黃麗麗　張艷　劉海隆　林哲敏　譚樹(shù)義

摘要：為獲得海南五指山豬TLR4基因序列并分析其分子結(jié)構(gòu)特征，以GenBank中豬的TLR4基因序列為參考序列，采用PCR技術(shù)對(duì)該基因組序列進(jìn)行克隆、測(cè)序及相關(guān)生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，獲得的五指山豬TLR4基因DNA序列長(zhǎng)10 435 bp，其中編碼區(qū)全長(zhǎng)2 526 bp，共編碼841個(gè)氨基酸;與GenBank中發(fā)布的普通豬的TLR4基因序列相比，存在38處突變（其中有2處突變位于編碼區(qū)）;與普通豬、牛、綿羊、犬、馬、獼猴、人、黑猩猩、小鼠和雞的同源性分別為99.9%、80.7%、79.9%、74.8%、74.7%、73.1%、73%、72.7%、62.5%、43.4%;五指山豬TLR4編碼的蛋白屬于分泌性蛋白和跨膜蛋白，具有親水性，有8個(gè)糖基化修飾位點(diǎn)、17個(gè)絲氨酸（ser）、7個(gè)蘇氨酸（Thr）及8個(gè)酪氨酸（TYR）磷酸化位點(diǎn);氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，不同物種TLR4基因在進(jìn)化過(guò)程中具有較高的保守性。該結(jié)果為進(jìn)一步深入研究TLR4基因的功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：五指山豬;TLR4基因;克隆;生物信息學(xué)分析

中圖分類(lèi)號(hào)： S828.1;Q785文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）08-0041-05

Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）是一種模式識(shí)別受體，其可特異性地識(shí)別革蘭氏陰性菌表達(dá)的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）或脂質(zhì)A（LPS的活性成分），快速啟動(dòng)免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)各種炎性介質(zhì)釋放，激活相關(guān)免疫細(xì)胞來(lái)抵抗微生物的入侵，在動(dòng)物機(jī)體的免疫反應(yīng)和炎癥等方面起重要作用[1]。目前，TLR4基因在免疫和感染領(lǐng)域研究較熱。大量研究表明，TLR4基因的缺失或突變可能會(huì)誘發(fā)細(xì)胞對(duì)LPS的反應(yīng)性減弱或喪失，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)疾病易感性增加。如TLR4基因缺失會(huì)加重慢性阻塞性肺炎患者的肺損傷[2];近端腫瘤和轉(zhuǎn)移性疾病的發(fā)生與TLR4基因的突變相關(guān)[3];TLR4基因突變會(huì)增加兒童患慢性腎盂腎炎的風(fēng)險(xiǎn)[4]。

海南五指山豬是重要的試驗(yàn)動(dòng)物資源之一，也是國(guó)家試驗(yàn)用小型豬種質(zhì)資源中心的首選豬種，社會(huì)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值頗高。目前，尚未見(jiàn)到關(guān)于海南五指山豬TLR4基因克隆和相關(guān)功能結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的研究報(bào)道。因此，本研究于2016年6月以五指山豬為研究對(duì)象，利用克隆測(cè)序方法尋找五指山豬TLR4基因中的突變位點(diǎn)，并利用生物信息學(xué)軟件對(duì)其序列進(jìn)行分析和功能預(yù)測(cè)，為進(jìn)一步研究五指山豬TLR4的功能及其基因遺傳變異與免疫疾病的關(guān)系提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物與樣本采集

選用10頭海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)所永發(fā)豬場(chǎng)的五指山豬作為研究對(duì)象，[JP3]采集血液樣品后，于-20 ℃保存于海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)所實(shí)驗(yàn)室備用。

1.1.2主要試劑

血液基因組DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒、重組質(zhì)粒抽提試劑盒，均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ、pMD18-T載體試劑盒，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司;克隆宿主菌JM109，由海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)所實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中TLR4基因序列（登錄號(hào)為AY753179.1）設(shè)計(jì)合成11對(duì)引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2方法

1.2.1DNA的提取

按照血液基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA，取部分DNA樣品稀釋至100 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增體系為：DNA模板2.0 μL，10×PCR Buffer（不含Mg2+）2.5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2.0 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.0 μL，Ex Taq聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，P1（10 pmol/L）0.5 μL，P2（10 pmol/L）0.5 μL，無(wú)菌去離子H2O 15 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃ 變性50 s，退火50 s（退火溫度見(jiàn)表1），72 ℃延伸 2 min，30 個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3基因克隆及序列測(cè)定

利用膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，將其連接到pMD18-T easy載體，再轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞后，涂布含有IPTG、X-gal和氨芐青霉素的平板，37 ℃培養(yǎng)，挑取白斑接種于LB培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)后，經(jīng)菌液PCR和酶切鑒定正確的送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.4生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN軟件對(duì)DNA序列進(jìn)行比對(duì)拼接; 應(yīng)用NCBI的ORF Finder程序?qū)ふ倚蛄械拈_(kāi)

