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        IDH1單克隆抗體的制備及表位鑒定和雙抗體夾心ELISA的建立

        2019-08-16 09:08:02杜曉娟孫天一壽成超
        中國免疫學(xué)雜志 2019年12期
        關(guān)鍵詞:表位單克隆緩沖液

        杜曉娟 孟 麟 孫天一 壽成超

        (北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院,北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所,生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室,惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100142)

        肺癌一直以來都是我國乃至全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一,其中非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung carcinoma,NSCLC)占所有類型肺癌的85%,且多數(shù)患者確診時(shí)已為晚期肺癌[1,2]。近年研究發(fā)現(xiàn),異檸檬酸脫氫酶1(Isocitrate dehydrogenases 1,IDH1)在NSCLC 患者血漿中表達(dá)明顯上調(diào),有望成為一種新的肺癌外周血標(biāo)志物[3]。IDH1是一種由人類2號染色體上IDH1 基因編碼的酶,定位于細(xì)胞質(zhì)、過氧化物酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[4,5]。IDH1不僅參與葡萄糖代謝,催化異檸檬酸的可逆氧化脫羧,產(chǎn)生還原的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和α-酮戊二酸,也間接參與脂質(zhì)代謝,減輕氧化損傷以及葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌的調(diào)節(jié)[4-9]。IDH1的高表達(dá)及突變促使腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展、急性髓性白血病顯著的表觀遺傳變化以及轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的發(fā)生;敲低IDH1或應(yīng)用IDH1突變體抑制劑之后,增加胰腺癌對多西環(huán)素的敏感性,增強(qiáng)DNA損傷修復(fù)能力,激活c-Jun 氨基端激酶信號途徑并促進(jìn)神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[10-15]。

        為實(shí)現(xiàn)對外周血中IDH1的檢測,本課題組應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備獲得了8株高特異性、高親和力的抗IDH1單克隆抗體,并對其識(shí)別的抗原表位進(jìn)行鑒定,確定各株單抗的表位分布,還初步建立雙抗體夾心ELISA以檢測游離的IDH1蛋白。

        1 材料與方法

        1.1材料 單克隆抗體的制備、純化和標(biāo)記:實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物為6~8周齡雌性Balb/c小鼠及昆明鼠購自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,由北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院動(dòng)物室(SPF級)飼養(yǎng),小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0由北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室抗體組保存,RPMI1640、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素均購自Gibco公司,細(xì)胞消化液(0.25%胰酶和0.02%EDTA)、HAT、HT選擇性培養(yǎng)液均為使用時(shí)配制,細(xì)胞培養(yǎng)皿購自NEST公司。完全弗氏佐劑(Complete freund′s adjuvant)、不完全弗氏佐劑(Incomplete freund′s adjuvant)、降植烷(Pristane:2,6,10,14-tetramethyldecanoicacid)、HAT選擇培養(yǎng)液添加劑購自Sigma公司??贵w純化及標(biāo)記所用試劑包括抗體結(jié)合緩沖液、抗體洗脫緩沖液、中和緩沖液、0.06 mol/L pH4.0 醋酸鈉緩沖液、飽和硫酸銨、碳酸鹽緩沖液、辣根過氧化物酶、過碘酸鈉、醋酸鈉、碳酸鈉、硼氰化鈉均為自制。

        抗原表位的鑒定及雙抗體夾心方法建立中ELISA檢測所用試劑如下:辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG(HRP-羊抗鼠IgG)購自中杉生物公司,ELISA包被液(0.05 mol/L碳酸緩沖液pH9.6)、洗液(PBST)、封閉液、抗體稀釋液、HRP底物反應(yīng)液、終止液均為自制,酶標(biāo)儀Model 680購自Bio-Rad公司。

        質(zhì)粒、菌株、單克隆抗體:pGEX-4T1-IDH1重組原核質(zhì)粒由本課題組保存,Taq聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶皆購自New England Biolabs,凝膠DNA回收純化試劑盒為QIAGEN產(chǎn)品,感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)購自生工生物工程(上海)股份有限公司,LB培養(yǎng)液、LB 平板均為自制,單克隆抗體1H8、4H7、5C8、7C3、7E12、13F6、16B11、16H7為純化抗體,GST抗體和小鼠IgG由本室保存;其余試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

