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        海南五指山豬TLR4基因克隆及生物信息學(xué)分析

        2019-08-20 14:58:33黃麗麗張艷劉海隆林哲敏譚樹(shù)義
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年8期
        關(guān)鍵詞:生物信息學(xué)分析克隆

        黃麗麗 張艷 劉海隆 林哲敏 譚樹(shù)義

        摘要:為獲得海南五指山豬TLR4基因序列并分析其分子結(jié)構(gòu)特征,以GenBank中豬的TLR4基因序列為參考序列,采用PCR技術(shù)對(duì)該基因組序列進(jìn)行克隆、測(cè)序及相關(guān)生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示,獲得的五指山豬TLR4基因DNA序列長(zhǎng)10 435 bp,其中編碼區(qū)全長(zhǎng)2 526 bp,共編碼841個(gè)氨基酸;與GenBank中發(fā)布的普通豬的TLR4基因序列相比,存在38處突變(其中有2處突變位于編碼區(qū));與普通豬、牛、綿羊、犬、馬、獼猴、人、黑猩猩、小鼠和雞的同源性分別為99.9%、80.7%、79.9%、74.8%、74.7%、73.1%、73%、72.7%、62.5%、43.4%;五指山豬TLR4編碼的蛋白屬于分泌性蛋白和跨膜蛋白,具有親水性,有8個(gè)糖基化修飾位點(diǎn)、17個(gè)絲氨酸(ser)、7個(gè)蘇氨酸(Thr)及8個(gè)酪氨酸(TYR)磷酸化位點(diǎn);氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明,不同物種TLR4基因在進(jìn)化過(guò)程中具有較高的保守性。該結(jié)果為進(jìn)一步深入研究TLR4基因的功能奠定基礎(chǔ)。

        關(guān)鍵詞:五指山豬;TLR4基因;克隆;生物信息學(xué)分析

        中圖分類(lèi)號(hào): S828.1;Q785文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

        文章編號(hào):1002-1302(2019)08-0041-05

        Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)是一種模式識(shí)別受體,其可特異性地識(shí)別革蘭氏陰性菌表達(dá)的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)或脂質(zhì)A(LPS的活性成分),快速啟動(dòng)免疫反應(yīng),誘導(dǎo)各種炎性介質(zhì)釋放,激活相關(guān)免疫細(xì)胞來(lái)抵抗微生物的入侵,在動(dòng)物機(jī)體的免疫反應(yīng)和炎癥等方面起重要作用[1]。目前,TLR4基因在免疫和感染領(lǐng)域研究較熱。大量研究表明,TLR4基因的缺失或突變可能會(huì)誘發(fā)細(xì)胞對(duì)LPS的反應(yīng)性減弱或喪失,導(dǎo)致機(jī)體對(duì)疾病易感性增加。如TLR4基因缺失會(huì)加重慢性阻塞性肺炎患者的肺損傷[2];近端腫瘤和轉(zhuǎn)移性疾病的發(fā)生與TLR4基因的突變相關(guān)[3];TLR4基因突變會(huì)增加兒童患慢性腎盂腎炎的風(fēng)險(xiǎn)[4]。

        海南五指山豬是重要的試驗(yàn)動(dòng)物資源之一,也是國(guó)家試驗(yàn)用小型豬種質(zhì)資源中心的首選豬種,社會(huì)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值頗高。目前,尚未見(jiàn)到關(guān)于海南五指山豬TLR4基因克隆和相關(guān)功能結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的研究報(bào)道。因此,本研究于2016年6月以五指山豬為研究對(duì)象,利用克隆測(cè)序方法尋找五指山豬TLR4基因中的突變位點(diǎn),并利用生物信息學(xué)軟件對(duì)其序列進(jìn)行分析和功能預(yù)測(cè),為進(jìn)一步研究五指山豬TLR4的功能及其基因遺傳變異與免疫疾病的關(guān)系提供參考。

        1材料與方法

        1.1材料

        1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物與樣本采集

        選用10頭海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)所永發(fā)豬場(chǎng)的五指山豬作為研究對(duì)象,[JP3]采集血液樣品后,于-20 ℃保存于海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)所實(shí)驗(yàn)室備用。

        1.1.2主要試劑

        血液基因組DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒、重組質(zhì)粒抽提試劑盒,均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ、pMD18-T載體試劑盒,均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;克隆宿主菌JM109,由海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)所實(shí)驗(yàn)室提供。

