古廣武，董辰韻，鐘偉強，張安強，林雅鈴

（1.華南農(nóng)業(yè)大學材料與能源學院，廣東 廣州 510642；2.華南理工大學材料科學與工程學院，廣東 廣州 510641）

【研究意義】由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的水稻紋枯病（rice sheath blight）是我國水稻三大病害之一［1］。近年來，由于矮稈品種的推廣和栽培水平的提高，水稻紋枯病的發(fā)生呈加重趨勢［2］。目前，水稻紋枯病的防治主要以使用井岡霉素為主，但從多年使用情況來看，對水稻紋枯病的防效僅50%～60%，且持效期短，需要頻繁施藥，由此帶來大量的勞力用工成本及抗藥性問題［3-4］。因此，研究開發(fā)新的防治藥劑對于水稻的安全生產(chǎn)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】季銨鹽是一類廣譜殺菌劑，因其制備方法簡單、生產(chǎn)成本較低、物理化學性質(zhì)較好，并且抗菌效果較好，被廣泛應用于醫(yī)學、食品、化妝品以及工業(yè)污水處理等方面［5］。季銨鹽的抑菌機理主要表現(xiàn)在以下兩方面：一方面季銨鹽本身的陽離子通過靜電作用吸附在菌體表面，穿過細胞壁到達細胞膜［6］，當聚集的季銨鹽達到一定濃度，其疏水鏈會嵌入細胞膜中形成膠束體，破壞細胞結(jié)構(gòu)，進而造成細胞內(nèi)容物流出，導致細胞死亡［7］；另一方面，季銨鹽通過與細胞膜上的蛋白結(jié)合或者破壞細胞膜上的酶，進而破壞細胞膜，從而達到殺死細胞的作用［5］。小分子季銨鹽是指一類R基鏈較短的，且分子量小于500 g/mol，具有季銨鹽結(jié)構(gòu)的有機物。雖然小分子季銨鹽對于微生物具有良好的抑菌效果，但是小分子季銨鹽具有易揮發(fā)、穩(wěn)定性差及環(huán)境毒性大的缺點［8］。大分子季銨鹽是指分子量大于200 g/mol的具有季銨鹽結(jié)構(gòu)的聚合物，也有一些天然高分子材料的改性聚合物［6］。相較于小分子季銨鹽，聚硅氧烷季銨鹽具有穩(wěn)定性好、環(huán)境毒性小、刺激性小、兩親性強及吸附性能更好等優(yōu)點［9-10］。本課題前期研究表明大分子季銨鹽的分子結(jié)構(gòu)對其抑菌活性有較大影響，前期合成的聚二甲基硅氧烷接枝季銨鹽（PDMS-g-BC）和聚丙烯酰胺季銨鹽（PQD-BC）兩種大分子季銨鹽具有引起菌體細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化的功能，這是小分子季銨鹽不具備的［11］。聚硅氧烷-聚丙烯酸酯季銨鹽嵌段共聚物具有不同于PDMS-g-BC和PQD-BC的結(jié)構(gòu)，有必要深入探究其對R.solani細胞膜的影響?！颈狙芯壳腥朦c】通過對細胞膜的完整性、滲透性以及細胞膜的脂質(zhì)過氧化反應來表征聚硅氧烷-聚丙烯酸酯季銨鹽嵌段共聚物對水稻紋枯病菌細胞膜的影響，旨在為揭示兩親性大分子季銨鹽防治水稻紋枯病菌的作用機制提供科學依據(jù)。【擬解決的關(guān)鍵問題】聚硅氧烷-聚丙烯酸酯季銨鹽嵌段共聚物不僅具有小分子季銨鹽的良好抑菌效果，還具有區(qū)別于小分子季銨鹽對于菌體細胞膜的抑菌機理。因此，可以通過研究其對菌體細胞膜的完整性、滲透性與功能性的影響，探索聚硅氧烷-聚丙烯酸酯季銨鹽嵌段共聚物在水稻紋枯病菌的作用機理及其在防治水稻紋枯病中的實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