        1.2方法

        1.2.1IDH1截短體PCR引物的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)IDH1序列共設(shè)計(jì)了6個(gè)IDH1截短體,其中C1F、C2F和C3F分別代表從C端去除294、202和88個(gè)氨基酸殘基的IDH1截短體,N1S、N2S和 N3S分別代表從N端去除103、197和314個(gè)氨基酸殘基的IDH1截短體,根據(jù)設(shè)計(jì)的截短體分別設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增截短體DNA片段(表1),上游引物設(shè)計(jì)添加BamH Ⅰ 酶切位點(diǎn),下游引物設(shè)計(jì)添加EcoRⅠ酶切位點(diǎn),其中,C1F、C2F和C3F共用上游引物,N1S、N2S和 N3S共用下游引物,依據(jù)不同單抗與不同 IDH1截短體融合蛋白的反應(yīng),推知其可能的識(shí)別表位區(qū)域。引物及寡核苷酸片段均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

        1.2.2IDH1單克隆抗體的制備、純化和標(biāo)記 用GST-IDH1融合蛋白加弗氏佐劑免疫6~8周齡雌性Balb/c小鼠,3周后用GST-IDH1加不完全佐劑強(qiáng)化免疫2次,末次免疫3 d后取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0融合。ELISA篩選僅與GST-IDH1反應(yīng)而與GST不反應(yīng)的陽性單克隆雜交瘤細(xì)胞,經(jīng)3次亞克隆及ELISA檢測完全陽性后,擴(kuò)大培養(yǎng)并建株。以1~2×106個(gè)/只數(shù)量的雜交瘤細(xì)胞接種于已經(jīng)腹腔注射降植烷后7~10 d的雌性Balb/c小鼠,待小鼠腹部顯著膨隆后,吸出含有單克隆抗體的腹水,應(yīng)用Protein G 凝膠柱進(jìn)行純化;純化后抗體分別用OD280 nm及SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行定量和純度鑒定。

        表1 IDH1截短體引物的設(shè)計(jì)

        Tab.1 Primer sequences for different forms of trunca-ted IDH1

        PrimerSequences(5′-3′)IDH1 forwardGGAGGATCC atgtccaaaaaaatcagtgC1F reverseATCGGAATTCCTA ccgggggatatttttgcagC2F reverseATCGGAATTCCTA ggtgctcagatacaaaggC3F reverseATCGGAATTCCTA gaggttggtggacgtctcIDH1 reverseGAGGGAATTC ttaaagtttggcctgagcN1S forwardCGTAGGATCC ggtggcacggtcttcagagN2S forwardCGTAGGATCC cagatggctctgtctaagN3S forwardCGTAGGATCC cactaccgcatgtaccag

        取親和力相對較高的單克隆抗體各1 mg,用pH9.5、0.01 mol/L碳酸鹽緩沖液透析過夜。取辣根過氧化物酶約2 mg溶于0.8 ml水中,加入0.1 mol/L 過碘酸鈉0.1 ml,室溫避光攪拌20 min,對pH4.4的1 mmol/L醋酸鈉透析過夜。取出酶液,用0.5 mol/L碳酸鈉調(diào)整其pH為9.5,均分成4份,分別將各抗體迅速加入酶液中,室溫避光攪拌2 h,各加4 mg/ml硼氰化鈉0.1 ml終止其反應(yīng)。用0.01 mol/L、pH7.2的PBS透析過夜。取出抗體標(biāo)記物,離心,上清加入已平衡好的Sephadex S-200層析柱,收集洗脫液,0.5 ml/管,測定OD403 nm和OD280 nm值,計(jì)算標(biāo)記率。

        1.2.3IDH1截短體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和GST截短體融合蛋白的表達(dá) 以pGEX-4T1-IDH1質(zhì)粒為模板,通過PCR擴(kuò)增6個(gè)IDH1截短體DNA片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后用DNA回收試劑盒進(jìn)行純化,純化的PCR產(chǎn)物和pGEX-4T1-IDH1質(zhì)粒同時(shí)分別用BamH Ⅰ /EcoR Ⅰ 雙酶切,截短體片段和載體經(jīng)DNA凝膠回收后進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化 BL21感受態(tài)細(xì)菌,挑取克隆擴(kuò)增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,質(zhì)粒 DNA用BamHⅠ/EcoRⅠ進(jìn)行酶切鑒定,將酶切鑒定正確的質(zhì)粒委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

        將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21,挑取單克隆于LB培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)至OD600 nm為0.6~0.8,加入異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl B-D-thiogalactoside,IPTG)至終濃度為0.5 mmol/L,20℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h后,4℃、12 000 r/min離心5 min收菌。每1 ml細(xì)菌加入100 μl細(xì)菌裂解液(含溶菌酶1 mg/ml,苯甲基磺酰氟1 mmol/L,1%的Triton X-100,臨用前用PBS配制),將細(xì)菌振蕩懸浮后,冰上放置 30 min,然后置冰上間歇超聲裂解,20 kHz、超聲5 s、暫停10 s,至菌液透亮不黏稠,然后4℃、12 000 r/min離心10 min,取上清將細(xì)菌裂解蛋白進(jìn)行SDS-PAGE,考馬斯亮藍(lán)染色后觀察融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)情況。

