hù)作用結(jié)果為：ED50、ED5、ED95值分別為0.722、0.468和1.115mg/kg。陽(yáng)性對(duì)照藥萬(wàn)古霉素對(duì)敏感菌所致敗血癥模型也有較好的保護(hù)作用，其ED50、ED5、ED95值分別為0.764、0.416和1.403mg/kg；比較兩藥的保護(hù)作用，統(tǒng)計(jì)結(jié)果P=0.645，提示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義。表明B7011對(duì)MSSA所致小鼠急性敗血癥模型的體內(nèi)保護(hù)作用與陽(yáng)性對(duì)照藥萬(wàn)古霉素相似。具體數(shù)值見(jiàn)表1～2。

3.2 對(duì)MRSA致小鼠急性感染敗血癥模型的保護(hù)作用

B7011對(duì)MRSA- C118致小鼠急性敗血癥模型的保護(hù)作用結(jié)果為：ED50、ED5、ED95值分別為0.193、0.045和0.82mg/kg，陽(yáng)性對(duì)照藥萬(wàn)古霉素組的感染動(dòng)物死亡數(shù)量明顯多于試驗(yàn)藥組，其ED50、ED5、ED95值分別為：0.374、0.092和1.515mg/kg；比較兩藥的保護(hù)作用，統(tǒng)計(jì)結(jié)果P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)意義，由此可見(jiàn)，針對(duì)耐藥菌感染所致的小鼠急性敗血癥模型，新型糖肽類(lèi)抗生素B7011的體內(nèi)保護(hù)作用明顯優(yōu)于萬(wàn)古霉素。具體數(shù)值見(jiàn)表1～2。

3.3 對(duì)VRE致小鼠感染敗血癥模型的保護(hù)作用

B7011對(duì)VRE-No.5所致小鼠急性敗血癥模型的保護(hù)結(jié)果為：ED50、ED5、ED95值分別為0.395、0.046和3.429mg/kg，而該致病菌對(duì)陽(yáng)性對(duì)照藥萬(wàn)古霉素產(chǎn)生了明顯的耐藥性，導(dǎo)致即使提高了萬(wàn)古霉素的給藥劑量，但動(dòng)物的死亡數(shù)量仍然較多。萬(wàn)古霉素對(duì)VRE的ED50、ED5、ED95值分別為1.547、0.079和30.168mg/kg；兩藥統(tǒng)計(jì)學(xué)處理P值＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)意義。說(shuō)明B7011對(duì)VRE所致小鼠急性敗血癥模型體內(nèi)保護(hù)作用明顯優(yōu)于萬(wàn)古霉素。具體數(shù)值見(jiàn)表1～2。

4 討論

B7011是成都雅途生物技術(shù)有限公司自主研發(fā)的半合成第二代糖肽類(lèi)抗生素。與其他糖肽類(lèi)抗生素相似，B7011的藥理作用為：與處于分裂期的細(xì)胞壁肽聚糖前體末端的氨基酰-D-丙氨酰-D-丙氨酸結(jié)合，以此阻礙細(xì)胞壁的合成，從而起到抑制并殺滅細(xì)菌的作用[11-12]。不同的是，B7011在糖基側(cè)鏈中加入了一條飽和烴基鏈，長(zhǎng)度為11個(gè)碳原子，這一脂肪鏈的引入起到了大幅增加B7011半衰期的作用，而且還有利于藥物分子與致病菌細(xì)胞膜的錨定，從而增加了B7011的抗菌活性。

前期的體外試驗(yàn)結(jié)果表明B7011抗菌譜主要為革蘭陽(yáng)性菌。本研究檢測(cè)了B7011和萬(wàn)古霉素對(duì)目標(biāo)菌株的體外抗菌活性，測(cè)得B7011對(duì)MSSA、MRSA、VRE的MIC值分別為≤0.125、≤0.125和0.015μg/mL，均顯著低于萬(wàn)古霉素(1、1和＞256μg/mL)。

表1 對(duì)3株菌所致小鼠急性敗血癥模型各組給藥劑量及給藥后動(dòng)物死亡數(shù)量表Tab.1 Drug dosage for acute septicemia induced by three strains of bacteria and mortality of animals after administration

表2 B7011及萬(wàn)古霉素對(duì)革蘭陽(yáng)性球菌所致小鼠敗血癥模型保護(hù)作用的藥效學(xué)參數(shù)Tab.2 Pharmacodynamic parameters of the protective effect of B7011 and vancomycin against systemic infections in mice caused by Gram-positive cocci

基于此，本研究開(kāi)展了B7011體內(nèi)抗菌作用研究。利用臨床常見(jiàn)的革蘭陽(yáng)性菌急性感染ICR小鼠來(lái)制備敗血癥動(dòng)物模型，給與不同劑量的藥物，比較B7011和藥性對(duì)照藥萬(wàn)古霉素對(duì)敗血癥小鼠的保護(hù)作用。從已完成的ED50動(dòng)物保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果可以看出：B7011可以降低臨床常見(jiàn)致病菌急性感染的敗血癥小鼠的死亡數(shù)量，特別是對(duì)萬(wàn)古霉素已經(jīng)產(chǎn)生耐藥的菌株，其保護(hù)作用尤為顯著。結(jié)合體外試驗(yàn)數(shù)據(jù)，我們可以期待新型糖肽類(lèi)抗生素B7011有望成為臨床上應(yīng)用于耐藥菌感染的具有較好療效的藥物。目前該藥已成功申請(qǐng)臨床試驗(yàn)批件，將對(duì)其安全性、有效性和藥動(dòng)學(xué)特征等方面進(jìn)行全面的研究與評(píng)估。