放閱讀框;利用MEGA（6.0）軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù);利用ProtParam（http：//web. expasy. org / protparam/）程序、Protscale軟件、NetPhos 2.0 TMHMM程序、NetNGlyc（http：// www.cbs.dtu.dk/services/ NetPhos /）程序分析蛋白的特性，利用Signal P 4.1 Server 程序預(yù)測(cè)信號(hào)肽;利用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/ TMHMM）軟件預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域;利用SOPMA程序（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat. pl？ page =npsa_sopma. html）、SWISS-MODEL （http：//swissmodel.expasy.org/）分析蛋白的結(jié)構(gòu);通過(guò)PSORT I1程序進(jìn)行亞細(xì)胞定位。

2結(jié)果與分析

2.1五指山豬TLR4基因的克隆

使用11對(duì)引物擴(kuò)增五指山豬TLR4基因，分別獲得長(zhǎng)度為370、1 406、1 477、1 960、1 428、1 661、1 618、1 284、1 248、1 396、1 433 bp的DNA序列（圖1）。

2.2五指山豬TLR4基因組序列分析

測(cè)序拼接后獲得全長(zhǎng)為10 435 bp的五指山豬TLR4基因DNA序列，其中CDS長(zhǎng)2 526 bp，編碼841個(gè)氨基酸（圖2）。與GenBank發(fā)布的普通豬TLR4基因序列相比，存在38處突變（表2）;其中在CDS區(qū)序列存在2處突變，1處為無(wú)義突變，在7 779位點(diǎn)由G突變?yōu)锳，不引起氨基酸變化;另1處為有義突變，7 781位點(diǎn)由G突變?yōu)锳，氨基酸由精氨酸變?yōu)榻M氨酸。

2.3五指山豬TLR4氨基酸序列的同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

由圖3可知，五指山豬TLR4基因氨基酸序列同GenBank中已發(fā)布的普通豬（登錄號(hào)AAW82895.1）、牛（登錄號(hào)NP_776623.5）、綿羊（登錄號(hào)NP_001129402.1）的氨基酸序列的同源性較高，分別為99.9%、80.7%、79.9%;與犬（登錄號(hào)NP_001002950.2）、馬（登錄號(hào)NP_001093239.2）、獼猴（登錄號(hào)NP_001032169.1）、人（登錄號(hào)NP_003257.1）、黑猩猩（登錄號(hào)BAG55036.1）、小鼠（登錄號(hào)NP_067272.1）的同源性[CM（25]稍低，分別為74.8%、74.7%、73.1%、73%、72.7%、

62.5%;與雞（登錄號(hào)ACR26315.1）的同源性最低，為 43.4%。采用MEGA 6.0軟件的NJ法系統(tǒng)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖3）顯示，五指山豬TLR4基因與普通豬的親緣關(guān)系最近，隨后依次是綿羊、牛、犬、馬、獼猴、人、黑猩猩、小鼠和雞。

2.4五指山豬TLR4蛋白理化特性分析

經(jīng)ProtParam軟件在線預(yù)測(cè)顯示，五指山豬TLR4蛋白分子量為96 312.93 u，等電點(diǎn)為6.12，分子式為 C4 378H6 808N1 146O1 241S30。其氨基酸組成及比例分別為：丙氨酸（Ala，4.4%）、精氨酸（Arg，3.4%）、天冬酰胺（Asn，6.7%）、天冬氨酸（Asp，4.6%） 、半胱氨酸（Cys，2.3%）、谷氨酰胺（Gln，5.2%）、谷氨酸（Glu，5.7%）、甘氨酸（Gly，3.7%）、組氨酸（His，3.9%）、異亮氨酸（Ile，5.6%）、亮氨酸（Leu，16.1%） 、賴(lài)氨酸（Lys，5.1%）、甲硫氨酸（Met，1.3%）、苯丙氨酸（Phe，6.7%）、脯氨酸（Pro，3.7%）、絲氨酸（Ser，8.6%）、蘇氨酸（Thr，3.8%）、色氨酸（Trp，1.1%）、酪氨酸（Tyr，2.5%）、結(jié)氨酸（Val，5.7%）、吡咯賴(lài)氨酸（Pyl，0.0）、硒半胱氨酸（Sec，0.0）。SignalP-4.1軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，五指山豬TLR4蛋白有信號(hào)肽序列，說(shuō)明其為分泌性蛋白（圖5-A）。經(jīng)Prot Scale軟件分析發(fā)現(xiàn)，五指山豬TLR4蛋白841個(gè)氨基酸當(dāng)中疏水性氨基酸最大值為2.811，親水性氨基酸最小值為-2.867，大多數(shù)氨基酸為親水性，屬于親水性蛋白（圖5-B）。利用Tmhmm軟件分析發(fā)現(xiàn)，五指山豬TLR4有1個(gè)跨膜區(qū)，屬于跨膜蛋白（圖5-C）。

