戚怡婷 成玉梁 于航 謝云飛 郭亞輝 錢和 姚衛(wèi)蓉

摘要 [目的]建立高效脫毒方法，為研制安全的銀杏果新產(chǎn)品提供思路。[方法]利用手提式高壓蒸汽滅菌器爆破銀杏果并脫除胚芽，以不同浸泡時長、加水量、爆破壓力和時間探究開口率和脫芽率，建立高效液相色譜法檢測脫芽前后的銀杏酸和銀杏內酯B含量的變化，并將脫毒后的銀杏果加工成休閑食品。[結果]當銀杏果浸泡4 h后，加入200 mL水在0.142 MPa下爆破30 min，最高開口率達8198%。銀杏酸大量存在于胚芽中，脫除胚芽后的銀杏果毒性減少93.69%，銀杏內酯無顯著性差異。加工后的黃油椰蓉味銀杏果經(jīng)感官評定無明顯苦味且外形和口感不受影響。[結論]該方法降低銀杏果毒性方便有效，為銀杏產(chǎn)品的開發(fā)和食用安全性提供了基本保證。

關鍵詞 銀杏果;高壓蒸汽;銀杏酸;銀杏內酯B;胚芽

中圖分類號 TS201.6文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）13-0158-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.13.049

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Detoxification of Ginkgo biloba Seeds by Splitting Shells and Removing Gametophytes

Abstract [Objective] To establish an efficient detoxification method for the development of new safe Ginkgo products. [Method] Gbs were split by the high pressure steam sterilizer and gametophytes were removed. The splitting rate and removal rate were investigated by different soaking time， amount of adding water， steaming pressure and steaming time. The changes of ginkgolic acid and ginkgolides B before and after split were analyzed by a highperformance liquid chromatographic （HPLC）. The detoxified Gbs were developed into snack food. [Result] It showed that when Gbs were soaked for 4 h and steamed with 200 mL water at the highest pressure of 0.142 MPa for 30 min， the splitting rate was the highest with 81.98%， and the highest detoxification rate was 93.69% while the content of ginkgolide B was not reduced obviously. The buttery coconut flavored snack food had no adverse effects on shape and flavor and without bitterness by preference sensory evaluation. [Conclusion] The method of reducing toxicity was convenient and effective， and provided a basic guarantee for the edible safety of Ginkgo products.

Key words Ginkgo biloba seeds;High pressure steam;Ginkgolic acid;Ginkgolide B;Gametophytes

基金項目 2017年江蘇省林業(yè)科技創(chuàng)新與推廣項目（LYKJ[2017]26）。

作者簡介 戚怡婷（1994—），女，江蘇常熟人，碩士，研究方向：食品安全與質量控制。*通信作者。

收稿日期 2019-02-25;修回日期 2019-03-25

銀杏最早出現(xiàn)在3億年前的石炭紀，素有“活化石”的美名[1]。我國銀杏資源豐富，占世界總量的70%。銀杏果是一種營養(yǎng)價值很高的干果，含有多種活性化合物，如黃酮、內酯、鞣酸和抑菌蛋白等[2]。它能起到抑制真菌[3]、抗過敏、抗氧化[4]、消炎[5]、耐缺氧[6]、通暢血管[7]、改善大腦功能、治療老年癡呆癥[8-9]和改善腦供血不足[10]的作用。然而，銀杏果含有毒素，如果食用過量，會引起痙攣、意識喪失等中毒癥狀[11]。

現(xiàn)普遍認為，銀杏的主要毒性源于種仁中的胚芽，包括銀杏酸、氫氰酸和4′-O-甲基吡哆醇（MPN）。然而，對這些有毒物質在銀杏果中含量分布的評估卻很少。據(jù)報道，銀杏葉、外種皮和銀杏果中總銀杏酸的濃度不同，但均高于國際和國內標準[12]。田曉清等[13]測得胚芽中的銀杏酸含量最高，為64.415 μg/g，其次是內種皮、中種皮、胚乳。另有人對罐頭和煮熟的銀杏果中的MPN進行了測定，發(fā)現(xiàn)含量僅為生銀杏果的1%[14]，表明加熱可有效降低MPN。而銀杏果中的氫氰酸屬于安全范圍[15-16]?？梢?，銀杏酸是銀杏果中主要毒性物質。最近研究表明，銀杏內酯B是一種有效的血小板活化因子（PAF）拮抗劑，可用于治療哮喘、內毒素休克和移植排斥反應[17]。