        1.1.3引物設(shè)計(jì)與合成

        根據(jù)GenBank中TLR4基因序列(登錄號(hào)為AY753179.1)設(shè)計(jì)合成11對(duì)引物(表1),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

        1.2方法

        1.2.1DNA的提取

        按照血液基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA,取部分DNA樣品稀釋至100 ng/μL,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.2PCR擴(kuò)增

        PCR擴(kuò)增體系為:DNA模板2.0 μL,10×PCR Buffer(不含Mg2+)2.5 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)2.0 μL,MgCl2(25 mmol/L)2.0 μL,Ex Taq聚合酶(5 U/μL)0.5 μL,P1(10 pmol/L)0.5 μL,P2(10 pmol/L)0.5 μL,無(wú)菌去離子H2O 15 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃ 變性50 s,退火50 s(退火溫度見(jiàn)表1),72 ℃延伸 2 min,30 個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

        1.2.3基因克隆及序列測(cè)定

        利用膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物,將其連接到pMD18-T easy載體,再轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞后,涂布含有IPTG、X-gal和氨芐青霉素的平板,37 ℃培養(yǎng),挑取白斑接種于LB培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)后,經(jīng)菌液PCR和酶切鑒定正確的送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

        1.2.4生物信息學(xué)分析

        利用DNAMAN軟件對(duì)DNA序列進(jìn)行比對(duì)拼接; 應(yīng)用NCBI的ORF Finder程序?qū)ふ倚蛄械拈_(kāi)

        放閱讀框;利用MEGA(6.0)軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù);利用ProtParam(http://web. expasy. org / protparam/)程序、Protscale軟件、NetPhos 2.0 TMHMM程序、NetNGlyc(http:// www.cbs.dtu.dk/services/ NetPhos /)程序分析蛋白的特性,利用Signal P 4.1 Server 程序預(yù)測(cè)信號(hào)肽;利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/ services/ TMHMM)軟件預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域;利用SOPMA程序(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat. pl? page =npsa_sopma. html)、SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/)分析蛋白的結(jié)構(gòu);通過(guò)PSORT I1程序進(jìn)行亞細(xì)胞定位。

        2結(jié)果與分析

        2.1五指山豬TLR4基因的克隆

        使用11對(duì)引物擴(kuò)增五指山豬TLR4基因,分別獲得長(zhǎng)度為370、1 406、1 477、1 960、1 428、1 661、1 618、1 284、1 248、1 396、1 433 bp的DNA序列(圖1)。

        2.2五指山豬TLR4基因組序列分析

        測(cè)序拼接后獲得全長(zhǎng)為10 435 bp的五指山豬TLR4基因DNA序列,其中CDS長(zhǎng)2 526 bp,編碼841個(gè)氨基酸(圖2)。與GenBank發(fā)布的普通豬TLR4基因序列相比,存在38處突變(表2);其中在CDS區(qū)序列存在2處突變,1處為無(wú)義突變,在7 779位點(diǎn)由G突變?yōu)锳,不引起氨基酸變化;另1處為有義突變,7 781位點(diǎn)由G突變?yōu)锳,氨基酸由精氨酸變?yōu)榻M氨酸。

        2.3五指山豬TLR4氨基酸序列的同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

        由圖3可知,五指山豬TLR4基因氨基酸序列同GenBank中已發(fā)布的普通豬(登錄號(hào)AAW82895.1)、牛(登錄號(hào)NP_776623.5)、綿羊(登錄號(hào)NP_001129402.1)的氨基酸序列的同源性較高,分別為99.9%、80.7%、79.9%;與犬(登錄號(hào)NP_001002950.2)、馬(登錄號(hào)NP_001093239.2)、獼猴(登錄號(hào)NP_001032169.1)、人(登錄號(hào)NP_003257.1)、黑猩猩(登錄號(hào)BAG55036.1)、小鼠(登錄號(hào)NP_067272.1)的同源性[CM(25]稍低,分別為74.8%、74.7%、73.1%、73%、72.7%、

        62.5%;與雞(登錄號(hào)ACR26315.1)的同源性最低,為 43.4%。采用MEGA 6.0軟件的NJ法系統(tǒng)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù),結(jié)果(圖3)顯示,五指山豬TLR4基因與普通豬的親緣關(guān)系最近,隨后依次是綿羊、牛、犬、馬、獼猴、人、黑猩猩、小鼠和雞。