立枯絲核菌Rhizoctonia solani Kühn AG-1(IA)，由華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院植物病理學系真菌實驗室惠贈。

PDMS-b-(PDMAEMA-BC)的化學名為聚二甲基硅氧烷-b-聚(二甲氨基丙基甲基丙烯酸酯-芐基氯化銨)嵌段共聚物，是一類新型兩親性大分子季銨鹽（Six-Q5，x = 0、2、5），按文獻［12］采用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合方法（ATRP）合成。Si0-Q5、Si2-Q5與Si5-Q5的PDMS嵌段長度分別為0、2 × 103、5 × 103ku，PDMAEMA-BC 嵌段的長度為 5 × 103ku。

培養(yǎng)基與主要試劑：PD培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基按文獻［13］的方法配置。牛血清白蛋白（BSA）：生工生物工程有限公司；碘化丙啶（PI染液）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；考馬斯亮藍G-250：廣州威佳科技有限公司；蒽酮：分析純，上海潤捷化學試劑有限公司；硫酸：分析純，廣州化學試劑廠；三氯乙酸（TCA）：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

主要儀器：熒光顯微鏡：型號Eclipse 80i，日本Nikon公司；紫外可見分光光度計：型號UV2300，上海天美科學儀器有限公司；電導率儀：型號DDS-11A，上海虹益儀器儀表有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 Six-Q5對R.solani細胞膜完整性的影響表征 （1）菌種活化：從斜面保存的試管中挑取R.solani菌絲，接種于PDA，于28℃培養(yǎng)箱培育48 h；用7 mm打孔器從培育2 d后的R.solani菌落邊緣打取菌碟，接種于新的PDA平板培育48 h。

（2）菌液培養(yǎng)：從活化后的R.solani菌落邊緣打取菌碟，將3塊打取好的菌碟投入到45 mL PD培養(yǎng)基中，在28℃下以120 r/min搖床中孵育48 h，可得菌液。

（3）菌種培養(yǎng)：在超凈工作臺中配制不同濃度季銨鹽溶液5 mL，之后加入45 mL菌液中，使其終濃度為0.5×IC50、IC50、IC90，在28℃培養(yǎng)箱孵育2 d。

挑取適量孵育后的菌絲于勻漿器，加入1 mL PBS緩沖液勻漿，取適量于血球計數(shù)板計數(shù)，制成菌懸液。取1 mL菌懸液于1.5 mL離心管中，10 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mL PBS重懸，10 000 r/min離心5 min，棄上清，重復2次，洗去培養(yǎng)液備用。加入100 μL PI染液（10 μg/mL），于28℃培養(yǎng)箱中遮光培養(yǎng)1 h，10 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 mL PBS重懸，10 000 r/min離心5 min，棄上清，重復2次，洗去PI染液備用。取5 μL試樣于載玻片，蓋上蓋玻片制成臨時玻片，于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.2 Six-Q5對R.solani細胞膜滲透性的影響表征 根據(jù)1.2.1試驗方法獲得菌液，孵育48 h后抽濾得到菌絲備用，稱取季銨鹽，用蒸餾水定容至50 mL，使其終濃度為0.5×IC50、IC50、IC90。

（1）蛋白質(zhì)含量測定：稱取10 mg牛血清白蛋白標準品（BSA）定容于20 mL蒸餾水，得0.5 mg/mL對照品溶液，分別取0.00、0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18、0.21 mL，分別加入1 mL蒸餾水混勻；以1 mL蒸餾水為空白對照，加入5 mL考馬斯亮藍染色，靜置5 min后，在波長595 nm處測定蛋白質(zhì)對照品的吸光度A595。用吸光度對濃度進行線性回歸，求取標準曲線［14］。稱取0.2 g菌絲置于配置好的各濃度季銨鹽溶液，設(shè)定兩組空白對照：用等量滅菌水代替季銨鹽以及不含菌絲的各濃度季銨鹽。每個處理3次重復，于28℃、120 r/min孵育，在0、2、4、6、8、24 h分別測定溶液中蛋白質(zhì)含量，根據(jù)標準曲線計算含量，并且按照式（1）換算成單位質(zhì)量菌絲的滲透量。

