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        響應(yīng)面法優(yōu)化牡丹花化學(xué)成分提取工藝的研究

        2019-08-20 14:58:33崔莉趙恒強(qiáng)耿巖玲王志偉王曉閆慧嬌
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年8期
        關(guān)鍵詞:響應(yīng)面法提取工藝牡丹花

        崔莉 趙恒強(qiáng) 耿巖玲 王志偉 王曉 閆慧嬌

        摘要:為了確定牡丹花化學(xué)成分提取的最佳工藝條件,從化學(xué)成分的穩(wěn)定性和操作的便捷性考慮,用超聲法對(duì)牡丹花的提取工藝進(jìn)行研究。以液相色譜圖中14個(gè)共有峰的總峰面積為指標(biāo),分別考察超聲提取時(shí)間、乙醇濃度、液料比對(duì)牡丹花多種化學(xué)成分共同提取效果的影響,用響應(yīng)面法優(yōu)化牡丹花的超聲提取工藝。結(jié)果表明,乙醇濃度對(duì)牡丹花提取效果的影響最大,其次是液料比與超聲時(shí)間,用響應(yīng)面法優(yōu)化得到牡丹花超聲提取的最適工藝條件如下:乙醇濃度為 60.92%,液料比為86.21 mL ∶1 g,超聲時(shí)間為24.34 min。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在此最佳提取條件下,色譜圖中共有峰峰面積的總和與預(yù)測(cè)值相近,可見通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化得到的牡丹花化學(xué)成分提取工藝穩(wěn)定、可行。

        關(guān)鍵詞:牡丹花;提取工藝;超聲法;響應(yīng)面法;Box-Behnken設(shè)計(jì)

        中圖分類號(hào): R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

        文章編號(hào):1002-1302(2019)08-0212-05

        牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)為毛茛科芍藥屬灌木,有“富貴花”和“花中之王”的美稱,是中華民族傳統(tǒng)文化的重要組成部分,享有“國(guó)花”的盛譽(yù)[1]。牡丹花在我國(guó)有悠久的藥用和食用歷史,《四川中藥志》中記載:牡丹花性平、苦、淡,具有調(diào)經(jīng)活血的功能,主治月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)[2]。明代的《遵生八菚》中曾記載:“牡丹新落花瓣亦可煎食”。清代的《養(yǎng)小錄》中記載:“牡丹花瓣,湯淖可,蜜浸可,肉汁燴亦可”,2013年,丹鳳牡丹花被中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)(現(xiàn)為中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì))批準(zhǔn)為新食品原料[3],是我國(guó)寶貴的天然植物資源。然而,在傳統(tǒng)的牡丹產(chǎn)業(yè)中,牡丹花常被當(dāng)作廢棄物丟棄,造成巨大的浪費(fèi)。

        牡丹花中的活性成分種類較多,含量豐富,現(xiàn)代研究證明,這些成分具有活血、殺菌、抗氧化等多種活性[4-7]。在前期研究中,筆者對(duì)牡丹花的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)分離,發(fā)現(xiàn)其次生代謝產(chǎn)物主要包括黃酮類、沒(méi)食子酸類、鞣質(zhì)類及其芍藥苷類單萜苷類化合物[8-11]。而目前有關(guān)牡丹花化學(xué)成分提取的研究多針對(duì)黃酮類,且以總黃酮提取率作為方法優(yōu)劣的判斷標(biāo)準(zhǔn)[12-15],無(wú)法為全面表征牡丹花的生物活性物質(zhì)基礎(chǔ),從而從整體上評(píng)價(jià)牡丹花的質(zhì)量提供參考。響應(yīng)面設(shè)計(jì)(response surface methodology,簡(jiǎn)稱RSM)是一種有效的統(tǒng)計(jì)和優(yōu)化方法,在試驗(yàn)條件優(yōu)化的過(guò)程中可以連續(xù)地對(duì)試驗(yàn)因素的各個(gè)水平進(jìn)行分析,并能給出直觀的圖形[16-21]。筆者在前期對(duì)牡丹花的化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上,對(duì)其主要化學(xué)成分進(jìn)行了辨認(rèn),并以液相色譜中的共有峰(包括黃酮類、沒(méi)食子酸、鞣質(zhì)類、芍藥苷)的總峰面積為響應(yīng)值,運(yùn)用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì),對(duì)牡丹花提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,擬為牡丹花資源的綜合開發(fā)利用及質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

        1材料與方法

        1.1儀器與材料

        Agilent 1120型高效液相色譜儀[配有二極管陣列(DAD)檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器,美國(guó)Agilent公司];KQ3200超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司);JJ1000型電子天平(常熟市雙杰測(cè)試儀器廠)。

