劉麗云，郝 帥，孫 暉

弗氏枸櫞酸桿菌CF74的FliS蛋白功能研究

劉麗云1，郝 帥2，孫 暉1

目的 研究弗氏枸櫞酸桿菌CF74的FliS蛋白功能。方法 構(gòu)建弗氏枸櫞酸桿菌CF74fliS的精確缺失突變株(CF74ΔfliS)及其互補菌株(CF74pfliS)，并進行細菌游動性實驗，檢測它們對THP1細胞的粘附性和細胞毒性的作用。并用Western blotting方法檢測FliC蛋白在培養(yǎng)上清中的分泌。結(jié)果 弗氏枸櫞酸桿菌CF74ΔfliS突變株沒有游動性，而回補株CF74pfliS回補了游動性。而且，CF74ΔfliS突變株降低對THP1細胞的粘附和細胞毒作用，其回補株恢復了粘附性和細胞毒性。此外，CF74ΔfliS突變株降低FliC蛋白在培養(yǎng)上清中的分泌。結(jié)論 FliS蛋白影響弗氏枸櫞酸桿菌CF74的游動性，并參與其對宿主細胞的粘附和細胞毒作用。

弗氏枸櫞酸桿菌；CF74ΔfliS；游動性；粘附性；細胞毒性

弗氏枸櫞酸桿菌屬于枸櫞酸桿菌屬、腸桿菌科、革蘭氏陰性桿菌、兼性厭氧、周身鞭毛、菌毛、無芽胞和無莢膜。弗氏枸櫞酸桿菌在自然界廣泛存在，是人類和動物腸道的正常菌群，屬于條件致病菌。弗氏枸櫞酸桿菌可以引起包括腹瀉在內(nèi)的多種感染性疾病如：尿道感染、腦膜炎、膿毒癥以及醫(yī)院獲得性感染等[1-3]。弗氏枸櫞酸桿菌可以通過獲得毒力因子變成致病菌，引起腹瀉等感染，Pereira AL等報道聚集性粘附的弗氏枸櫞酸桿菌具有強的細胞毒性[4-5]。

鞭毛作為細菌運動的重要器官，參與細菌的粘附，也是重要的毒力決定因子，參與了一系列的致病過程，鞭毛所提供的動力可能是細菌侵入細胞的重要因素；鞭毛蛋白可以作為粘附素，決定了細菌在細胞表面的吸附，以及其后的侵襲與定植過程；鞭毛蛋白可以引起宿主細胞的炎性反應；在病原菌中，鞭毛的組裝系統(tǒng)，類似于毒力因子的分泌系統(tǒng)，在細菌內(nèi)外膜之間存在復雜的調(diào)控機制，可以介導一系列胞外毒素的分泌，其中包括磷脂酶YplA的分泌[6-12]。FliS作為鞭毛蛋白的胞漿輸出伴侶蛋白，可以防止未成熟的鞭毛單體過早的在胞漿中聚合。FliS通過與FliC C端螺旋結(jié)構(gòu)域結(jié)合，幫助鞭毛蛋白亞單位之間聚合的穩(wěn)定性[13]。

我們分離到一株弗氏枸櫞酸桿菌CF74，該菌具有強的粘附性和細胞毒性，并且具有完整的鞭毛系統(tǒng)[4]。我們推測鞭毛蛋白參與了這一系列的致病過程。為了探索FliS在弗氏枸櫞酸桿菌CF74致病中的作用，本研究構(gòu)建了fliS的精確缺失突變株(CF74ΔfliS)及其互補菌株(CF74pliS)，來研究弗氏枸櫞酸桿菌CF74 中FliS在游動性、粘附性和細胞毒性的作用。從而了解FliS在弗氏枸櫞酸桿菌致病性中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物 見表1。

表1 供試菌株、質(zhì)粒及引物

1.1.2 主要試劑和儀器 實驗所用Taq DNA聚合酶、T4連接酶、高保真酶、dNTPs、DNA Marker為TaKaRa公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒為QIAGEN生產(chǎn)；電泳儀、凝膠成像儀等為Bio—Rad公司產(chǎn)品；Cyto-Tox 96 Cytoxicity Kit購自美國 Promega公司；1640培養(yǎng)基和小牛血清購自GIBCO公司；CO2培養(yǎng)箱為Thermo Forma Steri-Cycle。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 弗氏枸櫞酸桿菌的常規(guī)培養(yǎng)條件為：LB液體培養(yǎng)基(1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，調(diào)節(jié)pH至7.4)及LBA固體平板(LB液體培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂)，37 ℃培養(yǎng)。培養(yǎng)基中所需鏈霉素(Str)和氨芐青霉素(Amp)濃度均為100 μg/mL。10%蔗糖LBA平板用于弗氏枸櫞酸桿菌突變株的篩選。含有0.3%瓊脂的LBA平板用于弗氏枸櫞酸桿菌游動性實驗。