（2）碳水化合物含量測定：稱取10 mg葡萄糖標準品定容于10 mL得到1 mg/mL對照品溶液，分別取 0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1 mL 加水至1 mL，加入5 mL蒽酮-硫酸溶液，沸水浴15 min，冷水浴10 min，在620 nm處測定吸光度A620。用吸光度對濃度進行線性回歸，求標準曲線［15］。稱取0.2 g菌絲于各濃度季銨鹽溶液，對照組設(shè)定同蛋白質(zhì)含量測定實驗。每個處理3次重復，于28℃、120 r/min孵育，在0、2、4、6、8、24 h分別測定溶液中葡萄糖含量變化，根據(jù)標準曲線計算含量，并且按照式（1）換算成單位質(zhì)量菌絲的滲透量。

（3）電解質(zhì)含量測定：稱取0.2 g菌絲于各濃度季銨鹽溶液，對照組設(shè)定同蛋白質(zhì)含量測定實驗。每個處理3次重復，于28℃、120 r/min孵育，使用DDS-11A型電導率儀在0、0.5、1、2、3、6、9、24 h分別測定溶液中電導率的變化［11］。

1.2.3 Six-Q5對R.solani細胞膜脂質(zhì)過氧化的影響表征 根據(jù)1.2.1試驗方法獲得菌液，孵育48 h后抽濾得到菌絲備用，稱取季銨鹽，用蒸餾水定容至50 mL，使其終濃度為0.5×IC50、IC50、IC90。稱取0.2 g菌絲于不同濃度季銨鹽溶液，對照組設(shè)定同蛋白質(zhì)含量測定，每個處理3次重復，于28℃、120 r/min孵育24 h后抽濾，分別收集菌絲和培養(yǎng)液。

稱取0.2 g菌絲，加入10%三氯乙酸（TCA）2 mL和少量石英砂，冰浴下研磨充分，加10 %三氯乙酸6 mL進一步研磨，取勻漿于高速冷凍離心機10 000 r/min、4℃下離心10 min得到上清液為樣品提取液。用丙二醛（MDA）試劑盒測定菌絲（樣品提取液）和培養(yǎng)液MDA含量，采用式（2）求MDA含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 Six-Q5對R.solani細胞膜完整性的影響

為了研究3種不同結(jié)構(gòu)的Six-Q5對R.solani細胞膜完整性的影響，本試驗運用PI熒光染料，分別對經(jīng)過3種具有不同嵌段結(jié)構(gòu)的Six-Q5處理的水稻紋枯病菌菌絲染色，隨后在535 nm綠色激發(fā)光下觀察菌絲發(fā)射熒光的情況，并與其在自然光（白光）照射下的明場圖片對比。由于PI染料分子無法通過完整的細胞膜，卻可通過受損的細胞膜進入細胞與遺傳物質(zhì)結(jié)合［16］。因此，可用PI染色法來檢測Six-Q5系列兩親性大分子季銨鹽在3種濃度下對水稻紋枯病菌菌絲細胞膜完整性的影響。

圖1 Six-Q5對R.solani菌絲細胞膜完整性的影響Fig.1 Effect of Six-Q5 on cell membrane integrity of R.solani mycelium