檢測方法方面，有研究使用了超臨界流體色譜法測定銀杏果中的銀杏酸濃度[18]，也有人采用液質聯(lián)用方法對銀杏葉中的營養(yǎng)成分進行了測定[19]。而銀杏內酯的檢測一般采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC-ELSD）或液相色譜-質譜法（LC/MS）[20-21]。可見，高效液相色譜法是一種常見的有效方法。

目前，銀杏制品的脫毒方法主要有加熱、干燥、醇提、物理去除等。通常采用物理脫毒法處理銀杏果，如烹飪或去殼后干燥制成粉末。然而，對于烹飪或油炸脫毒法，尚無明確的科學依據(jù)。筆者研究了銀杏果中毒性物質的含量分布，提出了高壓蒸汽爆破銀杏果脫除胚芽的新方法，探究了脫芽前后銀杏酸和銀杏內酯B的濃度變化，并將脫芽后的銀杏果制成黃油椰蓉味休閑產(chǎn)品，既保證了銀杏果的食用安全，又為銀杏果深加工和綜合利用提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

總銀杏酸（C13∶0、C15∶1、C17∶2、C15∶0和C17∶1）標準品購于上海同田生物技術股份有限公司;白果酸（C15∶1）標準品購于北京百靈威科技有限公司（純度98%）;銀杏內酯B由國家食品藥品監(jiān)督管理局提供（純度95.6%）;無水甲醇和正己烷為色譜級，其他試劑均為分析級，購自國藥集團化學試劑有限公司;試驗所用銀杏果均來源于江蘇省邳州市銀杏源生物工程有限公司，品種為馬蹄。

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）;超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質譜聯(lián)用儀（美國Waters公司）;手提式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）;旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）;離心機;電子分析天平（德國Sartorius儀器公司）;Direct-Q5超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）;電熱鼓風干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）。

1.2 方法

1.2.1 銀杏果爆破及脫芽工藝。

將新鮮銀杏果洗凈，除去破損、霉變及漂浮的顆粒，在蒸餾水中分別浸泡0、4、8或12 h，取出500 g銀杏果分成4組，分別加入0、100或200 mL水進行爆破，控制壓力范圍在0.09～0.142 MPa下加工15～30 min。

銀杏果果殼受高溫高壓開口破裂，果中胚芽自動脫落，人工統(tǒng)計銀杏果開口數(shù)和胚芽脫除數(shù)，得開口率及脫芽率。計算公式如下：

開口率=開口銀杏果數(shù)/銀杏果總數(shù)×100%

脫芽率=開口銀杏果胚芽掉落數(shù)/開口銀杏果含芽總數(shù)×100%

另沿銀杏果邊緣縱向測量開口長度，除以銀杏殼邊緣總周長，記錄其≥1/2的銀杏果數(shù)，以確定不同條件下的爆破效果。

1.2.2 銀杏酸和銀杏內酯B含量的測定。

1.2.2.1 銀杏酸含量。

①液相色譜條件。

采用Agilent 1260型高效液相色譜儀檢測，Waters XBridge C18色譜柱（46 nm×250 nm，5 μm），流動相是甲醇∶水（3%冰醋酸）=90∶10，柱溫為30 ℃，檢測波長310 nm，流速1.0 mL/min，進樣量20 μL。

②標準曲線。

將銀杏酸混標和白果酸標品用無水甲醇溶解、定容，分別稀釋至濃度為1 000、500、200、50、5、0.5 μg/mL，用0.45 μm 的有機濾膜過濾，得銀杏酸標準溶液。以銀杏酸濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標作圖，得標準曲線。

