張瑜杰 蒲芳芳 程如越 郭佳汶 王世杰 蔣與剛 李鳴 何方,*

(1 四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院 營養(yǎng)與食品衛(wèi)生及毒理學(xué)系， 成都 610041；2 河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊，050018；3 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津 300041)

腸道中存在著種類豐富、數(shù)量眾多的微生物，其中僅細菌就有厚壁菌門，擬桿菌門和變形菌門等1000多種[1]，它們共同構(gòu)成了一個復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境，即腸道菌群。腸道菌群可通過與宿主之間在物質(zhì)及能量等方面的相互作用，直接或者間接地影響機體正常生理功能及宿主對于疾病的易感性[2]，且腸道菌群對腸道以外的器官也存在調(diào)節(jié)作用。人體腸道菌群在圍產(chǎn)期和嬰幼兒時期內(nèi)迅速建立。同時，圍產(chǎn)期和嬰幼兒期也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵時期，該時期的內(nèi)外環(huán)境因素將對大腦及行為產(chǎn)生長期影響[3-4]。有研究認為“微生物-腸-腦軸”可通過神經(jīng)、免疫、內(nèi)分泌以及“下丘腦-垂體-腎上腺”軸(hypothalamus-pituitary-aderenal axis,HPA axis)等多種方式雙向調(diào)節(jié)，但具體機制尚未明確[5]。

抗生素目前廣泛應(yīng)用于臨床治療中，使用不當(dāng)有可能導(dǎo)致腸道菌群紊亂。目前已有研究表明生命早期使用抗生素與過敏，肥胖等疾病的發(fā)生有關(guān)[4]。此外，還發(fā)現(xiàn)抗生素引起的腸道菌群失調(diào)與認知功能障礙的發(fā)生有關(guān)[6]。

本次實驗選擇在生命早期對小鼠進行抗生素干預(yù)，造成腸道菌群紊亂。進而檢測小鼠的腸道菌群變化，腸道病理改變和海馬及前額皮質(zhì)區(qū)域的神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)mRNA表達情況。旨在探討生命早期抗生素干預(yù)對腸道菌群及腦部功能基因表達的影響。

1 實驗方法

1.1 材料和儀器

8只SPF級孕期15d左右的昆明孕鼠，購于四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所(生產(chǎn)許可證號為SCXK(川)2013-15)，隨機分為兩組。給予自由飲水、膳食，溫度(22±1)℃，濕度(55±5)%，晝夜節(jié)律12h。每日早晚兩次觀察孕鼠，以新生小鼠作為研究對象，隨機分為對照組和抗生素組(n=10/組)。

氨芐西林鈉、鹽酸萬古霉素、硫酸新霉素、桿菌肽、亞胺培南/西司他丁鈉、水溶性兩性霉素B(大連美侖生物技術(shù)有限公司)，小鼠ELISA試劑盒(R&D Systems中國公司)，Geneout?TRIzol總RNA提取試劑盒(成都蘭博生物科技有限公司)，iScript? gDNA Clear cDNA Synthesis Kit[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司]，TIANamp stool DNA Kit[天根生化科技(北京)有限公司]，Qubit? dsDNA HS Assay Kit[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]，Illumina PhiX Control v3[Illumina貿(mào)易(上海)有限公司]。

酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]，實時熒光定量PCR儀[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司]，Illumin? miseq測序儀，正置光學(xué)顯微鏡[尼康儀器(上海)有限公司]。

1.2 抗生素投用方法

兩組小鼠自出生開始分別投用混合抗生素和滅菌水直至處死，共21d。混合抗生素由氨芐西林(100mg/kg)+新霉素(100mg/kg)+桿菌肽(100mg/kg)+萬古霉素(50mg/kg)+亞胺培南/西司他丁鈉(50mg/kg)+兩性霉素B(1mg/kg)組成，溶于無菌水中。小鼠每日投用液體體積：出生10d內(nèi)為10μL，出生10～21d為100μL。對照組每日投用相同體積滅菌水。絕對劑量根據(jù)小鼠體重和混合抗生素組合方案計算得到。為保證藥效，抗生素溶液均現(xiàn)配現(xiàn)用。

因出生10d內(nèi)小鼠胃容量較小，故使用10μL移液器將液體緩慢注入小鼠口咽部，觀察未反流則為灌胃成功；出生10d后則使用灌胃針投用液體。

1.3 取材

處死前稱重、眼球采血，室溫靜置2 h，2000×g，離心15min，血清保存于-80℃?zhèn)溆谩ｎi椎脫臼處死小鼠，冰上操作取出海馬及前額皮質(zhì)，保存于-80℃?zhèn)溆谩Ｊ占∈笃?、腎上腺、胸腺并稱重。收集小腸，結(jié)腸組織，浸泡于10%中性福爾馬林溶液中進行后續(xù)病理檢測。收集結(jié)腸內(nèi)容物保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血清中細胞因子及皮質(zhì)酮檢測

