廖雯　孫愛群　劉新穎　盧虹

摘要：以從貴州省六盤水市采集的頭花龍膽（Gentiana cephalantha）、紅花龍膽（G. rhodantha）及于畢節(jié)市采集的翼萼龍膽（G. pterocalyx）為材料，用超聲、浸提及回流法提取粗提物，采用濾紙片擴散法，以抑菌圈大小為評價指標，檢測3種龍膽草粗提物對大腸桿菌、銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌的抑菌活性，考察氧化劑、溫度、pH值及紫外線對龍膽草粗提物抑菌活性的影響。結果表明，頭花龍膽與翼萼龍膽用3種提取方法所得粗取物的抑菌效果大致相當，而紅花龍膽用超聲與浸提法所得提取物的抑菌效果大致相當，回流法所得提取物的抑菌效果稍弱。頭花龍膽浸提液對大腸桿菌、銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度（MIC）均為0.100 g/mL，紅花龍膽浸提液對以上3種菌的MIC分別為0.050、0.100、0.050 g/mL，翼萼龍膽浸提液對以上3種菌的MIC分別為0.150、0.100、0.150 g/mL。由結果可以看出，氧化劑能夠增強3種龍膽草的抑菌活性;3種龍膽草提取物具有熱穩(wěn)定性;酸性環(huán)境的抑菌活性大于堿性環(huán)境，當pH值為4時，抑菌效果最好;在紫外線照射下，抑菌活性變化不大。綜合對3種細菌的抑菌效果可知，研究所用的3種龍膽可以被開發(fā)成天然的抑菌劑。

關鍵詞：紅花龍膽草;翼萼龍膽草;頭花龍膽草;大腸桿菌;金黃色葡萄球菌;銅綠假單胞菌;最低抑菌濃度

中圖分類號： R285.5文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）08-0198-04

龍膽屬（Gentiana）植物在我國有247種[1]，在貴州省有29種1個變種，其中在貴州六盤水有13種[2-3]。頭花龍膽（G. cephalantha）具有瀉肝火、清下焦、除濕熱的功效[4]。紅花龍膽（G. rhodantha）為《中華人民共和國藥典》2015版中新收載的品種，具有清熱除濕、解毒、止咳的功效[5]。目前尚未見翼萼龍膽（G. pterocalyx）入藥的報道。龍膽屬植物大多含有龍膽苦苷，徐竺婷等認為，龍膽苦苷對口腔內的多種細菌具有抑制作用[6];賀平等認為，以白花龍膽為主成分的龍膽花丸對金黃色葡萄球菌具有抑制作用，最低抑菌濃度（MIC）為 6.25～12.5 mg/mL[7];藍玉簪龍膽（G. veitchiorum）對金黃色葡萄球菌也有一定的抑制作用[8];滇龍膽（G. rigescens）對21株試驗細菌有抗菌作用，對10株致齲菌的MIC大于 20 mg/mL[9];以龍膽（G. scabra）等10味中草藥組成的瀉痢停制劑對沙門氏菌、大腸桿菌有較好的抑制作用[10];從云霧龍膽（G. nubigena）中分離的內生菌對蘋果腐爛病病菌的生長有顯著的拮抗作用[11]。目前尚未見關于頭花龍膽、紅花龍膽及翼萼龍膽的抑菌作用及穩(wěn)定性的報道。本試驗以頭花龍膽、翼萼龍膽和紅花龍膽為材料，比較不同方法提取的粗提物對大腸桿菌、銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌的抑菌效果及抑菌穩(wěn)定性，旨在為開發(fā)天然抑菌劑提供基礎資料。

1材料與方法

1.1材料及供試菌種

試驗材料為頭花龍膽（采自貴州省六盤水市鐘山區(qū)韭菜坪，海拔 2 600 m）、紅花龍膽（采自貴州省六盤水市水城縣俄腳村，海拔1 750 m）、翼萼龍膽（采自貴州省畢節(jié)市威寧縣艾家坪村，海拔2 300 m）。將3種龍膽洗凈，干燥至恒質量，粉碎，備用。

