李 松 朱 捷 郭 威

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科,齊齊哈爾161041)

胃癌(Gastric cancer，GC)是常見的腫瘤疾病，預(yù)后效果差并且死亡率高。據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，全球胃癌的發(fā)病率近年來呈下降趨勢，但在癌癥發(fā)病率中仍居第5位、死亡率居第3位[1]。我國每年新發(fā)胃癌病例占全球新發(fā)數(shù)的42%，居消化道癌癥首位，死亡率居第2～3位[2]。隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)進步，各種分子靶向藥物的開展使用，胃癌的預(yù)后有所提高[3]。經(jīng)治療后早期胃癌有90%患者生存期超過5年[4]，而進展期患者僅約25%生存期超過5年[5]。胃癌的發(fā)病機制目前仍未研究清楚，多數(shù)學(xué)者比較認可Correa提出的模式：慢性胃炎-慢性萎縮性胃炎(Atrophic gastritis，AG)-胃黏膜腸上皮化生-不典型增生-胃癌[6]。這說明胃癌的發(fā)生可能是多步驟、多基因改變積累的結(jié)果，研究抑癌基因的異常表達對分析胃癌的發(fā)病過程具有重要作用。本研究觀察胃黏膜形態(tài)學(xué)，檢測在腸上皮化生情況下Musashi-1(Msi-1)和再生基因(Reg4)的表達。目前關(guān)于研究Msi-1、Reg4與腸上皮化生的關(guān)系研究甚少，所以本實驗具有一定創(chuàng)新性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象 收集2016年8月至2017年10月在齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科內(nèi)鏡中心胃鏡檢查出的胃竇活檢標本218例。年齡為22～73歲，平均(44.3±0.6)歲。經(jīng)病理證實，共取得腸化隆起灶(Superficial elevated mucosa lesins group of atrophic gastritis with intestinal metaplasia,EIM)48例，腸化凹陷灶(Superficial depressed mucosa lesins group of atrophic gastritis with intestinal metaplasia,DIM)48例，非萎縮性胃炎(Non atrophic gastritis，NAG) 45例，AG 39例，胃竇癌38例。其中對同一患者取EIM和DIM標本20例。胃癌患者均未進行放化療，其他胃炎患者均未使用黏膜保護劑、抑酸劑等藥物治療，進行胃鏡檢查前患者簽署知情同意書，且獲得我院倫理委員會審批。

我們在典型的腸上皮化生病灶中分別進行EIM和DIM黏膜標本取樣。EIM和DIM形狀均不規(guī)則，成點狀、片狀；分布上來看，在DIM周圍常分布有EIM；采用肉眼及窄帶成像技術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)EIM、DIM分別高于和低于周圍黏膜，且EIM、DIM的黏膜上皮均完整無脫落[2]，如圖1。

1.1.2設(shè)備和試劑 濃縮型兔抗人 Reg4 多克隆抗體、濃縮型鼠抗人Musashi-1抗體購于英國Abcam 公司；通用型免疫組化試劑盒PV-9000、DAB顯色試劑盒PV-8000、反轉(zhuǎn)錄和 PCR 試劑盒均購于北京中杉金橋公司；快速尿素酶檢測卡購自深圳市賽爾生物技術(shù)有限公司；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，胃鏡主機(日本Olympus CV-260SL)，PCR儀(美國Bio-Rad公司)，PCR引物均由北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.2方法

1.2.1免疫組化檢測Reg4、Msi-1蛋白表達 按照試劑盒說明進行免疫組化SP 法。以 PBS 代替一抗作陰性對照，以Reg4、Msi-1抗體的陽性片作為陽性對照。由2位病理醫(yī)師對所有切片進行讀片。對于Reg4、Msi-1染色，我們將細胞核內(nèi)出現(xiàn)的黃至棕褐色的染色信號判定為陽性染色。每張切片隨機取5個高倍鏡視野，計算陽性細胞所占比例(陽性表達率)，≥10%為陽性反應(yīng)，<10%為陰性反應(yīng)。以0～3分對陽性表達率進行評分，當(dāng)陽性表達率≤10%計0分，10%<陽性表達率≤50%計1分，50%<陽性表達率≤75%計2分，陽性表達率>75%計3分；染色強度為0～3分，未著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；最終的評分為兩個指標的乘積。其中3分以上為高表達。