1.2.2 弗氏枸櫞酸桿菌CF74目的基因缺失突變株及回補株的構(gòu)建 通過融合PCR技術(shù)將弗氏枸櫞酸桿菌CF74的fliS基因上下游同源臂融合得到缺失fliS基因編碼區(qū)的DNA片段，并將此PCR產(chǎn)物克隆到自殺載體pWM91上，通過DNA測序得到片段正確的重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌SM10λpir，再接合轉(zhuǎn)移至弗氏枸櫞酸桿菌CF74中，經(jīng)pWM91質(zhì)粒上sacB基因利用蔗糖平板進行反向篩選并通過PCR進行鑒定，得到fliS缺失突變株。PCR擴增fliS基因全序列的DNA片段408 bp，將目的片段克隆到載體pBAD24中，通過DNA測序得到片段正確的重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒經(jīng)電轉(zhuǎn)化導入弗氏枸櫞酸桿菌CF74fliS突變株中，通過PCR進行鑒定，得到回補株CF74ΔfliS+pBAD24-fliS(簡稱CF74pfliS)。

1.2.3 弗氏枸櫞酸桿菌游動性檢測 將弗氏枸櫞酸桿菌CF74野生株、CF74△fliS和CF74pfliS接種于LBA中，37 ℃培養(yǎng)過夜。次日，用滅菌的牙簽挑單克隆，刺人含0.3%瓊脂的LBA平板中，30 ℃靜置培養(yǎng)16 h后，我們對游動的菌圈直徑進行測量，并且除以平皿的直徑，獲得相對的游動面積百分比，用來比較菌株的游動能力。所有菌株設立3個平行。并且進行至少2次重復實驗。

1.2.4 弗氏枸櫞酸桿菌粘附和細胞毒實驗 單核細胞株THP-1細胞(TIB-202TM，ATCC)接種于24孔細胞板，培養(yǎng)液為1640(含5%小牛血清)，培養(yǎng)過夜經(jīng)過分化為巨噬細胞。細菌感染細胞的MOI為100∶1，在37 ℃ ，5% CO2的溫箱中共同孵育3 h后，經(jīng)過PBS清洗24孔板，細胞被含有0.25% Triton X-100的PBS裂解液中裂解，然后倍比稀釋裂解產(chǎn)物，涂LBA平板，在37 ℃的溫箱培養(yǎng)過夜。次日進行菌落計數(shù)。每個樣品有3個平行，并且進行至少2次重復實驗。

LDH實驗是按照Cytotox96 kit (Promega)操作說明進行的。具體步驟如下：THP-1細胞接種于96孔板，培養(yǎng)液為1640含5%FBS，培養(yǎng)過夜，經(jīng)過分化為巨噬細胞；次日，細菌感染細胞的MOI為100∶1，在37 ℃ ，5% CO2的溫箱中共同孵育6 h。離心，移取每孔上清50 μL 至另一96 孔板，并在每孔加入50 μL LDH 反應液，避光反應30 min(室溫15～25 ℃)；每孔加入50 μL LDH 終止液，酶標儀測吸光度，測量波長為490 nm，參考波長為630 nm。低對照組為不加細菌的細胞培養(yǎng)液，高對照組為細胞被加入lysis完全裂解(promege 試劑盒帶，在顯色前40 min加入 1Xlysis)。細胞毒性%=(OD樣品-OD低對照)/(OD高對照-OD低對照)×100%。每個樣品有3個平行，并且進行至少2次重復實驗

1.2.5 上清蛋白準備和Western blot分析 收集CF74野生株和CF74△fliS缺失株搖至OD600為1.0的上清培養(yǎng)基，用0.22 μm濾膜(Millipore)過濾除菌，加入10% (v/v) TCA( Sigma-Aldrich)，在4 ℃過夜沉淀蛋白。次日，經(jīng)過高速離心，冰丙酮洗劑，干燥上清蛋白。定量蛋白后，用蛋白上樣buffer溶解上清蛋白進行Western blot分析，一抗為兔抗FliC抗體 (Abzome Co，Ltd China, 1∶5 000) 和二抗HRP標記的羊抗兔抗體(MBL, 1∶10 000)，ECL發(fā)光顯色。

1.2.6 統(tǒng)計學分析 SPSS軟件包版本為13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)進行所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析。非參數(shù)檢驗(Mann-WhitneyU-test)用于組間的差異比較分析，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 弗氏枸櫞酸桿菌CF74△fliS缺失株和CF74pfliS回補株的PCR驗證 用fliS全長引物分別擴增CF74野生株、CF74△fliS缺失株和回補株CF74pfliS的基因組DNA。如圖1所示，缺失株沒有帶，野生株和回補株在大約400 bp的位置有一條特異性的帶。結(jié)果表明構(gòu)建的fliS缺失株和回補株是成功的。

fliS mutant was checked by amplifying of full sequence of fliS.