        2.4五指山豬TLR4蛋白理化特性分析

        經(jīng)ProtParam軟件在線預(yù)測(cè)顯示,五指山豬TLR4蛋白分子量為96 312.93 u,等電點(diǎn)為6.12,分子式為 C4 378H6 808N1 146O1 241S30。其氨基酸組成及比例分別為:丙氨酸(Ala,4.4%)、精氨酸(Arg,3.4%)、天冬酰胺(Asn,6.7%)、天冬氨酸(Asp,4.6%) 、半胱氨酸(Cys,2.3%)、谷氨酰胺(Gln,5.2%)、谷氨酸(Glu,5.7%)、甘氨酸(Gly,3.7%)、組氨酸(His,3.9%)、異亮氨酸(Ile,5.6%)、亮氨酸(Leu,16.1%) 、賴(lài)氨酸(Lys,5.1%)、甲硫氨酸(Met,1.3%)、苯丙氨酸(Phe,6.7%)、脯氨酸(Pro,3.7%)、絲氨酸(Ser,8.6%)、蘇氨酸(Thr,3.8%)、色氨酸(Trp,1.1%)、酪氨酸(Tyr,2.5%)、結(jié)氨酸(Val,5.7%)、吡咯賴(lài)氨酸(Pyl,0.0)、硒半胱氨酸(Sec,0.0)。SignalP-4.1軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),五指山豬TLR4蛋白有信號(hào)肽序列,說(shuō)明其為分泌性蛋白(圖5-A)。經(jīng)Prot Scale軟件分析發(fā)現(xiàn),五指山豬TLR4蛋白841個(gè)氨基酸當(dāng)中疏水性氨基酸最大值為2.811,親水性氨基酸最小值為-2.867,大多數(shù)氨基酸為親水性,屬于親水性蛋白(圖5-B)。利用Tmhmm軟件分析發(fā)現(xiàn),五指山豬TLR4有1個(gè)跨膜區(qū),屬于跨膜蛋白(圖5-C)。

        2.5五指山豬TLR4蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

        應(yīng)用SOPMA程序預(yù)測(cè)五指山豬TLR4蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)[CM(25]現(xiàn),五指山豬TLR4蛋白主要由α-螺旋(47.44%)、延伸鏈(17.36%)、β-轉(zhuǎn)角(8.44%)和無(wú)規(guī)則卷曲(26.75%)組成(圖6)。利用SWISS-MODEL在線軟件對(duì)五指山豬TLR4蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)后發(fā)現(xiàn),TLR4蛋白主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成(圖7),與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相符。

        2.6五指山豬TLR4蛋白亞細(xì)胞定位、磷酸化和糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)及功能預(yù)測(cè)分析

        定位分析發(fā)現(xiàn),五指山豬TLR4蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、膜泡分泌系統(tǒng)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)、質(zhì)膜中均有分布,其比例分別為33.30%、22.20%、11.10%、11.10%、11.10%和 11.11%,其中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中分布最多。磷酸化分析顯示,五指山豬TLR4蛋白存在17個(gè)絲氨酸(ser)、7個(gè)蘇氨酸(Thr)和8個(gè)酪氨酸(TYR)磷酸化位點(diǎn)。糖基化位點(diǎn)分析表明,五指山豬TLR4蛋白存在8個(gè)糖基化修飾位點(diǎn),分別位于氨基酸序列的第35、第205、第238、第282、第309、第526、第575和第625位。

        3討論與結(jié)論

        TLR4在天然免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、炎癥和組織損傷修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,不僅可以識(shí)別細(xì)菌脂多糖,還可被損傷誘發(fā)的內(nèi)源性介質(zhì)激活[5]。雖然大量研究都選擇TLR4基因作為抗病的候選基因進(jìn)行研究,但TLR4基因的變異與疾病的確切關(guān)系還不清楚。