③銀杏酸的提取。

將銀杏果在50 ℃電熱鼓風干燥箱中烘干并粉碎。取2.5 g粉末置具塞錐形瓶中，加入50 mL甲醇，稱定質量，70 ℃水浴中加熱回流3 h，放冷再稱定，用無水甲醇補足，過濾。取30 mL濾液，旋轉蒸發(fā)濃縮至干，加20 mL碳酸鈉-鹽酸緩沖溶液（pH 2.5）混懸殘渣，并用正己烷萃取3次，每次10 mL，再次濃縮至干，殘渣用無水甲醇定容至2 mL[13]，10 000 r/min離心3 min后取上清液測定。

1.2.2.2 銀杏內酯B含量。

①液相色譜條件。

通過超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質譜聯(lián)用儀測定，BEH C18 50 mm分析柱，柱溫為45 ℃，進樣量1 μL。流動相A是甲醇，流動相B是0.1%甲酸。初始流動相（10%A和90%B）在01 min內保持恒定，然后在7 min內梯度洗脫至100%A，最后在7.1 min內返回起始。總運行時間為10 min，流速為03 mL/min。

②標準曲線。

將銀杏內酯B標準品溶于無水甲醇，逐漸稀釋至95、38、19、9.5、4.75、1.187 5 μg/mL，用045 μm 的有機濾膜過濾，得銀杏內酯B標準溶液。以銀杏內酯B濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標作圖，制標準曲線。

③銀杏內酯B的提取。

精確稱取銀杏果粉末2.0 g，加入50%乙醇置索氏提取器中70 ℃提取2 h，冷卻過濾，濾渣加入50%乙醇溶液再提取2 h。合并2次提取液旋轉蒸發(fā)至干，加入10 mL蒸餾水和0.3 g乙酸鈉溶解殘渣，以等體積乙酸乙酯萃取2次，合并有機相旋轉蒸發(fā)至干，殘渣用無水甲醇定容至2 mL[22]，10 000 r/min離心3 min后取上清液測定。

1.2.3 銀杏果休閑食品的制作及感官評定。

選擇爆破脫芽后的銀杏果剝去外殼后待用。將低筋面粉、玉米淀粉和木薯淀粉以40∶5∶55混合，在濃度為28.5%的糖水中加入2%碳酸氫銨，攪拌混勻后放置5 min。將混合物等分成若干份后均勻包裹銀杏果，置170 ℃烤箱中烘烤15 min， 取出涂抹黃油和烘焙過的椰蓉（1∶2）混合物，繼續(xù)烘烤5 min。

為對該產(chǎn)品進行偏好型感官評定，筆者邀請15名感官評定人員參與評估，根據(jù)產(chǎn)品的形狀、色澤、風味、質地和味道分別打分。 每項分為3個級別，最高分為2分，滿分10分。

1.2.4 統(tǒng)計分析。

使用MassLynx V4.1對銀杏內酯B數(shù)據(jù)進行分析，所有數(shù)據(jù)均使用Origin8軟件處理，并采用SPSS軟件對其進行方差分析（ANOVA）和均值差異性分析，顯著性水平P<0.05。

2 結果與分析

2.1 銀杏果中銀杏酸含量及其分布結果

據(jù)已有報道，銀杏酸其實是6-烷基或6-烯基水楊酸的衍生物，主要包括銀杏酸C13∶0、C15∶0、C15∶1、C17∶1、C17∶2，化學結構式見圖1。該試驗中銀杏果提取物中主要銀杏酸種類與總銀杏酸標準品相同。液相分析結果顯示，銀杏果中含5種主要銀杏酸，各種銀杏酸均得到較好分離，且基線穩(wěn)定。其中，白果酸（C15∶l）含量最高，其次是C17∶1和C17∶2，這3種含量占總銀杏酸含量的95%以上。