圖1 為3種Six-Q5對R.solani菌絲細胞膜完整性影響情況，圖中白光為亮場下觀察到的菌絲形態(tài)，熒光為在綠色激發(fā)光下觀察到的菌絲形態(tài)，其中菌絲內(nèi)部若能觀察到紅點，表示菌絲細胞膜完整性被破壞，PI染料與細胞膜內(nèi)核酸結(jié)合。從圖1可以看出，隨著Six-Q5處理濃度的增大，R.solani菌絲內(nèi)熒光從無到有，且熒光強度逐漸增強。其中，不含PDMS嵌段的Six-Q5（即Si0-Q5）對R.solani菌絲細胞膜完整性的影響不大，圖中不能看到明顯紅色熒光亮點；而含較短PDMS嵌段的Six-Q5（即Si2-Q5）在高濃度（IC90）處理下，能看到明顯紅色熒光亮斑，說明在高濃度（IC90）處理下，R.solani菌絲細胞膜完整性被破壞，PI染料進入菌絲內(nèi)部，與菌絲內(nèi)部核酸結(jié)合；含較長PDMS嵌段的Six-Q5（即Si5-Q5）處理后，低濃度（0.5×IC50）處理下就可觀察到紅色熒光亮斑。表明隨著Six-Q5中PDMS嵌段長度的增加，吸附性較強的兩親性大分子季銨鹽更易吸附于菌絲表面，對菌絲細胞膜完整性的破壞作用更強。

2.2 Six-Q5對R.solani細胞膜滲透性的影響

本試驗通過考馬斯亮藍染色檢測蛋白質(zhì)含量變化，蒽酮-硫酸比色法檢測碳水化合物的含量變化，以及采用電導率儀檢測電解質(zhì)含量的變化；由于細胞膜破裂后胞內(nèi)外滲透液壓失衡會導致細胞內(nèi)容物漏出到培養(yǎng)液中［13］。因此，可通過檢測培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)、碳水化合物及電解質(zhì)含量變化判斷細胞膜滲透性是否被破壞［17］，以及Six-Q5對R.solani細胞膜的破壞程度。

蛋白質(zhì)測定標準曲線的回歸方程為y = 6.53x+ 0.0114，r2= 0.999，表明在 0.00～0.15 mg/mL 范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度（x）與吸光度（y）呈良好的線性關(guān)系。碳水化合物測定標準曲線的回歸方程為y = 2.61x - 0.00684，r2= 0.999，表明在0.0～0.6 mg/mL范圍內(nèi)，碳水化合物濃度（x）與吸光度（y）呈良好的線性關(guān)系。

經(jīng)過3種Six-Q5處理的R.solani培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)、碳水化合物及電解質(zhì)含量變化分別見圖2、圖3和圖4。由圖2、圖3、圖4可知，3種Six-Q5都能對R.solani細胞膜滲透性產(chǎn)生影響，導致細胞內(nèi)容物發(fā)生外泄，對照組及處理組的蛋白質(zhì)、碳水化合物和電解質(zhì)含量均隨著時間的延長而逐漸上升，表明即使在沒有季銨鹽處理的情況下，正常的菌絲細胞由于滲透壓平衡也會釋放蛋白質(zhì)、碳水化合物和電解質(zhì)。但經(jīng)過3種Six-Q5處理后，蛋白質(zhì)、碳水化合物和電解質(zhì)的含量隨著時間增加得更多，表明經(jīng)過Six-Q5處理后，菌絲細胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、碳水化合物和電解質(zhì)滲漏速度更快。

圖2 Six-Q5處理對R.solani培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)含量的影響Fig.2 Effect of Six-Q5 treatment on protein content in R.solani culture solution

圖3 Six-Q5處理對R.solani培養(yǎng)液中碳水化合物含量的影響Fig.3 Effect of Six-Q5 treatment on carbohydrate content in R.solani culture solution

圖4 Six-Q5處理對R.solani培養(yǎng)液中電解質(zhì)含量的影響Fig.4 Effect of Six-Q5 treatment on electrolyte content in R.solani culture solution