        本研究采用PCR法克隆了五指山豬的TLR4基因,序列分析結(jié)果顯示,五指山豬TLR4基因DNA序列長(zhǎng)10 435 bp,其中CDS長(zhǎng)為2 526 bp,共編碼841個(gè)氨基酸。與GenBank發(fā)布的普通豬TLR4基因序列相比,存在38處突變;其中在CDS區(qū)序列存在2處突變(1處為無(wú)義突變,另1處為有義突變,氨基酸由精氨酸變?yōu)榻M氨酸),說(shuō)明五指山豬與普通豬TLR4基因的生物學(xué)功能可能存在一些差異。同源性分析結(jié)果顯示,五指山豬TLR4基因氨基酸序列同普通豬、牛、綿羊、犬、馬、獼猴、人、黑猩猩、小鼠和雞的同源性分別為99.9%、80.7%、79.9%、74.8%、74.7%、73.1%、73.0%、72.7%、62.5%、43.4%,說(shuō)明TLR4基因在不同物種間相對(duì)保守,但仍存在著一定的種屬特異性。

        蛋白質(zhì)的功能與其空間結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系[6]。研究分析發(fā)現(xiàn),五指山豬TLR4蛋白主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成。其中α-螺旋是蛋白質(zhì)中常見(jiàn)的、 含量也最豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)原件,而無(wú)規(guī)則卷曲通常會(huì)構(gòu)建成特性功能部位或是酶活性部位[7]。五指山豬TLR4蛋白有信號(hào)肽序列,說(shuō)明其為分泌性蛋白;有1個(gè)跨膜區(qū),說(shuō)明其為跨膜蛋白,可能參與信號(hào)傳導(dǎo);蛋白中有許多親水性氨基酸,因而該蛋白也具有親水性。

        磷酸化和糖基化是生物體蛋白質(zhì)翻譯后常見(jiàn)的修飾方式,廣泛參與調(diào)節(jié)許多生命活動(dòng)[8-9],如干擾機(jī)體對(duì)抗原的應(yīng)答反應(yīng),影響病毒的體外增殖[10]。對(duì)五指山豬TLR4蛋白進(jìn)行磷酸化和糖基化位點(diǎn)分析后發(fā)現(xiàn),五指山豬TLR4蛋白存在17個(gè)絲氨酸、7個(gè)蘇氨酸和8個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn),有8個(gè)糖基化修飾位點(diǎn),但這些磷酸化和糖基化修飾位點(diǎn)對(duì)該基因的作用內(nèi)容還須進(jìn)一步深入研究。

        參考文獻(xiàn):

        [1]Zhou Y,Li Y B,Zhou B,et al. Inflammation and apoptosis:dual mediator role for toll-like receptor 4 in the development of necrotizing enterocolitis[J]. Inflammatory Bowel Diseases,2017,23(1):44-56.

        [2]Knobloch J,Chikosi S J,Yanik S,et al. A systemic defect in Toll-like receptor 4 signaling increases lipopolysaccharide-induced suppression of IL-2-dependent T-cell proliferation in COPD[J]. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology,2016,310(1):L24-L39.

        [3]Elliott D R,Perner J,Li X A,et al. Impact of mutations in Toll-like receptor pathway genes on esophageal carcinogenesis[J]. PLoS Genetics,2017,13(5):e1006808.

        [4]Harshman V P,Kryuchko T O,Kolenko I O,et al. Role of genetic mutations in development of immunological and clinical disorders in children with chronic pyelonephritis[J]. Wiadomosci Lekarskie,2017,70(1):47-51.

        [5]Mckeown-Longo P J,Higgins P J. Integration of canonical and noncanonical pathways in TLR4 signaling:complex regulation of the wound repair program[J]. Advances in Wound Care,2017,6(10):320-329.

        [6]王鏡巖,朱圣庚,徐長(zhǎng)法. 生物化學(xué)[M]. 北京:高等教育出版社,2002.

        [7]丁咚,劉錚鑄,李蘊(yùn)玉,等. 羅斯308雞IL-2基因的克隆及生物信息學(xué)分析[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī),2015,12(23):90-94,314.

        [8]周蕾,顧建新. N-糖基化位點(diǎn)鑒定方法和非經(jīng)典N(xiāo)-糖基化序列[J]. 生命科學(xué),2011,23(6):605-611.

        [9]阮班軍,代鵬,王偉,等. 蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào),2014,36(7):1027-1037.

        [10]韋薇,項(xiàng)金忠,羅建輝. 真核細(xì)胞表達(dá)重組蛋白糖基化研究與評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)新藥雜志,2014,23(15):1743-1748.

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