馬次郎 陳奕公 劉曉明 王文超 朱慧 蘇建宇,*

(1 寧夏大學生命科學學院 西部特色生物資源保護利用教育部重點實驗室，銀川 750021；2 寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川 750101)

泰樂星(tylosin,Tyl)是一類十六元大環(huán)內(nèi)酯類獸用抗生素，其抗菌譜廣，在應對革蘭陽性菌感染以及畜牧增產(chǎn)方面發(fā)揮了巨大作用，被廣泛應用于獸藥及飼料添加劑。目前，在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中，弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradie)是泰樂菌素的主要生產(chǎn)菌[1-3]。

弗氏鏈霉菌泰樂菌素生物合成基因簇(tylgene cluster)從抗性基因tlrB延伸至tlrC，共有85kb，含43個ORFs提供泰樂菌素合成所需完整的結(jié)構(gòu)基因[4]，分為tylIBA區(qū)域，tylLM區(qū)域，tylG區(qū)域，tylCK區(qū)域和tylEDHFJ等5個主要區(qū)域[5]。tylJ、tylD和tylF位于tylEDHFJ區(qū)域，其中tylJ和分別編碼TDP-脫氧己糖3-差向異構(gòu)酶(TDP-deoxyhexose 3-epimerase)和TDP-脫氧己糖4-酮基還原酶(TDP-deoxyhexose 4-ketoreductase)，催化TDP-4-酮基，6-脫氧葡萄糖(TDP-4-keto,6-deoxyglucose)轉(zhuǎn)化為TDP-6-脫氧阿洛糖(TDP-6-deoxyallose)[6]。tylF編碼的大菌素-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(macrocin-O-methyltransferase,MOMT)催化大菌素轉(zhuǎn)化為泰樂菌素，是泰樂菌素生物合成中的關鍵限速酶[7]。

泰樂菌素的合成受各種結(jié)構(gòu)基因及多種相關酶調(diào)控，除主代謝通路以外，還存在著眾多的分支途徑[8]，在這個過程中會生成多種中間產(chǎn)物和副產(chǎn)物(包括很多未知成分)，構(gòu)成錯綜復雜的代謝網(wǎng)絡[9]。弗氏鏈霉菌合成泰樂菌素的代謝過程中，O-碳霉氨基糖泰樂內(nèi)酯(O-mycaminosyltylonolide,OMT)形成后有兩條代謝流，一條結(jié)合6-脫氧-D-阿洛糖糖基形成去甲基拉克亭霉素，另一條轉(zhuǎn)化為6-脫氧-D-阿洛糖泰樂菌素(demycinosyltylosin,DMT)，后者產(chǎn)生更多副產(chǎn)物，影響泰樂菌素的質(zhì)量。為削弱DMT的合成通路，可選擇增加6-脫氧-D-阿洛糖合成路徑上的兩個關鍵基因tylJ和tylD的拷貝數(shù)，以此來強化OMT到去甲基拉克亭霉素的合成轉(zhuǎn)化。大菌素甲基化轉(zhuǎn)化為泰樂菌素是泰樂菌素合成代謝中的關鍵限速步驟，增加編碼大菌素-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的tylF基因拷貝數(shù)可提升大菌素的轉(zhuǎn)化速率，在縮短發(fā)酵周期的同時提高泰樂菌素發(fā)酵水平[10]。綜合以上分析，采取倍增tylJ、tylD和tylF基因拷貝數(shù)的策略對弗氏鏈霉菌進行分子改造，能夠?qū)崿F(xiàn)強化泰樂菌素主代謝流，減少發(fā)酵過程中副產(chǎn)物生成，提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量和質(zhì)量(純度)目的，獲得具有優(yōu)良發(fā)酵性狀的泰樂菌素工程菌株。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

弗氏鏈霉菌工業(yè)菌株；E.coliDH5α，本實驗室保存；E.coliET12567(pUZ8002)，中國科學院微生物研究所楊科遷教授惠贈；pSET152質(zhì)粒，中國農(nóng)業(yè)大學宋源教授惠贈；pTYL02質(zhì)粒(pSET152衍生質(zhì)粒，含PermE)，本實驗保存。