供試菌種大腸桿菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）及金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），由六盤水師范學院生物科學與技術學院微生物學實驗室提供。試驗于2017年2—5月在六盤水師范學院微生物實驗室進行。

1.2儀器與試劑

SCIENTZ-IID超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司;HH-601恒溫水浴鍋，金壇市恒豐儀器廠;303A-2型數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司;MLS-3750高壓滅菌鍋，日本三洋電器股份有限公司;DFT-200手提式高速萬能粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司;SHB-3 循環(huán)水多用真空泵，鄭州杜甫儀器廠。

主要試劑：NaOH、HCL、NaCl、95%乙醇，均為分析純;牛肉膏，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠;蛋白胨，上海盛思生化科技有限公司;純化瓊脂，杭州微生物試劑有限公司;青霉素，中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1粗提液的制備稱取頭花龍膽、紅花龍膽及翼萼龍膽全草，分別用超聲、浸提及索式回流方法提取。經過預試驗篩選出的提取條件如下：3種方法所用提取溶劑為70%乙醇，料液比為1 g ∶20 mL。提取液經抽濾，于80 ℃濃縮至生藥含量為 1 g/mL 的原液，于4 ℃冰箱密封保存，備用。

超聲提取參照翁貴英等的方法[12]，提取時間為40 min。索式回流提取方法為70 ℃回流提取2次，每次1 h，合并2次提取液。浸提提取方法為70 ℃恒溫水浴鍋浸提2 h。

1.3.2供試菌種的活化及菌懸液的制備培養(yǎng)基的配制及供試菌的活化參照沈萍等的方法[13]。將活化的供試菌種轉接后于37 ℃培養(yǎng)24 h，待菌體達到對數(shù)生長期后，用無菌生理鹽水制成菌體濃度為10-6～10-7 CFU/mL 的菌懸液，待用。

1.3.3抑菌活性的檢測采用濾紙片擴散法檢測3種龍膽的抑菌活性。用6 mm打孔器打取1號定性濾紙片，滅菌后分別放入不同方法提取的3種龍膽草的提取液、陰性對照無菌水及陽性對照青霉素溶液中浸泡2 h，瀝干待用。

配制培養(yǎng)基，倒平皿，冷卻后每個平皿加50 μL菌懸液，用無菌三角涂布棒將其涂布均勻。將用不同藥液浸泡過的濾紙片等距放置在涂有菌液的平皿上，于37 ℃培養(yǎng)24 h，設3次重復。用十字交叉法測量抑菌圈直徑[抑菌圈直徑包括濾紙片直徑（6 mm），抑菌圈直徑為6 mm表示無抑菌作用]，記錄數(shù)據，取平均值。陰性對照無菌水無抑菌作用，陽性對照青霉素有抑菌作用，表明試驗有效。抑菌圈直徑越大，表示抑菌活性越強。

1.3.4最低抑菌濃度的測定對于用浸提法提取的粗提物，采用試管稀釋法稀釋后測定MIC[14]，分為大腸桿菌、銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌3個大組，每個大組又分為3個小組，分別為頭花龍膽、紅花龍膽及翼萼龍膽組，每個小組取12支無菌試管，并編號為1～12，其中1～10號試管分別加1.00、1.20、1.30、1.40、1.50、1.60、1.70、1.80、1.90、1.95 mL培養(yǎng)液與1.00、0.80、0.70、0.60、0.50、0.40、0.30、0.20、0.10、0.05 mL 提取液，使提取液最終濃度分別為0.500、0.400、0.350、0.300、0.250、0.200、0.150、0.100、0.050、0.025 g/mL，再各加0.1 mL供試菌，混勻;11號試管加2 mL培養(yǎng)液與0.1 mL供試菌，記作CK1;12號試管只加2 mL粗提液，記作CK2。將全部試管于37 ℃培養(yǎng)24 h，取出振蕩，觀察各管細菌的生長情況。為了提高準確性，將初步判斷為澄清透明的試管溶液涂布于平板培養(yǎng)基上，置于37 ℃培養(yǎng)24 h，再次觀察，將完全無細菌生長的平板對應的粗提物濃度作為最低抑菌濃度。