根據(jù)檢測，原始銀杏果中的總銀杏酸含量約為255.30 μg/g。以白果酸（C15∶1）為例，在內種皮中約為4915 μg/g，在胚乳中為24.97 μg/g，而胚芽中約含4.47 mg/g，其具體分布詳見表1。由表1可知，銀杏果中毒性成分最多集中于胚芽中，大約占84.58%?？梢?，去除胚芽是降低毒性的有效方法。

2.2 高壓蒸汽對銀杏果爆破效果的影響

2.2.1 高壓蒸汽對銀杏果開口率和脫芽率的影響。

由圖2A所示，無論是否加水，銀杏果的開口率均在50%以上，但3種條件之間沒有顯著差異;當加水量為200 mL時，即加水沒過銀杏果，其開口率可達62.35%;脫芽率均在30%以上，也無顯著性差異。而浸泡時間對銀杏果爆破結果的影響如圖2B所示。與未浸泡的銀杏果相比，浸泡過后的銀杏果開口率均較高，達70%以上，而浸泡4 h后的銀杏果開口率高達81.98%。同樣，浸泡后的脫芽率也高于未浸泡組，均在35%左右。該研究采用高壓蒸汽滅菌器爆破銀杏果，去除胚芽，其中蒸汽壓力是重要的控制因素之一。圖2C表明，隨著蒸汽壓力的增加，開口率逐漸增加。當使用滅菌器最高氣壓時，其開口率約達80%，與其他2種情況存在顯著差異。而脫芽率基本不受影響，但在最高蒸汽壓力下最高。因此，采用較高的蒸汽壓力對爆破銀杏果有較好的效果。由圖2D可見，蒸煮時間對爆破結果的影響與蒸汽壓力相同。隨著蒸煮時間的延長，開口率逐漸增大，當銀杏果蒸煮處理30 min后，其開口率達81.87%，比蒸煮15 min的開口率高33.63百分點，同樣，該條件作用下的銀杏果胚芽去除率為20%～30%，均無顯著性差異。

2.2.2 高壓蒸汽對銀杏果開口大小的影響。

銀杏果在不同高溫高壓條件下經(jīng)蒸煮后形成不同的外觀（圖3）。圖3A表明，頂部橫向的平均開口大小為2～3 mm，去除胚芽的效果差異如圖3B所示。除開口率外，開口大小也是判斷爆破效果的標準。通過比較開口大小，也可以確定不同爆破條件的效果，從而獲得最佳爆破條件。如圖4所示，縱坐標表示開口大小≥1/2的銀杏果數(shù)量。由圖4A可見，與不加水相比，加水量越大，開口效果越好;當向水中加入200 mL水時，開口尺寸≥1/2的銀杏果數(shù)量占全部開口數(shù)的42.11%。圖4B所示的開口大小結果與圖2B的開口率一致，當銀杏果浸泡4 h時，對開口大小的影響最好;相反，浸泡時間超過4 h后，爆破效果減弱;未浸泡過的銀杏果開口大小≥1/2的數(shù)量最少。從圖4C可以看出，蒸汽壓力對開口數(shù)大小影響明顯;蒸汽壓力越高，爆破效果越好;當壓力達到0.142 MPa時，開口效果最佳。蒸煮時間對開口數(shù)大小的影響如圖4D所示。由圖

2.3 銀杏果毒性和活性物質的含量變化

圖5A比較了原始銀杏果、蒸煮過的銀杏果、脫芽后的銀杏果和30%脫芽后的銀杏果中白果酸（C15∶1）和總銀杏酸含量。原始銀杏果中銀杏酸總量約為255.30 μg/g，遠超限定標準。目前，歐洲藥典和中國藥典分別限定銀杏葉提取物中銀杏酸總量的最高濃度為5和10 μg/g[23]。該研究中，蒸煮過的銀杏果中仍然存在大量總銀杏酸（圖5A），而脫芽后的銀杏果中銀杏酸含量顯著降低，其中白果酸（C15∶1）甚至被完全脫除，其脫毒率達100%（圖5B）。由此證明，使用高壓蒸煮并不能完全脫毒。該試驗還測定了脫除30%胚芽的銀杏果中銀杏酸的含量，其中白果酸（C15∶1）為原始值的37.22%，總銀杏酸為46.15%，表明去除了62.78%的白果酸（C15∶1）和53.85%的總銀杏酸。