2.5五指山豬TLR4蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

應(yīng)用SOPMA程序預(yù)測(cè)五指山豬TLR4蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)[CM（25]現(xiàn)，五指山豬TLR4蛋白主要由α-螺旋（47.44%）、延伸鏈（17.36%）、β-轉(zhuǎn)角（8.44%）和無(wú)規(guī)則卷曲（26.75%）組成（圖6）。利用SWISS-MODEL在線軟件對(duì)五指山豬TLR4蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)后發(fā)現(xiàn)，TLR4蛋白主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成（圖7），與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相符。

2.6五指山豬TLR4蛋白亞細(xì)胞定位、磷酸化和糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)及功能預(yù)測(cè)分析

定位分析發(fā)現(xiàn)，五指山豬TLR4蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、膜泡分泌系統(tǒng)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)、質(zhì)膜中均有分布，其比例分別為33.30%、22.20%、11.10%、11.10%、11.10%和 11.11%，其中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中分布最多。磷酸化分析顯示，五指山豬TLR4蛋白存在17個(gè)絲氨酸（ser）、7個(gè)蘇氨酸（Thr）和8個(gè)酪氨酸（TYR）磷酸化位點(diǎn)。糖基化位點(diǎn)分析表明，五指山豬TLR4蛋白存在8個(gè)糖基化修飾位點(diǎn)，分別位于氨基酸序列的第35、第205、第238、第282、第309、第526、第575和第625位。

3討論與結(jié)論

TLR4在天然免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、炎癥和組織損傷修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，不僅可以識(shí)別細(xì)菌脂多糖，還可被損傷誘發(fā)的內(nèi)源性介質(zhì)激活[5]。雖然大量研究都選擇TLR4基因作為抗病的候選基因進(jìn)行研究，但TLR4基因的變異與疾病的確切關(guān)系還不清楚。

本研究采用PCR法克隆了五指山豬的TLR4基因，序列分析結(jié)果顯示，五指山豬TLR4基因DNA序列長(zhǎng)10 435 bp，其中CDS長(zhǎng)為2 526 bp，共編碼841個(gè)氨基酸。與GenBank發(fā)布的普通豬TLR4基因序列相比，存在38處突變;其中在CDS區(qū)序列存在2處突變（1處為無(wú)義突變，另1處為有義突變，氨基酸由精氨酸變?yōu)榻M氨酸），說(shuō)明五指山豬與普通豬TLR4基因的生物學(xué)功能可能存在一些差異。同源性分析結(jié)果顯示，五指山豬TLR4基因氨基酸序列同普通豬、牛、綿羊、犬、馬、獼猴、人、黑猩猩、小鼠和雞的同源性分別為99.9%、80.7%、79.9%、74.8%、74.7%、73.1%、73.0%、72.7%、62.5%、43.4%，說(shuō)明TLR4基因在不同物種間相對(duì)保守，但仍存在著一定的種屬特異性。

蛋白質(zhì)的功能與其空間結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系[6]。研究分析發(fā)現(xiàn)，五指山豬TLR4蛋白主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成。其中α-螺旋是蛋白質(zhì)中常見(jiàn)的、 含量也最豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)原件，而無(wú)規(guī)則卷曲通常會(huì)構(gòu)建成特性功能部位或是酶活性部位[7]。五指山豬TLR4蛋白有信號(hào)肽序列，說(shuō)明其為分泌性蛋白;有1個(gè)跨膜區(qū)，說(shuō)明其為跨膜蛋白，可能參與信號(hào)傳導(dǎo);蛋白中有許多親水性氨基酸，因而該蛋白也具有親水性。

磷酸化和糖基化是生物體蛋白質(zhì)翻譯后常見(jiàn)的修飾方式，廣泛參與調(diào)節(jié)許多生命活動(dòng)[8-9]，如干擾機(jī)體對(duì)抗原的應(yīng)答反應(yīng)，影響病毒的體外增殖[10]。對(duì)五指山豬TLR4蛋白進(jìn)行磷酸化和糖基化位點(diǎn)分析后發(fā)現(xiàn)，五指山豬TLR4蛋白存在17個(gè)絲氨酸、7個(gè)蘇氨酸和8個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，有8個(gè)糖基化修飾位點(diǎn)，但這些磷酸化和糖基化修飾位點(diǎn)對(duì)該基因的作用內(nèi)容還須進(jìn)一步深入研究。

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