1.2 培養(yǎng)基和主要試劑

1.2.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，氯化鈉10，pH7.0(用于大腸埃希菌培養(yǎng))；高氏一號培養(yǎng)基(購自青海海博生物科技有限公司)：用于弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)；MS培養(yǎng)基(g/L)：甘露醇20，黃豆餅粉20，MgCl3·6H2O 4，瓊脂粉15，pH7.0(用于大腸埃希菌-弗氏鏈霉菌屬間結(jié)合轉(zhuǎn)移培養(yǎng))；TSBY培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨15，大豆蛋白胨5，NaCl 5，pH7.0(用于弗氏鏈霉菌液體搖瓶發(fā)酵)。胰蛋白胨(tryptone)、酵母提取物(yeast extract)購自Oxoid公司；D-甘露醇、瓊脂粉、溶菌酶購自Sarloio公司。

1.2.2 抗生素

硫酸安普霉素和萘啶酮酸：購自Sigma公司；泰樂菌素標準品(1026U/mg)：購自國家獸藥監(jiān)察所。

1.2.3 工具酶

EcoRI、BamHI、EcoRV購自Fermentas公司。

1.3 目的基因的獲得

根據(jù)插入片段的堿基序列使用引物設計軟件Primer Premier 6分別設計PermE、tylF-tylJ、tylD的引物，其中在PermE的上下游引物兩端分別引入酶切位點EcoRI和BamHI，在tylF-tylJ的上下游引物兩端分別引入酶切位點BamHI和EcoRV，在引物tylD的上下游引物兩端引入酶切位點EcoRV，并在tylFtylJ、tylD的上游引物上分別添加了核糖體結(jié)合位點(ribosomal binding site,RBS)(表1)。分別以pTYL02質(zhì)粒DNA和弗氏鏈霉菌基因組DNA為模板，PCR擴增獲得所需目的基因片段。

1.4 表達載體的構(gòu)建

首先將PermE基因片段與載體pSET152連接，得到重組質(zhì)粒pSET152-PermE，對其進行EcoRV與BamHI雙酶切，然后將tylF-tylJ基因片段與重組質(zhì)粒pSET152-PermE連接，得到重組質(zhì)粒pSET152-PermE-tylF-tylJ，然后對其進行EcoR V單酶切。為防止發(fā)生載體自連，單酶切回收后的載體用去磷酸化酶進行處理，然后與tylD基因片段連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSET152-PermE-tylF-tylJ-tylD(圖1)。

圖1 pSET152-PermE-tylF-tylJ-tylD結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of pSET152-PermE-tylF-tylJ-tylD

重組質(zhì)粒導入感受態(tài)E.coliET12567中，涂布 LB抗性平板(含卡那霉素50μg/mL、安普霉素50μg/mL)，37℃過夜培養(yǎng)，挑選單菌落接入新鮮LB培養(yǎng)液中，37℃過夜培養(yǎng)后，提取其質(zhì)粒，使用表1中引物進行PCR驗證和酶切驗證。

1.5 表達載體的結(jié)合轉(zhuǎn)移及重組菌株的篩選

重組質(zhì)粒pSET152-PermE-tylF-tylJ-tylD轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliET12567菌株，涂布LB抗性平板(含卡那霉素50μg/mL、安普霉素50μg/mL)進行陽性轉(zhuǎn)化子篩選。篩選的陽性轉(zhuǎn)化子接入新鮮LB培養(yǎng)液中，37℃過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進行PCR驗證和酶切驗證。驗證后的重組E.coliET12567菌株與弗氏鏈霉菌的預萌發(fā)孢子液(受體菌)混合涂布在MS培養(yǎng)基平板上，通過大腸埃希菌-鏈霉菌屬間接合轉(zhuǎn)移，將pSET152-PermE-tylF-tylJ-tylD轉(zhuǎn)入弗氏鏈霉菌出發(fā)菌株內(nèi)，得到弗氏鏈霉工程菌株FJD。

1.6 弗氏鏈霉菌工程菌株驗證

隨機選取30個工程菌株單菌落，分別接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，以出發(fā)菌株為對照，28℃、200r/min搖瓶發(fā)酵7d，測定發(fā)酵液泰樂菌素效價。

工程菌株FJD接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、200r/min搖瓶發(fā)酵48h，取樣，以15%接種量接入新的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。連續(xù)傳代10代后，收集菌體，提取基因組DNA，卡那霉素和安普霉素抗性驗證工程菌株質(zhì)粒穩(wěn)定性。