1.3.5氧化劑對3種龍膽草抑菌活性的影響用浸提法提取獲得龍膽草粗提液，供試菌為銅綠假單胞菌。參照“1.3.3”節(jié)的方法，根據抑菌圈直徑的大小檢測抑菌穩(wěn)定性。

將原液制成含0.075% H2O2的樣液，以原液與0.075% H2O2為對照。

1.3.6溫度對3種龍膽草抑菌活性的影響將原液分別于40、60、80、100 ℃水浴及121 ℃高壓濕熱條件下處理30 min，以未加熱處理的原液作為對照。

1.3.7pH值對3種龍膽草抑菌活性的影響將原液用 1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調成pH值為2、4、6、8、10、12的溶液，以未調pH值的原液作為對照。

1.3.8紫外線對3種龍膽草抑菌活性的影響將原液分別于15 W紫外燈下照射30、60、90、120 min，以未經紫外線處理的原液作為對照。

2結果與分析

2.13種龍膽草的超聲提取物的抑菌活性比較

由圖1中3種龍膽草超聲提取物對3種細菌的抑菌圈直徑可知，陰性對照無菌水無抑菌作用，陽性對照青霉素有抑菌作用，可以認為試驗有效。3種供試菌的抑菌活性由大到小排序為紅花龍膽>頭花龍膽>翼萼龍膽?？梢?種龍膽草的超聲提取物對銅綠假單胞菌的抑菌活性較強，對金黃色葡萄球菌的抑菌活性較弱，紅花龍膽的超聲提取物對銅綠假單胞菌的抑菌活性最強，抑菌圈直徑為（14.14±1.70） mm。

2.23種龍膽草浸提提取物的抑菌活性比較

由圖2可知，3種龍膽草對對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌活性的排序為紅花龍膽>頭花龍膽>翼萼龍膽，而對銅綠假單胞菌的抑菌活性排序為紅花龍膽>翼萼龍膽>頭花龍膽。頭花龍膽浸提物對3種菌的抑菌活性大致相當;紅花龍膽浸提物對3種菌的抑菌活性排序為金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>銅綠假單胞菌;翼萼龍膽浸提物對3種菌的抑菌活性從強至弱排序為銅綠假單胞菌>金黃色葡萄球菌>大腸桿菌。綜上可以看出，浸提提取的紅花龍膽浸提物對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強，抑菌圈直徑為（14.66±0.82） mm。

2.33種龍膽草回流提取物的抑菌活性比較

由圖3可知，3種龍膽草的回流提取物對大腸桿菌的抑菌效果排序為頭花龍膽>紅花龍膽>翼萼龍膽，對銅綠假單胞菌的抑菌效果排序為紅花龍膽>頭花龍膽>翼萼龍膽，對金黃色葡萄球菌的抑菌效果排序為頭花龍膽>翼萼龍膽>紅花龍膽?；亓魈崛〉募t花龍膽提取物對銅綠假單胞菌的抑菌作用較強，抑菌圈直徑為（13.54±1.81） mm。

此外，本研究還對黑曲霉與根霉進行了抑菌試驗，結果表明，3種龍膽草提取物對黑曲霉、根霉無抑制作用。綜上所述，3種方法提取的頭花龍膽粗提物的抑菌活性大致相當;紅花龍膽用超聲法與浸提法所得提取物的抑菌活性相當，用回流法得到的提取物的抑菌活性稍弱;翼萼龍膽用3種方法得到的提取物的抑菌作用也大致相當。由于3種提取方法的效果大致相當，所以下列試驗采用成本低廉的浸提法提取。

2.43種龍膽草浸提液的最低抑菌濃度

由表1可知，頭花龍膽浸提液對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌的MIC為0.100 g/mL，紅花龍膽浸提液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC為0.050 g/mL，對銅綠假單胞菌的MIC為0.100 g/mL;翼萼龍膽浸提液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC為0.150 g/mL，對銅綠假單胞菌MIC為0.100 g/mL。