        牡丹花采自山東菏澤,于2017年4月采收新鮮丹鳳牡丹的花瓣,于50 ℃熱風(fēng)烘干,粉碎過(guò)40目篩,在山東省分析測(cè)試中心實(shí)驗(yàn)室的干燥器內(nèi)避光保存。主要試劑如下:乙醇,分析純,購(gòu)自德州恒業(yè)化工有限公司;甲醇、乙腈,色譜純,購(gòu)自山東禹王試劑有限公司;甲酸,色譜純,購(gòu)自德國(guó)Riedel公司;其余試劑均為分析純。試驗(yàn)用水為超純水。對(duì)照品芍藥苷、野漆樹苷、紫云英苷,購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;1-O-galloyl-β-D-glucopyranose(1-O-沒(méi)食子?;?β-D葡萄糖)、1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose(1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子?;?β-D葡萄糖)、kaempferol-3,7-di-O-β-D-glucopyranoside(山柰酚-3,7-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)、沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸甲酯、大波斯菊苷、二氫山柰酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、氧化芍藥苷由筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離、純化后,經(jīng)核磁、質(zhì)譜、紅外、紫外鑒定,純度均達(dá)99%(相對(duì)純度)以上。

        1.2試驗(yàn)方法

        1.2.1對(duì)照品溶液的制備分別取適量1-O-沒(méi)食子?;?β-D葡萄糖、沒(méi)食子酸、氧化芍藥苷、沒(méi)食子酸甲酯、二氫山柰酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、山柰酚-3,7-二-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、芍藥苷、1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子?;?β-D葡萄糖、野漆樹苷、紫云英苷、大波斯菊苷這11種對(duì)照品,加甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為45.5、45.2、60.0、25.3、25.4、60.0、720.0、61.0、101.0、60.0、81.2 mg/L的混合對(duì)照品溶液。

        1.2.2液相色譜條件采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,簡(jiǎn)稱HPLC),色譜柱采用Micro C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。以0.1%甲酸 (A)- 乙腈(B)溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫:0~5 min,5% B;5~8 min,5%~12% B;8~23 min,12% B;23~24 min,12%~15% B;24~30 min,15% B;30~31 min,15%~21% B;31~38 min,21% B;38~39 min,21%~22% B;39~48 min,22% B;48~53 min,22%~34% B;53~63 min,34% B;63~64 min,34%~90% B;64~69 min,90% B;流量為 1.0 mL/min;進(jìn)樣量為10 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。

        1.2.3牡丹花瓣提取方法的選擇精確稱取10份牡丹花瓣粉末,每份0.50 g,置于具塞錐形瓶中,各加入50 mL溶劑,稱定質(zhì)量,其中5份樣品分別用50%乙醇于65 ℃浸提0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h,另外5份樣品分別用50%乙醇超聲提取5、10、30、50、70 min。提取后靜置至室溫,稱量并補(bǔ)足至提取前的質(zhì)量,用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,取濾液,按照“1.2.2”節(jié)的方法進(jìn)樣檢測(cè)。

        1.2.4牡丹花瓣超聲提取法的工藝流程精確稱取10份牡丹花瓣粉末,每份0.50 g,置于具塞錐形瓶中,加入50 mL不同濃度的乙醇,稱質(zhì)量,超聲提取(250 W,40 kHz),冷卻至室溫,稱量并補(bǔ)足至提取前的質(zhì)量,搖勻。用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,作為供試品溶液。

        1.2.5牡丹花瓣超聲提取工藝參數(shù)的單因素試驗(yàn)分別考察不同超聲提取時(shí)間(10、20、30、40、50 min)、乙醇濃度(20%、40%、60%、80%、100%)和液料比(20 mL ∶1 g、50 mL ∶1 g、100 mL ∶1 g、200 mL ∶1 g、500 mL ∶1 g)對(duì)牡丹花瓣提取效率的影響。

        1.2.6響應(yīng)面法優(yōu)化牡丹花超聲提取工藝試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,確定液料比、乙醇濃度和超聲時(shí)間3個(gè)因素的水平,用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。具體試驗(yàn)因素與各水平設(shè)計(jì)見表1。

        2結(jié)果與分析

        2.1牡丹花化學(xué)成分的分析

        在前期對(duì)牡丹花化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)分離的基礎(chǔ)上,通過(guò)與對(duì)照品進(jìn)行高效液相色譜比對(duì),對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行了分析,共確定14個(gè)共有峰中的11個(gè)成分,圖1中的1號(hào)峰為1-O-galloyl-β-D-glucopyranose,2號(hào)峰為沒(méi)食子酸,3號(hào)峰為氧化芍藥苷,4號(hào)峰為沒(méi)食子酸甲酯,5號(hào)峰為二氫山柰酚-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷,6號(hào)峰為kaempferol-3,7-di-O-β-D-glucopyranoside,7號(hào)峰為芍藥苷,9號(hào)峰為1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose,11號(hào)峰為野漆樹苷,12號(hào)峰為紫云英苷,13號(hào)峰為大波斯菊苷。