采用ELISA法檢測白介素-6(Interleukin-6,IL-6)，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和皮質(zhì)酮，嚴格按照R&D小鼠ELISA試劑盒說明書操作。

1.5 腦部功能基因mRNA表達水平檢測

采用RT-PCR檢測海馬和前額皮質(zhì)中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)，γ-氨基丁酸A型受體α1亞型(γ-aminobutyric acid type A receptor α1,GABAAα1)，γ-氨基丁酸B型受體1亞型((γ-aminobutyric acid type B receptor 1,GABAb1)，神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)和5-羥色胺受體1A(5-hydroxytryptamine receptor 1A,5-HT1A)mRNA表達水平采用GENEOUT?TRIzol總RNA提取試劑盒說明書提取小鼠海馬和前額皮質(zhì)總RNA，iScript?gDNA Clear cDNA Synthesis Kit進行逆轉(zhuǎn)錄。

以β-actin作為內(nèi)參基因，各目的基因引物序列見表1，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應(yīng)體系為SsoFast EvaGreen supermix 5μL，正向引物0.3μL，反向引物0.3μL，RNase/DNase-free H2O 3.4μL，cDNA 1μL。反應(yīng)條件為95℃ 30s；95℃ 5s，Tm℃ 5s，共40個循環(huán)；讀取65～95℃的溶解曲線。使用2-△△Ct相對定量法計算目的基因的相對表達量。

1.6 病理學(xué)觀察

將腸道組織從固定液中取出，脫水、包埋、切片，HE染色。每組內(nèi)每張切片隨機挑選至少3個100倍視野進行拍照，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件以100倍標(biāo)尺為標(biāo)準(zhǔn)，每張切片選取5根完整的絨毛，分別測量小腸的絨毛長度和隱窩深度，結(jié)腸的隱窩深度。

1.7 腸道菌群分析

嚴格按照TIANamp Stool DNA Kit試劑盒說明書提取糞便樣品中的DNA。

對DNA的16S rDNA V3-V4區(qū)進行PCR擴增。擴增引物為338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTA AT-3')。反應(yīng)體系為Phusion?Hot Start Flex 2X Master Mix12.5μL，F(xiàn)orward Primer 2.5μL，Reverse Primer 2.5μL，DNA模板50ng，ddH2O補充至25μL。擴增程序為98℃ 30s；98℃ 10s，54℃ 30s，72℃ 45s，35個循環(huán)；72℃ 10min。

表1 Real time-PCR引物Tab.1 Real time-PCR primers

PCR產(chǎn)物經(jīng)AMPure XT磁珠純化后，用Qubit試劑盒定量。Agilent 2100生物芯片分析系統(tǒng)檢測擴增文庫大小，用Library Quantification Kit for Illumina試劑盒定量文庫。Illumina PhiX Control v3文庫與擴增文庫按30%比例混合后上機測序(MiSeq PE300)。采用Qiime(v1.9.1)對序列進行進一步分析，對優(yōu)質(zhì)序列按照97%的相似度聚類得到操作分類單元(OUT)，并與Greengene數(shù)據(jù)庫比對生成OTU表。用PyNAST(v0.1)軟件對代表性序列進行比對，用FastTree(v2.1.7)構(gòu)建進化樹。基于OTU和物種注釋結(jié)果，與Greengene數(shù)據(jù)庫比較后得到結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)使用±s表示。如滿足正態(tài)，方差齊則使用t檢驗進行比較；如非正態(tài)或方差不齊，使用曼-惠特尼U檢驗。P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體重及臟器指數(shù)

小鼠體重在0～21d內(nèi)持續(xù)增長，但0、7、14和21d兩組體重均無統(tǒng)計學(xué)差異，見表2。兩組小鼠的腎上腺體比和脾體比均無統(tǒng)計學(xué)差異，抗生素組胸腺體比低于對照組(P＜0.05)，見表3。

2.2 血清中細胞因子及皮質(zhì)酮

抗生素組小鼠血清IL-6水平高于對照組(P＜0.05)，TNF-α水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，皮質(zhì)酮水平低于對照組(P＜0.05)，見表4。