2.2 弗氏枸櫞酸桿菌CF74ΔfliS缺失株沒有游動性 為了研究FliS是否影響細菌的游動性，我們對CF74野生株、CF74ΔfliS缺失株和回補株 F74pfliS進行了游動性實驗分析。如圖 2A所示，CF74ΔfliS沒有游動性，CF74pfliS和CF74野生株具有相類似的游動性。CF74野生株的相對游動面積為57.7%，CF74ΔfliS的相對游動面積為0，CF74pfliS的相對游動面積62.3%。CF74ΔfliS游動明顯低于CF74野生株和回補株CF74pfliS(P<0.01) 圖 2B。上述結(jié)果表明FliS影響弗氏枸櫞酸桿菌的游動性。

A: Representative images of swimming motility ofC.freundiiCF74, CF74ΔfliSand CF74pfliS;

B: Quantification of the inhibition of swimming motility halo by CF74ΔfliSmutant in swim plates.

The y-axis represents relative swimming motility area, the x-axis represents different strains.

Statistical significance was determined by Mann-Whitney U-test between CF74ΔfliSand CF74 or CF74pfliS. **:P<0.01.

圖2FliS對游動性的影響

Fig.2 Effect of theFliSon motility

2.3 弗氏枸櫞酸桿菌CF74 FliS蛋白參與對THP-1細胞的粘附和細胞毒作用 通過比較CF74野生株、CF74ΔfliS和 F74pfliS對THP-1 細胞的粘附差異。我們發(fā)現(xiàn)CF74ΔfliS對THP-1細胞的粘附能力明顯低于CF74野生株(P<0.01)，而回補株CF74pfliS回補了對THP-1細胞的粘附能力(圖3 A)。結(jié)果表明FliS參與弗氏枸櫞酸桿菌CF74對宿主細胞的粘附作用。

進一步研究FliS對弗氏枸櫞酸桿菌CF74的細胞毒作用。我們用CF74野生株、 CF74ΔfliS和 F74pfliS分別感染THP-1細胞6 h，通過測定它們作用的THP-1 細胞LDH的釋放情況分析發(fā)現(xiàn)，CF74野生株感染的THP-1細胞的LDH釋放率為25%，缺失株CF74ΔfliS的LDH釋放率為10%，回補株CF74pfliS的LDH釋放率為15%。CF74ΔfliS感染THP-1細胞的LDH釋放率明顯低于CF74野生株(P<0.01)，回補株CF74pfliS明顯補回了感染THP-1細胞的LDH釋放率(圖3B)。結(jié)果表明FliS參與弗氏枸櫞酸桿菌CF74對宿主細胞的細胞毒作用。

A: Effects of FliS on CF74 adherence to THP-1 cell (MOI, 100). Performance of CF74ΔfliSwas compared statistically to the wild type CF74. **:P<0.01.

B: Lactate dehydrogenase (LDH) released were measured from THP-1 cells after exposure toC.freundiiCF74, CF74△fliSand CF74pfliSat 6 hours using optical density reading at A490/630 (vertical axis).

Significant differences between wild type and CF74△fliSmutant were shown with **:P<0.01.

圖3 CF74的FliS對THP-1細胞的粘附和細胞毒的影響

Fig.3 Effect of the FliS on adhesion and cytotoxicity to THP-1 cell

2.4 弗氏枸櫞酸桿菌CF74 FliS蛋白影響FliC蛋白的分泌 通過檢測CF74野生株和CF74△fliS缺失株對FliC蛋白分泌的影響，發(fā)現(xiàn)CF74△fliS缺失株中的FliC蛋白的分泌降低(圖4)。

Immunoblot analysis of FliC protein in the culture supernatant (Sup) prepared fromC.freundiiCF74 and CF74△fliSgrown in LB.

The position of a reactive band corresponding to FliC was detected with anti-FliC antibody.