由圖2可知，經(jīng)過3種Six-Q5處理的培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)含量各不相同。實驗結(jié)果表明，隨著PDMS嵌段的增長，培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)含量越高；并且經(jīng)過Si0-Q5與Si2-Q5處理在8～24 h之間的增幅較小，而經(jīng)過Si5-Q5處理在8 ～24 h這段時間內(nèi)蛋白質(zhì)的含量還有較明顯提高。由圖3可知，在低濃度處理下，碳水化合物含量在3種Six-Q5之間無顯著差異；而隨著濃度的提高與PDMS嵌段的增長，其培養(yǎng)液中碳水化合物含量有了一定差異，且嵌段較長的含量更高。如圖2和圖3所示，各處理在8 h后的蛋白質(zhì)含量與碳水化合物含量與前6 h出現(xiàn)較顯著差異，表明在8 h蛋白質(zhì)及碳水化合物的滲透已經(jīng)達到最大值，并且隨著濃度的增加釋放量逐漸增加。在處理8 h后對比各濃度的不同藥物，發(fā)現(xiàn)在較高濃度（IC50和IC90）下隨著嵌段長度的增加，外泄的蛋白質(zhì)含量也有所增加，而碳水化合物之間則無明顯差異。表著隨著PDMS嵌段的增長、濃度的增加以及在一定時間范圍內(nèi)，Six-Q5對菌絲細胞膜的破壞程度增大，且Si5-Q5的破壞效果更持久、更有效。

如圖4所示，隨著處理時間逐漸增加，各處理菌絲培養(yǎng)液的電導率均有一定程度的增加，而對照變化不大。Six-Q5處理前期（0～1 h）電導率變化不明顯，此后電導率隨著處理時間逐漸增加而增加，中、高濃度處理電導率差別不大，但顯著區(qū)別于低濃度處理，直到9 h后各處理的電導率值均出現(xiàn)微弱的減小趨勢。在低濃度下，Si5-Q5處理的電導率明顯大于Si0-Q5與Si2-Q5處理；而在較高濃度，發(fā)現(xiàn)Si2-Q5與Si5-Q5處理的電導率相當且均大于Si0-Q5處理。推測季銨鹽作用9 h后菌體已裂解到最大程度，此時大部分胞內(nèi)物質(zhì)已釋放至胞外，并有微量被菌體吸收或被其他微生物分解。表明隨著PDMS嵌段的增長、濃度的增加以及在一定時間范圍內(nèi)，在較低濃度下Six-Q5對菌絲細胞膜都具有較明顯的破壞效果，隨著濃度的增加，嵌段長度的增效作用逐漸減弱。

2.3 Six-Q5對R.solani細胞膜脂質(zhì)過氧化的影響

生物體中，自由基與脂質(zhì)發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用的最終產(chǎn)物為MDA。由于MDA是一種水溶性分子，在細胞膜受到破壞會外泄，故可通過測定MDA含量來確定其細胞膜過氧化程度，從而確定細胞膜的損壞程度［18-19］。在正常細胞中，脂質(zhì)過氧化反應與氧自由基反應處于動態(tài)平衡，當受到外界刺激（紫外線、高溫、嚴寒、高鹽等）時，氧自由基逐漸增加，即發(fā)生氧化應激。在氧化應激條件下，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（如MDA），從而改變細胞膜的流動性等，導致細胞膜的結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生變化［20］。因此，可能是由于大分子季銨鹽的陽離子密度高，使得脂質(zhì)過氧化反應與氧自由基反應的動態(tài)平衡被打破，產(chǎn)生氧化應激，從而發(fā)生了脂質(zhì)過氧化作用。

圖5 Six-Q5處理對R.solani菌絲細胞膜脂質(zhì)過氧化的影響Fig.5 Effect of Six-Q5 treatment on lipid peroxidation on R.solani mycelial cell membrane