表2 小鼠體重變化情況Tab.2 Changes in body weight of mice

表3 小鼠臟器指數(shù)變化情況Tab.3 Changes of organ index

表4 小鼠血清細胞因子及皮質(zhì)酮變化情況Tab.4 Changes of serum cytokines and corticosterone

2.3 小腸和結(jié)腸病理觀察

兩組小腸絨毛長度和隱窩深度均無統(tǒng)計學(xué)差異，抗生素組結(jié)腸隱窩深度低于對照組(P＜0.05)(表5)。

2.4 腦部神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)mRNA表達情況

2.4.1 海馬

抗生素組GABAAα1高于對照組(P＜0.05)。兩組BDNF、GABAb1、NGF和5-HT1A均無統(tǒng)計學(xué)差異。但抗生素組BDNF、GABAb1和NGF均有上升趨勢，而5-HT1A有下降趨勢(表6)。

2.4.2 前額皮質(zhì)

抗生素組與對照組相比，BDNF、GABAAα1、GABAb1和NGF雖無統(tǒng)計學(xué)差異但均有上升趨勢(表7)。

2.5 腸道菌群分析

2.5.1 Alpha多樣性檢測

本研究中ACE和Chao1均無統(tǒng)計學(xué)差異，說明兩組群落豐富度無差異。抗生素組Shannon和Simpson低于對照組(P＜0.01,P＜0.05)，說明抗生素組的群落多樣性低于對照組。PD whole tree無統(tǒng)計學(xué)差異，說明在考慮種群進化的基礎(chǔ)上生物群落的多樣性無差異(表8)。

2.5.2 菌群相對豐度比較

相較于對照組，抗生素組在門水平和屬水平上的菌群豐度都顯著減少。同時糞便菌群的構(gòu)成也出現(xiàn)明顯差異。在抗生素組，正常糞便菌群中常見的擬桿菌門和后壁菌門比例顯著降低，而變形菌門比例顯著增高，見圖1。同時奈瑟菌屬，顆粒鏈菌屬和歐文菌屬等機會致病菌比例顯著增多，見圖2。

門水平上，與對照組相比抗生素組變形菌門顯著增高(P＜0.001)，擬桿菌門和厚壁菌門降低(P＜0.05)。屬水平上，抗生素組副桿菌屬顯著降低(P＜0.001)，奈瑟菌屬顯著增高(P＜0.01)。此外，顆粒鏈菌屬，歐文菌屬，梭桿菌屬，鏈球菌屬和克雷伯菌屬均出現(xiàn)增高(P＜0.05)，腸道菌群平均相對豐度比較結(jié)果見表9～10。

3 討論

3.1 生命早期使用抗生素對于機體免疫及內(nèi)分泌功能的影響

生命早期個體處于生長發(fā)育的第一高峰時期，該階段的生理代謝異常會對個體健康產(chǎn)生深遠的影響。已有研究表明生命早期使用抗生素會對個體健康產(chǎn)生持續(xù)影響，同時指出腸道菌群改變是兩者產(chǎn)生聯(lián)系的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[7-8]。但早期使用抗生素對機體的免疫及內(nèi)分泌功能影響的研究還少有報告。

胸腺是重要的免疫器官，通過胸腺體比可以初步了解機體免疫系統(tǒng)發(fā)育情況。本研究中，抗生素組的受試小鼠胸腺體比明顯低于對照組，且與對照組相比抗生素組的IL-6升高。提示生命早期使用抗生素有可能影響機體免疫系統(tǒng)正常發(fā)育，引起機體異常的炎癥反應(yīng)。

表6 小鼠海馬神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)mRNA表達情況 Tab.6 Expression of neurochemical mRNA in hippocampus

表7 小鼠前額皮質(zhì)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)mRNA表達情況Tab.7 Expression of neurochemical mRNA in prefrontal cortex

表8 小鼠腸道菌群的Alpha多樣性Tab.8 Alpha diversity of intestinal flora

圖1 門水平小鼠糞便菌群構(gòu)成圖Fig.1 The structure of intestinal flora at phylum level

圖2 屬水平小鼠糞便菌群構(gòu)成Fig.2 the structure of intestinal flora at genus level

表9 門水平不同菌群的平均相對豐度Tab.9 Mean relative abundance of different taxa at phylum level

皮質(zhì)酮是一種重要的腎上腺皮質(zhì)激素，具有多種生理代謝調(diào)節(jié)作用，皮質(zhì)酮的改變將通過HPA軸對腦部功能產(chǎn)生一定的影響，本研究發(fā)現(xiàn)抗生素組受試小鼠血清中的皮質(zhì)酮顯著低于對照組。提示生命早期使用抗生素還可能會引起機體皮質(zhì)酮減少等內(nèi)分泌功能的失調(diào)或者紊亂。