圖4 FliS影響鞭毛蛋白FliC的分泌

Fig.4 Effect of FliS on the secretion of flagellar protein FliC

3 討 論

細菌的游動性依賴于鞭毛系統(tǒng)。弗氏枸櫞酸桿菌具有完整的鞭毛系統(tǒng)，鞭毛系統(tǒng)基因：flhD, motA 和 motB突變可以引起弗氏枸櫞酸桿菌的游動性的缺陷[14]。由于flhDC操縱子控制鞭毛生物合成，所以flhD缺失突變導致無鞭毛產(chǎn)生[14]。此外，motA 和 motB可以形成轉(zhuǎn)移質(zhì)子動力來驅(qū)動鞭毛的質(zhì)子通道。雖然motA 和 motB缺失突變株可以產(chǎn)生鞭毛，但是是無功能的鞭毛[14]。上述數(shù)據(jù)表明弗氏枸櫞酸桿菌的游動性依賴于鞭毛系統(tǒng)。本研究發(fā)現(xiàn)FliS作為鞭毛蛋白的胞漿輸出伴侶蛋白,它的突變株可以引起弗氏枸櫞酸桿菌CF74失去游動性。Capdevila S等也已經(jīng)報道在熒光假單胞桿菌中，缺失突變fliS可以引起該菌無游動性[15]。這表明FliS蛋白影響細菌的游動性。

FliS 作為鞭毛蛋白特異的胞漿伴侶蛋白，幫助FliC分泌和有助于鞭毛蛋白亞基在聚合過程中的穩(wěn)定性[13，15]。fliS缺失突變株可以引起多數(shù)FliC蛋白堆積在細胞質(zhì)形成包涵體而不能分泌出去；也可以導致FliC錯誤聚合或不能形成穩(wěn)定的聚合體，從而影響正常的鞭毛絲的形成，電鏡下表現(xiàn)為鞭毛的又短又細[15]。本研究中發(fā)現(xiàn)，弗氏枸櫞酸桿菌CF74fliS缺失突變株可以引起FliC蛋白分泌的減少。此外，弗氏枸櫞酸桿菌CF74fliS缺失突變株可以導致巨噬細胞的粘附性減弱和細胞毒性下降。已有文獻報道，F(xiàn)liC參與病原菌的粘附和細胞毒作用[16]。上述結(jié)果表明FliS通過調(diào)控FliC分泌，而間接的影響對宿主細胞的粘附和細胞毒作用。

病原菌鞭毛系統(tǒng)介導的游動性有利于增加病原菌與宿主細胞接觸的機率，進而促進其粘附和定植，從而引起對宿主細胞的感染。所以游動性是細菌鞭毛系統(tǒng)參與致病性的重要因素之一。已有文獻報道，鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)對兔盲腸的定植[17]，霍亂弧菌(Vibriocholerae)對小腸粘膜的定植[18]以及假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)引起的燙傷感染的模型[19]，都依賴于細菌的游動性。本研究中，fliS缺失突變株沒有游動性，從而導致該菌對巨噬細胞的粘附性和細胞毒性的減弱。所以游動性是病原菌引起感染的重要原因之一。

總之，F(xiàn)liS蛋白影響弗氏枸櫞酸桿菌CF74的游動性，并參與其對宿主細胞的粘附和細胞毒作用。

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FliS function inC.freundiistrain CF74

LIU Li-yun1,HAO Shuai2,SUN Hui1

(1.StateKeyLaboratoryforCommunicableDiseasePreventionandControl,InstituteforCommunicableDiseasePreventionandControl,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China; 2.KeyLaboratoryofCellProliferationandRegulationBiologyMinistryofEducation,BeijingNormalUniversity,UniversitiesConfederatedInstituteofProteomics,Beijing100875,China)

FliS as an export chaperone contributes to stabilization of flagellin subunit interactions during polymerisation. ThefliSmutant leads to most of the FliC protein being accumulated in inclusion bodies formed inside the cell cytoplasm.C.freundiistrain CF74 has a complete flagellar system. To analyze FliS function in CF74, we constructed deletion mutant offliSand complementation in CF74 and analysed its effects on the swimming motility, adherence and cytotoxicity. CF74ΔfliSmutant was found to be no motile, and motility was restored by CF74pfliS. Moreover, CF74ΔfliSmutant was defective in adhesion and cytotoxicity to THP1 cells and restored upon complementation. Significant differences between wild type and CF74△fliSmutant were shown withP<0.01. The band of FliC in CF74ΔfliSmutant was weak by immunoblot analysis of FliC protein in the culture supernatant prepared from CF74 and CF74ΔfliSmutant grown in LB. These results suggested that the FliS in CF74 enhances motility, involves in the adherence to host cells, and induces cytotoxicity to host cells.

C.freundii; CF74ΔfliS; motility; adhesion; cytotoxicity

國家自然基金項目(No.81301401)；傳染病預防控制國家重點實驗室面上項目(No.2011SKLID209)聯(lián)合資助

1.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，傳染病預防控制國家重點實驗室，北京 102206； 2.北京師范大學細胞增殖與調(diào)控教育部重點實驗室，高等學校蛋白質(zhì)組學研究院，北京 100875; Email:liuliyun@icdc.cn

Supported by grants from the National Natural Science Foundation of China (No. 81301401) and the Project of State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control (No. 2011SKLID209)

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.06.003

R378.2

A

1002-2694(2015)06-0506-05

2014-10-08；

2014-11-28