        2.2牡丹花瓣化學(xué)成分提取方法的選擇

        選擇色譜圖中信噪比(S/N)>30的14個(gè)共有峰作為評(píng)價(jià)指標(biāo),以50%乙醇超聲處理20 min的單位樣品峰面積為1,計(jì)算不同處理方法下樣品的共有峰峰面積提取率,并進(jìn)行比較。從圖2可以看出,不同提取方法對(duì)各共有峰的峰面積影響不明顯,超聲法提取率稍高于溫浸法,9號(hào)峰的峰面積提取率在20 min、1 h最高,但是隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),提取率反而下降,而1、2號(hào)峰則相反。通過(guò)與對(duì)照品圖譜對(duì)應(yīng)保留時(shí)間(圖1-a)的對(duì)比可初步推測(cè),1號(hào)峰為1-O-galloyl-β-D-glucopyranose,2號(hào)峰為沒(méi)食子酸,9號(hào)峰為1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose,可能由于提取時(shí)間的延長(zhǎng),部分沒(méi)食子酰鞣質(zhì)發(fā)生水解,生成沒(méi)食子酸或沒(méi)食子?;咸烟恰目傮w上看,超聲法用時(shí)較短,考慮到操作的便捷性,選擇超聲法作為牡丹花化學(xué)成分的提取方法。

        2.3牡丹花瓣超聲提取工藝參數(shù)的單因素試驗(yàn)

        2.3.1液料比對(duì)提取效果的影響固定超聲時(shí)間為20 min,乙醇濃度為60%,選擇液料比20 mL ∶1 g、50 mL ∶1 g、100 mL ∶1 g、200 mL ∶1 g、500 mL ∶1 g進(jìn)行試驗(yàn)。以色譜圖中S/N>30的14個(gè)共有峰總峰面積為評(píng)價(jià)指標(biāo),由圖3-a可以看出, 隨著液料比的增加,共有峰的總峰面積逐漸增加,當(dāng)液料比大于100 mL ∶1 g時(shí),共有峰的總峰面積增勢(shì)變緩,提取趨于完全,考慮到成本及后處理,選擇100 mL ∶1 g作為較優(yōu)的液料比。

        考慮到在提取過(guò)程中會(huì)發(fā)生部分沒(méi)食子酰鞣質(zhì)水解生成沒(méi)食子酸或沒(méi)食子酰基葡萄糖的反應(yīng),這幾種成分的含量變化可反映不同參數(shù)條件對(duì)牡丹花化學(xué)成分提取效果的綜合影響,因此同時(shí)選擇1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose(9號(hào)峰)、沒(méi)食子酸(2號(hào)峰)的峰面積比值(峰9/峰2)作為評(píng)價(jià)指標(biāo),進(jìn)一步考察單因素試驗(yàn)的提取效果。圖3-b結(jié)果顯示,液料比對(duì)兩峰比值有一定的影響,隨著液料比的增加,兩峰面積比值逐漸提高,當(dāng)液料比大于 100 mL ∶1 g 時(shí),兩峰面積比值逐漸降低。

        2.3.2乙醇濃度對(duì)提取效果的影響固定液料比為 100 mL ∶1 g,超聲時(shí)間為20 min,選擇20%、40%、6%、80%、100%的乙醇濃度對(duì)牡丹花進(jìn)行提取試驗(yàn)。以色譜圖中S/N>30的14個(gè)共有峰總峰面積為評(píng)價(jià)指標(biāo),由圖4-a可以看出,當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí),共有峰的總峰面積達(dá)到峰值;當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí),提取效果又有所減弱。因此,選擇60%為最優(yōu)乙醇濃度。從9號(hào)峰、2號(hào)峰的峰面積比值來(lái)看,使用不同比例的溶劑提取時(shí),對(duì)兩者的提取效率不同,當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí),化合物9、化合物2的峰面積比值最大(圖4-b),推測(cè)是由于2種化合物的極性不同造成的。