1.7 工程菌株tylD、tylF、tylJ基因表達分析

以rpoB作為內(nèi)參基因，采用ΔΔCT值法[11]，對工程菌株tylD、tylF、tylJ基因相對于出發(fā)菌株對應基因的表達量進行qPCR分析。

1.8 泰樂菌素效價測定

1.8.1 標準曲線制備

稱取泰樂菌素標準品，用去離子水配制400、500、600和700μg/mL的泰樂菌素標準品溶液；分別吸取不同濃度的標準品溶液1mL于25mL容量瓶中，加入0.1mol/L HCl定容，得到12、16、20、24和28μg/mL的泰樂菌素標準液，往復顛倒搖勻靜置；290nm下測定標準液吸光度A值(0.1mol/L HCl為參比)，以標準液濃度為縱坐標，A值為橫坐標，繪制泰樂菌素標準曲線(圖2)。

1.8.2 發(fā)酵液泰樂菌素效價測定

取50mL發(fā)酵液，加入2mL 20% Al2(SO4)3溶液進行絮凝，過濾；取過濾液，根據(jù)預估效價對濾液進行適當稀釋；吸取1mL稀釋液于25mL容量瓶內(nèi)，加入0.1mol/L HCl定容，往復顛倒混勻；290nm下測A值(0.1mol/L HCl為參比)，根據(jù)標準曲線表結(jié)合稀釋倍數(shù)計算發(fā)酵液中泰樂菌素含量。

泰樂菌素效價(U/mL)=測試樣品泰樂菌素含量(μg/mL)×1.026，式中1.026為根據(jù)泰樂菌素標準品確定的效價/質(zhì)量換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達載體的構(gòu)建

重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切驗證，分別得到了與預期大小一致的tylF～tylJ片段(1434bp)和tylD(1026bp)片段，表明重組質(zhì)粒pSET152-PermE-tylF-tylJ-tylD構(gòu)建成功(圖3)。

2.2 弗氏鏈霉菌FJD工程菌株泰樂菌素發(fā)酵效價

出發(fā)菌株與30株工程菌株泰樂菌素搖瓶發(fā)酵效價見表2。結(jié)果表明，隨機選取的30株工程菌中，20株泰樂菌素發(fā)酵效價高于出發(fā)菌株，其中最高的1株發(fā)酵效價較出發(fā)菌株提高了28.1%，具有良好的生產(chǎn)應用價值。

圖2 泰樂菌素標準曲線Fig.2 Standard curve of tylosin

圖3 重組質(zhì)粒pSET152-PermE-tylF-tylJ-tylD鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pSET152-PermEtylF-tylJ-tylD

表2 30株工程菌與出發(fā)菌株搖瓶發(fā)酵效價Tab.2 Shaking flask fermentation potency of 20 engineering strains and initial strain

2.3 工程菌株的穩(wěn)定性

pSET152質(zhì)粒不含鏈霉菌復制起始位點。重組質(zhì)粒pSET152-PermE-tylF-tylJ-tylD通過大腸埃希菌-鏈霉菌屬間接合轉(zhuǎn)移至弗氏鏈霉菌后，如沒有整合到染色體上，將不能在弗氏鏈霉菌中復制，從而在菌體生長過程中丟失，工程菌也因此喪失質(zhì)粒所攜帶的卡那霉素和安普霉素抗性。 以搖瓶效價最高的1株工程菌株為供試菌株，發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)傳代10次后，工程菌在安普霉素抗性平板上生長良好，與對照的無抗生素平板上生長狀態(tài)沒有差異，表明重組質(zhì)粒已經(jīng)穩(wěn)定的整合在弗氏鏈霉菌染色體上。

2.4 工程菌株tylD、tylF、tylJ基因表達分析

將工程菌株目的基因CT值用對應的內(nèi)參基因rpoB的CT值進行標準化處理，采用ΔΔCT法計算tylD、tylF和tylJ在弗氏鏈霉菌出發(fā)菌株中的相對表達，并以出發(fā)菌株中相應目的基因的表達水平為參照，計算工程菌中tylD、tylF和tylJ的相對表達情況，結(jié)果如圖4～6。

在168h的發(fā)酵周期中，工程菌tylD的表達較出發(fā)菌株均有提高，其中24h時工程菌tylD的表達水平為出發(fā)菌株的1.26倍，72h時達到出發(fā)菌株的2倍，并一直保持較高的表達水平。