1.2.2PCR檢測Reg4、Msi-1 mRNA水平 按照Trizol試劑盒操作說明對所有樣本進行總RNA提取，并測定濃度，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄 cDNA合成，反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性 30 s，60℃退火60 s，循環(huán) 35 次，最后 72℃延伸5 min，Reg4 mRNA復(fù)性溫度57℃ 30 s，Msi-1 mRNA復(fù)性溫度 55℃ 30 s。內(nèi)參為β-actin，上游引物序列為5′-CAGAACATGGCTGGAGAGAA-3′，下游引物序列為 5′-ATGGAAAGAAGTGGGCAGGC-3′；Reg4上游引物序列為 5′-CTACACGAGCTGAGCTGGAG-3′，下游引物序列為 5′-GGGATTGTAAAGACCGCTAG-3′； Msi-1的上游引物序列為 5-AAAGTGCACCATAACCGAG-3′，下游引物序列為5′-CCCTGCCAATTTACCGTTC-3′。電泳結(jié)果測定采用軟件進行半定量分析，將目的基因和內(nèi)參的灰度值之比進行統(tǒng)計分析。

1.2.3腸化組織的病理學(xué)檢查 以2000年全國慢性胃炎研討會上制定的標準為依據(jù)對腸化組織病理分類，按照病變程度可以分為輕度、中度、重度，評判標準如下：重度是在每一顯微內(nèi)鏡視野內(nèi)，表面上皮和腺體總面積的腸化部分占2/3以上，中度為占1/3～2/3，輕度為占1/3 以下[7]。由2位胃腸病理醫(yī)師對所有腸化生玻片進行閱讀、分度。

1.2.4幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染檢測 采用快速尿素酶法進行Hp檢測，用活檢鉗夾取一塊胃竇組織，撕開膠紙暴露出瓊脂膠，按照說明進行操作。2 min后，Hp陽性為試劑變成紅色。如果未變色，30 min后再觀察，顏色若變紅也認為是Hp陽性，仍未變色則為陰性。

2 結(jié)果

2.1Reg4 和Msi-1在不同病變胃黏膜中蛋白表達情況 免疫組化結(jié)果顯示， Msi-1在NAG、AG、DIM中的陽性率低于胃癌(P<0.05)；Reg4在EIM、DIM中的陽性率高于胃癌(P<0.05)。Reg4在EIM和DIM中表達同陽和同陰分別有17例和2例；而Msi-1在EIM和DIM中表達同陽和同陰分別有10例和13例。Reg4和Msi-1因子在EIM中的陽性表達率均高于DIM(P<0.05)，詳見表1、2、3及圖1、2。

圖1 普通內(nèi)鏡下腸上皮化生(A)和窄帶成像技術(shù)(B)觀察腸化隆起灶和腸化凹陷灶圖像(×80)Fig.1 Observation of image of EIM and DIM by intestinal metaplasia under common endoscopy(A) and Narrow band imaging (B) (×80)Note: 1.EIM;2.DIM.

圖2 免疫組化法檢測Reg4和Msi-1蛋白在腸化隆起灶(A、C)和腸化凹陷灶(B、D)中的表達情況(×400)Fig.2 Immunohistochemical to detect expression of Reg4 and Msi-1 protein in EIM (A,C) and DIM (B,D)(×400)

表1 Reg4和Msi-1蛋白在不同類型胃黏膜組織中的表達情況[n(%)]

Tab.1 Expression of Reg4 and Msi-1 protein in different types of gastric mucosa[n(%)]

GroupsMsi-1 positiveReg4 positiveNAG6(13.3)5(11.1)AG8(20.5)10(25.6)GC27(71.1)13(34.2)

表2 Reg4在EIM和DIM中的表達情況[n(%)]

Tab.2 Expression of Reg4 in EIM and DIM[n(%)]

EIMDIM+-Total+17(35.4)26(54.2)43(89.6)-3(6.3)2(4.2)5(10.4)Total20(41.7)28(58.3)48(100)