該結果與表1中檢測到的白果酸在銀杏果中的分布一致，說明銀杏果中約有84.58%的毒性主要分布在胚芽中，而內種皮和胚乳中的毒性很少。因此，當利用高壓蒸汽除去胚芽后，銀杏果的毒性大大降低。

銀杏果中代表性活性物質銀杏內酯B在原始種仁中的含量約為91.52 μg/g（圖6）。有報道稱銀杏葉中的銀杏內酯含量為0.7%～0.8%[24]，另有人發(fā)現(xiàn)銀杏果中的銀杏內酯含量高于銀杏葉[25]。該試驗結果表明，原始銀杏果和脫芽后的銀杏果中銀杏內酯B含量并沒有顯著差異。正如表1所示，銀杏內酯B大量存在于胚乳而不是胚芽中，脫除胚芽不會明顯影響銀杏果中的活性物質含量，因此，使用高壓蒸汽爆破銀杏果可以為食品安全和營養(yǎng)提供基本保障。

2.4 銀杏果休閑食品感官評定結果

按照上述方法制作銀杏果休閑食品，烘焙后的成品外觀如圖3C所示。表2為15名感官評定員對食品形狀、顏色、風味、質地和味道的評定結果。

由表2可見，與未脫去胚芽的完整銀杏果相比，去除胚芽對制作的休閑食品外觀并無影響，兩者在顏色和形狀上無顯著差異（P>0.05）。相反，當銀杏果脫除胚芽后，它在風味、質地和味道上更受歡迎，因為去除胚芽會減少銀杏果本身的苦味，但仍保留它特有的香氣。從得分情況看，脫除胚芽的銀杏果平均分在1.78分以上，顏色和風味項得分較高。

該休閑食品不僅外觀上容易被接受，而且還保留了銀杏果特有的風味。因此，采用高壓蒸汽對銀杏果進行爆破脫芽以降低毒性是可行的，也為銀杏產(chǎn)品的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

3 結論與討論

采用高壓蒸汽對銀杏果進行爆破，使其開口自動脫除胚芽可降低毒性。研究表明，脫芽能有效降低銀杏酸含量，白果酸（C15∶1）脫除率可達100%。除此之外，銀杏內酯B含量在脫毒前后無明顯差異，但是否影響銀杏果的其他藥用性能還有待進一步研究。該加工方法對未來銀杏產(chǎn)品的開發(fā)和食用安全性的保障具有重要意義。

參考文獻

[1] 祖麗亞.銀杏果實與葉的開發(fā)和利用[J].商業(yè)科技開發(fā)，1996（4）：34-35.

[2] 蒲麗麗.銀杏的藥用食用價值及在食品工業(yè)中的應用[J].農(nóng)村經(jīng)濟與科技，2010，21（4）：110，53.

[3] OKEN B S，STORZBACH D M，KAYE J A.The efficacy of Ginkgo biloba on cognitive function in Alzheimer disease[J].Archives neurology，1998，55（11）：1409-1415.

[4] DEFEUDIS F V，DRIEU K.Ginkgo biloba extract（EGb 761）and CNS functions：Basic studies and clinical applications[J].Current Drug Targets，2000，1（1）：25-58.

[5] ILIEVA I，OHGAMI K，SHIRATORI K，et al.The effects of Ginkgo biloba extract on lipopolysaccharideinduced inflammation in vitro and in vivo[J].Experimental eye research，2004，79（2）：181-187.

[6] ERNST E.The riskbenefit profile of commonly used herbal therapies：Ginkgo，St.Johns Wort，Ginseng，Echinacea，Saw Palmetto，and Kava[J].Annals of internal medicine，2002，136（1）：42-53.