圖4 工程菌株tylD基因相對于出發(fā)菌株的表達量Fig.4 Expression of tylD gene of engineering strain relative to that of initial strain

圖5 工程菌株tylF基因相對于出發(fā)菌株的表達量Fig.5 Expression of tylF gene of engineering strain relative to that of initial strain

圖6 工程菌株tylJ基因相對于出發(fā)菌株的表達量Fig.6 Expression of tylJ gene of engineering strain relative to that of initial strain

發(fā)酵24h時tylF表達量與出發(fā)菌株一致(相對表達量為1)，發(fā)酵48h時tylF相對表達量開始升高，至96h時達到最高水平，約為出發(fā)菌株的2.18倍，并在之后發(fā)酵過程中始終保持較高的表達量。

整個發(fā)酵過程中工程菌tylJ的表達量始終高于出發(fā)菌株，其中發(fā)酵前期工程菌tylJ基因表達量顯著高于出發(fā)菌株，72h時其表達量達到出發(fā)菌株的2.3倍，其后該基因的相對表達量逐漸下降，至發(fā)酵144h時，工程菌tylJ表達量保持在出發(fā)菌株表達量的1.4倍左右(表3)。

qPCR分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入的tylD、tylF和tylJ基因在弗氏鏈霉菌中均得到有效的表達，工程菌中上述3個基因的表達水平均高于出發(fā)菌株。

3 討論

增加合成代謝途徑中關鍵酶基因的拷貝數(shù)是鏈霉菌代謝工程育種的有效手段[12]。范亮等[13]構(gòu)建了具有雙拷貝tylF基因的泰樂菌素基因工程菌，其泰樂菌素搖瓶發(fā)酵效價較出發(fā)菌提高了32.7%。由于泰樂菌素合成代謝網(wǎng)絡的復雜性，增加tylF的拷貝數(shù)能降低發(fā)酵產(chǎn)物中中間代謝產(chǎn)物大菌素的含量，提高泰樂菌素的產(chǎn)量，但無法降低DMT等發(fā)酵副產(chǎn)物(雜質(zhì))的積累。本研究針對泰樂菌素生產(chǎn)中組分轉(zhuǎn)化及主要副產(chǎn)物產(chǎn)生情況，在對弗氏鏈霉菌泰樂菌素代謝調(diào)控網(wǎng)絡分析的基礎上，選擇碳霉糖合成路徑上的兩個關鍵基因tylD與tylJ以及泰樂菌素合成途徑中關鍵的限速酶基因tylF，構(gòu)建具有雙拷貝tylD、tylJ和tylF的弗氏鏈霉菌工程菌株，以達到調(diào)整并強化泰樂菌素的主合成代謝通路，提高抗生素產(chǎn)量，減少DMT等發(fā)酵副產(chǎn)物的目的。

表3 發(fā)酵過程中工程菌株tylD、tylF和tylJ基因表達特性Tab.3 Expression characteristics of tylD,tylF and tylJ in engineering strains during fermentation

在工業(yè)生產(chǎn)鏈霉菌工程菌株的構(gòu)建中，整合型質(zhì)粒的運用以及最適啟動子和核糖體結(jié)合位點的調(diào)節(jié)對鏈霉菌合成目的產(chǎn)物有極大的促進作用[14-17]。本研究以弗氏鏈霉菌基因組DNA為模版，克隆得到目的基因tylD和tylF-tylJ；使用整合型表達載體pSET152和組成型強啟動子PermE，保證發(fā)酵過程中工程菌的穩(wěn)定性，強化多拷貝的tylF、tylJ以及tylD的表達；tylF、tylJ采用自身RBS序列，tylD自身的RBS位于tylHII內(nèi)，其序列經(jīng)分析不符合最佳的RBS堿基排列，而tylHII的RBS序列滿足理想RBS堿基排列的條件，因此將tylHII的RBS序列與tylD的CDS序列銜接，調(diào)轉(zhuǎn)插入整合型質(zhì)粒中。采用上述構(gòu)建策略，最終得到一株弗氏鏈霉菌工程菌株，其發(fā)酵效價較出發(fā)菌株提高了28.1%，經(jīng)熒光定量PCR檢測，該菌株發(fā)酵過程中tylF、tylJ、tylD表達量較出發(fā)菌株有明顯提高，可望作為優(yōu)良生產(chǎn)菌種用于泰樂菌素的發(fā)酵生產(chǎn)。