表3 Msi-1在EIM和DIM中的表達情況[n(%)]

Tab.3 Expression of Msi-1 in EIM and DIM[n(%)]

EIMDIM+-Total+10(20.8)24(50)34(70.8)-1(2.1)13(27.1)14(29.2)Total11(22.9)37(77.1)48(100)

2.2Reg4和Msi-1在不同類型病變胃黏膜中mRNA的表達情況 PCR 檢測結(jié)果顯示，在NAG、AG、EIM、DIM和GC組中，Reg4 mRNA相對表達分別為0.35±0.03、0.46±0.03、0.94±0.02、0.72±0.03、0.49±0.05，Msi-1相對表達分別為0.51±0.02、0.64±0.03、1.07±0.04、0.80±0.03和1.12±0.04。Reg4 和Msi-1在EIM中的 mRNA 表達水平比DIM高(分別為t=1.53，P<0.05以及t=1.88，P<0.05，圖3)，與免疫組化結(jié)果一致。

圖3 Reg4和Msi-1的mRNA在不同類型胃黏膜中的表達Fig.3 Expression of mRNA in Reg4 and Msi-1 in different types of gastric mucosaNote: A.Reg4 mRNA expression;B.Msi-1 mRNA expression (1.NAG;2.AG;3.EIM;4.DIM;5.gastric cancer).*.P<0.05 vs DIM group.

表4 兩種病灶中腸化生程度[n(%)]

Tab.4 Degree of intestinal metaplasia in EIM and DIM[n(%)]

Intestinal metaplasiaEIMDZMLight15(31.2)20(41.7)Medium19(39.6)18(37.5)Heavy14(29.2)10(20.8)Total48(100)48(100)

2.3EIM和DIM中腸化生程度 腸上皮化生在EIM和DIM中的分布情況結(jié)果顯示，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.512，P=0.118)。

2.4Hp在不同病變胃黏膜中的感染率 Hp在NAG、AG、EIM、DIM和GC組中的陽性率分別為 33.3%(15例)、41.0%(16例)、52.1%(25例)、50.0%(24 例)和 36.8%(14例)，Hp在EIM和DIM中的陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

目前多數(shù)學(xué)者已逐步接受胃炎轉(zhuǎn)化為胃癌的觀點，并在動物實驗中得到了驗證[8]，研究報道尾型同源框轉(zhuǎn)錄因子2(Caudal type homeobox 2,CDX2)轉(zhuǎn)基因小鼠胃黏膜發(fā)生腸上皮化生，這提示小鼠腸化生上皮細胞生可能會轉(zhuǎn)變?yōu)槲赴┘毎鸞9]，但其發(fā)病機制仍未研究清楚。有研究認為人類的胃癌疾病可能是胃上皮分化能力缺失，致使干細胞增殖分化形成腸上皮化生，在多種致癌因素下發(fā)展為胃癌[10]，不過胃癌和腸上皮化生的關(guān)系還未能明確，有待進一步研究。在胃鏡下觀察腸上皮化生可以發(fā)現(xiàn)病變灶部位有淺表隆起、凹陷、不平等特性，從分子生物學(xué)上研究這些病變部位是否有所差異的報道較少。Msi-1作為胃腸道干細胞的表面標記物，同時在胃炎、腸化生、胃癌組織中也被檢測出，且隨著胃黏膜病變程度的加重而表達增加，這說明胃腸道干細胞突變可能是胃炎、腸化生和胃癌中的干細胞來源[11]。而文獻報道Reg4能夠促進細胞增殖以及抑制其凋亡，從本實驗結(jié)果也能看出Reg4與腸上皮化生密切相關(guān)，屬于腸化因子之一[12]。那么突變的胃腸干細胞在胃腸化生組織中增殖情況如何，Reg4與Msi-1在不同形態(tài)EIM、DIM中是否有聯(lián)系，尚未見文獻報道。