表10 屬水平不同菌群的平均相對豐度Tab.10 Mean relative abundance of different taxa at genus level

3.2 生命早期使用抗生素對腸道上皮組織形態(tài)的影響

腸道作為消化系統(tǒng)的重要組成部分，具有吸收、代謝以及內(nèi)分泌等功能，與機體的健康有著密切聯(lián)系?？股亟M小鼠結(jié)腸隱窩深度變淺，說明抗生素對小鼠的腸道結(jié)構(gòu)有一定的損傷作用。有研究表明使用抗生素可能會增加小鼠患結(jié)腸炎的風(fēng)險[9]，而結(jié)腸隱窩變淺可能是其早期病理改變。

3.3 生命早期使用抗生素對腸道菌群及腦部功能基因表達的影響

腸道菌群對機體的免疫、內(nèi)分泌、代謝等多種功能具有調(diào)節(jié)作用。近年也有研究指出腸道菌群可以調(diào)節(jié)腦部功能，腸道菌群紊亂與某些腦部功能的異常改變有關(guān)[3,10-11]。但是腸道菌群與腦部功能的特異關(guān)系及作用機理仍有待更深入地研究。

本次研究中，聯(lián)合使用多種抗生素誘導(dǎo)小鼠腸道菌群發(fā)生紊亂。選擇抗生素主要有兩方面考慮：一方面，本研究關(guān)注腸道菌群與腦部功能基因之間的關(guān)系，故選擇腸道吸收較差的抗生素，使抗生素的作用盡量局限在腸道而對腸外組織無直接作用；另一方面，由于本實驗是初步性探索，希望不僅能引起優(yōu)勢菌群的改變，也能同時能作用于非優(yōu)勢的微小菌群，以盡可能誘導(dǎo)腸道菌群在種群結(jié)構(gòu)上發(fā)生質(zhì)和量的紊亂。綜上，在結(jié)合文獻報道[12-15]以及相應(yīng)抗生素的抗菌譜后確定了包括對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌作用在內(nèi)的6種抗生素種類與其作用劑量。在后續(xù)研究中，將逐步減少抗生素種類，以探索菌群種屬與腦部功能基因表達改變之間更加詳細的特異關(guān)系。

本次研究發(fā)現(xiàn)，使用抗生素后兩組的腸道菌群在門水平和屬水平上均有明顯差異。相較于對照組，抗生素組變形菌門顯著增多，而擬桿菌門和厚壁菌門顯著減少；抗生素組副桿菌屬顯著降低，而致病菌奈瑟菌屬，顆粒鏈菌屬，歐文菌屬等均顯著增高。提示生命早期使用抗生素可導(dǎo)致腸道菌群紊亂，以及變形菌為代表的有害致病菌比例增高。

目前，有研究表明腸道菌群與腦部認知功能之間存著雙向信息交流[16]。本次研究發(fā)現(xiàn)，與腦部認知記憶有關(guān)的海馬區(qū)以及前額皮質(zhì)中的部分神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)分泌異常。GABA作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其具有調(diào)節(jié)緊張、焦慮行為以及心血管功能的作用。有研究表明腸道菌群中的短乳酸桿菌和齒雙歧桿菌能夠產(chǎn)生GABA[17]?？股亟M海馬的GABAAα1mRNA表達明顯增加，GABAb1mRNA在海馬和前額皮質(zhì)也均呈上升趨勢。其他神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)也都表現(xiàn)出了各自不同的變化趨勢。同時發(fā)現(xiàn)不同腦部區(qū)域的同一種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)變化情況并不完全一致。提示腸道菌群紊亂可導(dǎo)致神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的異常分泌，這種異常改變可能與腦功能的分區(qū)有一定的聯(lián)系。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在小鼠生命早期使用抗生素能夠造成腸道菌群紊亂、免疫功能的改變，破壞小鼠正常腸道結(jié)構(gòu)。同時，抗生素引起的腸道菌群紊亂導(dǎo)致海馬與前額皮質(zhì)中部分神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的異常分泌，提示生命早期使用抗生素引起腸道菌群紊亂可能導(dǎo)致小鼠腦部功能發(fā)生異常改變。生命早期使用抗生素引起機體的異常改變均可能與腸道菌群對腦部功能產(chǎn)生影響的機制密切相關(guān)，但具體機制還需在今后進行更深入地研究。該實驗為進一步研究腸道菌群與腦部功能間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。