2.5氧化劑對3種龍膽草浸提液抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖4可知，3種龍膽草浸提液的抑菌圈直徑排序為原液+氧化劑（H2O2）>H2O2>原液，其中頭花龍膽浸提液經氧化劑（H2O2）處理后活性增加的最多，抑菌圈直徑達（23.12±1.18） mm，說明氧化劑能夠增強龍膽草浸提液的抑菌活性。3種龍膽草浸提液的抑菌成分受氧化劑的影響較小，可能因為氧化劑本身對細菌就有抑制作用。

2.6溫度對3種龍膽草浸提液抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖5可知，與原液相比，隨著溫度的升高，龍膽草浸提液的抑菌活性逐漸降低，但降低幅度較小?？傮w上可以看出，頭花龍膽與紅花龍膽浸提液的抑菌穩(wěn)定性較高，在100、121 ℃ 時仍具有較高的抑菌活性。翼萼龍膽的抑菌穩(wěn)定性稍低于頭花龍膽、紅花龍膽。綜合以上結果可以得出，3種龍膽草的抑菌成分對熱的穩(wěn)定性較好。

2.7pH值對3種龍膽草浸提液抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖6可以看出，在pH值為2～12的范圍內，3種龍膽草浸提液的抑菌活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，但是下降幅度較小，在pH值為4時抑菌活性達到最大值，說明3種龍膽草[CM（25]浸提液的抑菌成分受到pH值的影響較小。 此外由圖6可以看出，酸性環(huán)境能提高龍膽草的抑菌活性，堿性環(huán)境則會降低龍膽草浸提液的抑菌活性。

2.8紫外線對3種龍膽草浸提液抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖7可以看出，隨著紫外線處理時間的增加，3種龍膽草浸提液的抑菌活性逐漸下降，但是下降幅度較小。紫外線處理30 min時，3種龍膽草的抑菌活性與對照相比相差不大;紫外線處理90 min時，翼萼龍膽的抑菌活性變化仍然很小，表明翼萼龍膽的穩(wěn)定性較高。綜合以上結果可以看出，3種龍膽草的抑菌成分對紫外線較穩(wěn)定。

3討論與結論

提取粗提物的方法很多，有回流法、浸提法及超聲提取法等。李世傳等認為，金銀花的超聲法與索式法提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果略好于普通回流法[15];張雅靜等通過對苦瓜抑菌作用的研究，認為抑菌效果從好至差排序為超聲提取法>回流提取法>浸提法[16]。本試驗通過對超聲、回流、浸提3種提取方法的比較，認為頭花龍膽與翼萼龍膽用3種方法所得提取物的抑菌效果大致相當，而紅花龍膽的超聲法與浸提法所得提取物的抑菌效果大致相當，回流法所得提取物的抑菌效果稍弱。說明不同植物用不同方法所得提取物的抑菌效果不盡相同。

原江鋒等認為，連翹提取物經氧化劑處理后，抑菌活性大為降低，其對氧化劑的抑菌穩(wěn)定性較弱[17];本試驗表明，氧化劑處理可使3種龍膽草的抑菌活性增強，說明氧化劑對3種龍膽草提取物抑菌活性的影響較小，3種龍膽草對氧化劑的穩(wěn)定性較好。3種龍膽草提取物對高溫具有較好的熱穩(wěn)定性。用紫外線照射3種龍膽草提取物，其抑菌活性仍然較高，說明3種龍膽草的抑菌成分對紫外線較穩(wěn)定。3種龍膽草提取物在酸性環(huán)境下的抑菌活性較強，在pH值為4的活性最大，在堿性環(huán)境中時，龍膽草提取物的抑菌活性逐漸降低，但是下降幅度較小，與任曉靜等對甜葉菊[18]、仇燕等對菜芙蓉的研究結果[19]具有一致性。不同的是仇燕等研究得出，菜芙蓉提取物隨著pH值的升高，其抑菌活性的下降速度變快[19]。

清熱解毒中草藥具有一定的抑菌作用，從抑菌效果來看，翼萼龍膽草浸提物對銅綠假單胞菌的抑菌作用好于頭花龍膽草浸提物，回流提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果好于紅花龍膽，而紅花龍膽具清熱、解毒的功效，說明翼萼龍膽也可以作為清熱解毒的藥物使用。

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