越來越多的研究者逐漸關(guān)注Reg4與癌癥之間的關(guān)系，其作用、機制已經(jīng)成為研究熱點[13]。Oue等[14]對4種原發(fā)性胃癌采用基因序列分析法進行研究，在癌癥的浸潤、形成及轉(zhuǎn)移過程中篩選出一批相關(guān)基因。Reg4在這些相關(guān)基因中是胃癌的特異性基因。文獻報道，經(jīng)RT-PCR分析超過一半的胃癌患者過表達Reg4 mRNA[10]。Reg4在其他正常組織中表達水平也遠低于癌組織[15]。cDNA微陣列分析顯示，腹腔腫瘤的來源無論是原發(fā)灶還是轉(zhuǎn)移灶，都可以將Reg4視為胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的標志物分子[16，17]。CDX2可能調(diào)控管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤的“腸”通路分化與Reg4的表達[18]。在胃癌中，Reg4能通過性別決定區(qū)Y框蛋白9(Sex determining region Y box protein 9,SOX9)和CDX2參與腸分化產(chǎn)生作用，同時對抗凋亡信號分子、激活表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)，參與腫瘤生長[19]。本實驗免疫組化結(jié)果顯示，Reg4在EIM中的陽性率要高于DIM，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但胃癌中Reg4 的蛋白陽性表達率要低于EIM和DIM，其Reg4的mRNA 表達與免疫組化情況基本一致。從上述情況可以看出 Reg4 是較敏感因子，作用類似生長因子，但還需SOX9、CDX2等其他因子配合才能起到作用，說明其特異性不高，對于篩查早期胃癌還需考察其他因子。實驗中我們從Reg4蛋白表達情況可以推測，EIM的增殖活性比DIM高。

Msi-1最早發(fā)現(xiàn)于果蠅中，與感覺器官細胞分化有關(guān)，屬于神經(jīng)特異性表達的 RNA 結(jié)合蛋白。Msi-1能選擇性在小鼠神經(jīng)干細胞中表達，同時在細胞的不對稱分裂過程中發(fā)揮重要作用，近年來許多研究發(fā)現(xiàn)在人和鼠胃腸道干細胞中均有Msi-1表達，提示可以將Msi-1作為胃腸道干細胞的表面標記物[20，21]。轉(zhuǎn)錄后，Msi-1對細胞的非對稱分裂進行調(diào)控、維護干細胞分化及在干細胞狀態(tài)維持中起著重要作用[22]。目前已將Msi-1視為胃腸道干細胞分子標記之一。近年來，Msi-1在許多腫瘤領(lǐng)域均有報道，但在腸上皮化生方面的報道較少，同時Msi-1在胃炎、腸化生和胃癌中陽性率逐漸增高，這對腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后都產(chǎn)生影響。本研究結(jié)果顯示，Msi-1在NAG、AG、DIM、EIM和GC組中的陽性率分別為13.3%、20.5%、22.9%、70.8% 和 71.1%，與既往研究基本相符[23]；本實驗免疫組化和RT-PCR結(jié)果顯示，Msi-1在EIM中的陽性表達率和mRNA表達水平要高于DIM，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，可以推測EIM的增殖活性比DIM，和Reg4推測結(jié)果一致。增殖活性的差異可能會使EIM演變成異型增生或胃癌的可能性比DIM更大。

本研究結(jié)果還顯示，EIM和DIM的腸上皮化生程度比較，腸上皮化生程度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。另外，本實驗中Hp在不同病變胃黏膜中的感染率結(jié)果顯示，腸化生的Hp陽性率較高，EIM和DIM陽性率分別為52.1%和50.0%，其中分別包括12例和8例重度腸化生。有研究表明，發(fā)生Hp感染與腸上皮化生細胞凋亡失調(diào)有關(guān)，這種情況下可能提高胃癌發(fā)生機率[24]。因此推測Hp對腸化生凋亡減少有促進作用，所以根除Hp能減輕腸化生程度，防止其發(fā)生。

綜上所述，Reg4和Msi-1因子在EIM和DIM中的蛋白和mRNA表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Reg4和Msi-1蛋白和mRNA表達越高，說明突變干細胞增殖活性越高，進一步發(fā)展為癌癥的可能性也就越大，在以后的胃鏡檢查中，要對高危人群的EIM足夠重視，這可能是癌變前的高危信號。