[7] MARCOCCI L，MAGUIRE J J，DROYLEFAIX M T，et al.The nitric oxidescavenging properties of Ginkgo biloba extract EGb 761[J].Biochem Biophys Res Commun，1994，201（2）：748-755.

[8] BIRKS J.Ginkgo biloba for cognitive impairment and dementia[J].Alzheimers & dementia，2006，2（3）：367.

[9] DEKOSKY S T，WILLIAMSON J D，F(xiàn)ITZPATRICK A L，et al.Ginkgo biloba for prevention of dementia：A randomized controlled trial[J].Jama the journal of the American medical association，2008，300（19）：2253-2262.

[10] LEITE T C C，BRANCO A.Analysis of the package inserts for medicines to the base of Ginkgo biloba L.[J].Revista de ciencias farmaceuticas basica e aplicada，2010，31（1）：83-87.

[11] UDAKA N.High performance liquid chromatographic determination of ginkgotoxin and ginkgotoxin5′glucoside in seeds[J].Journal of liquid chromatography & related technologies，2006，29（4）：605-616.

[12] 李轉梅，張學蘭，李慧芬，等.白果不同部位及不同炮制品中白果酸和總銀杏酸定量比較[J].中成藥，2015，37（1）：164-168.

[13] 田曉清，王錫昌，吳文惠，等.高壓液相色譜分析法測定大佛指銀杏酚酸含量[J].營養(yǎng)學報，2010，32（6）：608-611.

[14] LEISTNER E，DREWKE C.Ginkgo biloba and ginkgotoxin[J].Journal of natural products，2010，73（1）：86-92.

[15] CHEN P，HE F R，TAO J，et al.Female plant types of Ginkgo biloba L.in China[J].Forestry studies in China，2003，5（2）：17-22.

[16] 陳鵬，何鳳仁，韋軍，等.60Co和速凍對銀杏種胚及氫氰酸含量的影響[J].江蘇農(nóng)學院學報，1994，15（1）：53-56.

[17] BRAQUET P G.The ginkgolides：Potent plateletactivating factor antagonists isolated from Ginkgo biloba L..Chemistry，pharmacology and clinical applications[J].Drugs of the future，1987，12（7）：643-699.

[18] WANG M，CARRELL E J，CHITTIBOYINA A G，et al.Concurrent supercritical fluid chromatographic analysis of terpene lactones and ginkgolic acids in Ginkgo biloba extracts and dietary supplements[J].Analytical & bioanalytical chemistry，2016，408（17）：4649-4660.

[19] LPEZGUTIRREZ N，ROMEROGONZLEZ R，VIDAL J L M，et al.Quality control evaluation of nutraceutical products from Ginkgo biloba using liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry[J].Journal of pharmaceutical & biomedical analysis，2016，121：151-160.

[20] WU Y L，LI Y J，DING G，et al.Qualitative and quantitative of ginkgo terpene lactone raw material by HPLC/QTOF MS combined with HPLCDADELSD[J].Analytical methods，2015，7（2）：667-674.

[21] 肖瑩，陳亮，黃杰，等.用HPLC-ELSD法測定復方銀靈通膠囊中銀杏總內酯的含量[J].藥學服務與研究，2016，16（3）：200-202.

[22] 張崢，葉小玉，肖強，等.UPLC-TOF-MS快速測定不同核用銀杏品種銀杏葉中銀杏內酯和白果內酯含量[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2015，27（2）：286-288，300.

[23] 成亮，樓鳳昌.銀杏外種皮中銀杏酚酸的研究概況[J].藥學進展，2004，28（5）：209-213.

[24] 蔣明廉.不同采收期銀杏葉總內酯及黃酮甙的含量測定[J].廣西植物，1997，17（3）：283-285.

[25] 曹幫華，馬?；郏妨?銀杏種仁黃酮與內酯含量變化初探[J].山東農(nóng)業(yè)科學，2003（1）：16-19.