利用MDA試劑盒，檢測R.solani菌絲與培養(yǎng)液的MDA含量，結(jié)果見圖5。由圖5可知，對照組菌絲與培養(yǎng)液MDA含量均趨于0，處理組菌絲與培養(yǎng)液MDA含量則隨著藥物的濃度升高而增加。在培養(yǎng)液中，經(jīng)過Si0-Q5與Si2-Q5處理的MDA含量稍大于經(jīng)過Si5-Q5處理的MDA含量；而在菌絲提取液中，經(jīng)過Si0-Q5與Si5-Q5處理的MDA含量隨濃度的增加有較小幅度的增加，而在經(jīng)過Si2-Q5處理后，隨著濃度的增加MDA含量增加較多。表明經(jīng)過Six-Q5處理后，菌絲細胞膜發(fā)生了脂質(zhì)過氧化反應，由于菌絲細胞膜破裂，脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物MDA滲漏于培養(yǎng)液中。且隨著PDMS嵌段的不同，Six-Q5對于細胞膜的脂質(zhì)過氧化影響也不同，其影響與Six-Q5的嵌段結(jié)構(gòu)有關(guān)。

3 討論

位于細胞壁內(nèi)側(cè)的細胞膜主要由類脂物質(zhì)和蛋白質(zhì)構(gòu)成，是富有彈性的半透性薄膜，是菌體細胞的選擇性滲透屏障。當細胞膜損傷時，通透性增強，細胞質(zhì)中的重要物質(zhì)向外泄露，導致菌體死亡。前人研究發(fā)現(xiàn)，一些抗真菌劑（如新農(nóng)抗702、新型農(nóng)抗N2提取物、納他霉素等）就是通過損傷菌體細胞膜，造成細胞內(nèi)含物外泄，從而起到殺菌作用［21-22］。

本試驗結(jié)果表明，Six-Q5處理R.solani菌絲后，菌絲細胞膜完整性受到損害，胞內(nèi)蛋白質(zhì)、碳水化合物以及電解質(zhì)發(fā)生外泄，尤其是隨著藥物濃度的提高，菌絲以及培養(yǎng)液中的MDA含量升高。表明大分子季銨鹽打破了氧化自由基反應與脂質(zhì)過氧化反應的平衡，發(fā)生了脂質(zhì)過氧化作用，產(chǎn)生的MDA改變了細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能。細胞的脂質(zhì)過氧化反應以及氧自由基反應對生物有機體新陳代謝具有重要作用，細胞經(jīng)過高鹽刺激后，打破了脂質(zhì)過氧化反應與氧自由基反應的平衡，產(chǎn)生氧化應激，造成脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA［18］。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，小分子季銨鹽不會引起水稻紋枯病菌細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，是否引起細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應是Six-Q5與小分子季銨鹽抑制水稻紋枯病菌在細胞膜這個作用靶點的重要區(qū)別。未來將通過研究兩親性大分子季銨鹽Six-Q5對R.solani菌絲細胞膜麥角甾醇生物合成、活性氧（ROS）以及谷胱甘肽等的影響，來進一步揭示Six-Q5對水稻紋枯病菌的抑菌機理。

4 結(jié)論

3種具有不同聚硅氧烷嵌段長度的Six-Q5（即Si0-Q5、Si2-Q5和Si5-Q5）對水稻紋枯病菌菌絲細胞膜的完整性、滲透性以及脂質(zhì)過氧化反應均產(chǎn)生了一定的影響，破壞了菌絲細胞膜的完整性，改變了細胞膜的滲透性以及促進了細胞膜的脂質(zhì)過氧化反應，從而使得細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化；并且在一定時間范圍內(nèi)，隨著PDMS嵌段的增長、處理時間的增加以及季銨鹽濃度的提高，其對菌絲細胞膜的影響也更加顯著。通過以上研究，初步確定了細胞膜是Six-Q5抑制水稻紋枯病菌一個作用靶點，為Six-Q5類大分子季銨鹽的結(jié)構(gòu)優(yōu)化及其在水稻紋枯病防治中的應用提供一定的理論指導。