        2.3.3超聲提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響固定液料比為100 mL ∶1 g,乙醇濃度為60%,選擇超聲時(shí)間為10、20、30、40、50 min 進(jìn)行試驗(yàn)。以色譜圖中S/N>30的14個(gè)共有峰總峰面積為評(píng)價(jià)指標(biāo),由圖5-a可以看出,超聲20 min后,總峰面積趨于平穩(wěn),基本實(shí)現(xiàn)了提取完全,50 min時(shí)則略有下降,可能由于超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng),導(dǎo)致提取溫度升高,牡丹花內(nèi)的部分化學(xué)成分發(fā)生了降解。由圖5-b可以看出,9號(hào)峰、2號(hào)峰的峰面積比值呈現(xiàn)先提高后降低的趨勢(shì),超聲提取20 min后,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),峰面積比值下降,部分沒(méi)食子酰鞣質(zhì)發(fā)生水解,生成沒(méi)食子酸或沒(méi)食子酰基葡萄糖。為更好地保持牡丹花化學(xué)成分的穩(wěn)定,同時(shí)節(jié)約能源,選擇20 min為最優(yōu)超聲時(shí)間。

        2.4響應(yīng)面法優(yōu)化牡丹花化學(xué)成分的超聲提取工藝試驗(yàn)

        根據(jù)Box-Behnken的組合設(shè)計(jì)原理,用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)3因素3水平共15個(gè)試驗(yàn),中心點(diǎn)重復(fù)3次試驗(yàn),以色譜圖中S/N>30的14個(gè)共有峰的總峰面積為響應(yīng)值(R),具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表2。

        用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中的綜合評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合,得到回歸方程:R=14 138.40+105.25[KG*3]×[KG*3]A+[KG*3]243.13[KG*9]×B+22.63×C-5.75×AB+13.75×AC+2.50×BC-84.45×A2-1 296.20×B2-36.20×C2。由表3的回歸模型方差分析結(jié)果可知,一次項(xiàng)A、B、C,二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)提取效果有極顯著影響。本試驗(yàn)?zāi)P偷腜<0.01,說(shuō)明響應(yīng)面的模型顯著性較高,而失擬誤差項(xiàng)的P>0.05,說(shuō)明響應(yīng)面模型對(duì)試驗(yàn)擬合的情況較好,試驗(yàn)誤差較小,可以很好地對(duì)牡丹花超聲提取效果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

        響應(yīng)面曲面可較直觀地反映各因素及兩兩因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響。由圖6可以看出,乙醇濃度對(duì)牡丹花提取效果的影響最大,其次是液料比,超聲時(shí)間對(duì)牡丹花提取效果的影響最小。液料比與超聲時(shí)間的交互作用對(duì)牡丹花提取效果的影響較大,其次為液料比與乙醇濃度的交互作用,乙醇濃度與超聲時(shí)間的交互作用影響最不明顯。

        2.5驗(yàn)證試驗(yàn)

        用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化得到牡丹花超聲提取的最佳工藝如下:液料比為86.21 mL ∶1 g,乙醇濃度為 60.92%,超聲時(shí)間為24.34 min,在此條件下總共有峰面積的預(yù)測(cè)值為14 189。為驗(yàn)證響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性,對(duì)模型[CM(25]優(yōu)化的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證。考慮到試驗(yàn)的可行性與便捷性,選擇液料比86 mL ∶1 g、乙醇濃度61%、超聲時(shí)間24 min進(jìn)行3次試驗(yàn)。由表4的驗(yàn)證結(jié)果可以看出,方程與真實(shí)試驗(yàn)情況擬合得較好,優(yōu)化的工藝可靠、可行。

        3結(jié)論與討論

        由于響應(yīng)面法是在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上得到相應(yīng)的點(diǎn),并從這些點(diǎn)中獲得1個(gè)完整、連續(xù)的面,再在此面中獲得最優(yōu)值。因此,在響應(yīng)面整體設(shè)計(jì)中,單因素試驗(yàn)中變量參數(shù)的選擇顯得格外關(guān)鍵。本研究先通過(guò)單因素試驗(yàn)選取提取時(shí)間、乙醇濃度、液料比3個(gè)工藝變量合適的參數(shù)水平。由于牡丹花中含有的芍藥苷等單萜苷類化合物及一些易水解的鞣質(zhì)類化合物對(duì)溫度較為敏感,在高溫下穩(wěn)定性較差,不宜使用高溫浸提,與本試驗(yàn)中提取方法初篩的結(jié)果相一致,并且超聲法具有提取效率高、操作簡(jiǎn)單、節(jié)能等優(yōu)點(diǎn),可作為較優(yōu)的牡丹花提取方法。

        本研究使用3因素3水平的響應(yīng)面分析法對(duì)牡丹花超聲提取工藝的提取時(shí)間、乙醇濃度、液料比進(jìn)行考察,獲得的最佳提取工藝條件為乙醇濃度60.92%、液料比86.21 mL ∶1 g、超聲時(shí)間24.34 min,并通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)證明了該條件參數(shù)的可行性,在該條件下,牡丹花化學(xué)成分的提取更為全面、充分,可用于牡丹花質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià),并可為牡丹的綜合利用、開發(fā)提供依據(jù)。

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