        1.2.4Western blot和ELISA法鑒定IDH1單克隆抗體的抗原結(jié)合部位 取待測蛋白約0.1 μg進(jìn)行 SDS-PAGE,電泳結(jié)束后250 mA恒流轉(zhuǎn)膜 1.5 h至硝酸纖維素膜,用 5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別與濃度約為 2 μg/ml的 IDH1單抗在4℃反應(yīng)過夜,同時(shí)以小鼠 IgG和GST抗體作為陰、陽性對照。經(jīng)0.1%Tween 20/PBS(即PBST buffer)洗5次,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG室溫反應(yīng) 1 h,PBST洗5次后使用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行發(fā)光檢測。

        取待測蛋白的細(xì)菌裂解上清用 ELISA包被緩沖液(0.1 mol/L、pH8.9的碳酸緩沖液)稀釋至3 μg/ml 包被96孔板,50 μl/孔,4℃包被過夜。PBST洗5次,加入 5%脫脂奶粉 200 μl/孔封閉過夜,室溫封閉2 h,PBST洗5次,分別加入濃度約為2 μg/ml的不同 IDH1單抗,50 μl/孔,室溫反應(yīng)1 h。同時(shí)以小鼠IgG和GST抗體作為陰、陽性對照。室溫反應(yīng)1 h,PBST洗5次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG,50 μl/孔,室溫反應(yīng)1 h。PBST洗5次,加入鄰苯二胺顯色液,100 μl/孔,室溫避光顯色,顯色充分后加入12.5%H2SO4,50 μl/孔,終止反應(yīng),酶標(biāo)儀測定OD492 nm。

        1.2.5雙抗體夾心ELISA的建立 操作步驟同上ELISA,以其中一株抗體包板,之后加入IDH1-GST抗原,再分別加入辣根過氧化酶標(biāo)記的8株抗IDH1抗體,加入底物之后檢測OD492 nm讀值。

        2 結(jié)果

        2.1IDH1單克隆抗體的結(jié)合特異性鑒定 經(jīng)免疫、融合及篩選,共獲得8株抗IDH1抗體(1H8、4H7、5C8、7C3、7E12、13F6、16B11、16H7),純化時(shí)根據(jù)洗脫的OD值進(jìn)行初步定量,之后8株抗體各取10 μl行SDS-PAGE,再次定量抗體(圖1A)。

        Western blot檢測不同IDH1單抗與GST-IDH1融合蛋白和GST蛋白的反應(yīng),結(jié)果顯示,這些抗體均能識(shí)別GST-IDH1(圖1B),但與GST 無反應(yīng)(圖1C);ELISA檢測不同IDH1單抗與GST-IDH1融合蛋白的反應(yīng),證明抗體亦能特異性結(jié)合未變性狀態(tài)下的IDH1,與GST 不反應(yīng)(圖1D)。

        2.2不同pGEX-4T1-IDH1截短體重組質(zhì)粒的鑒定

        圖1 IDH1單克隆抗體的鑒定Fig.1 Characterization of monoclonal antibodies again-st IDH1Note: A.SDS-PAGE of purified antibodies;B.Western blot analysis of the antibody′s specificity with GST-IDH1 as antigen;C.Western blot analysis of the antibody′s specificity with GST as antigen;D.ELISA analysis of the antibody′s specificity.

        圖2 IDH1融合蛋白的表達(dá)及鑒定Fig.2 Expression and characterization of different IDH1 fusion proteinsNote: A.Schematic representation of different truncated IDH1;B.Enzymatic digestion of expression plasmids for different truncated IDH1;C.Induced expression of truncated IDH1 fusion proteins (arrows);D.Western blot analysis of truncated IDH1 fusion proteins.

        及融合蛋白的表達(dá) 構(gòu)建的pGEX-4T1-IDH1截短體質(zhì)粒分別用BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切進(jìn)行鑒定,可見釋放出的相應(yīng)截短體DNA大小的片段(圖2A、2B);測序結(jié)果正確(圖略),說明截短體融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功;質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 BL21細(xì)菌后用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)GST融合蛋白,經(jīng)SDS-PAGE 鑒定,在相應(yīng)位置處有融合蛋白的表達(dá)(圖2C,箭頭所示)。用抗GST抗體進(jìn)行Western blot檢測,這些融合蛋白也均能被識(shí)別(圖2D)。

        2.3不同單抗識(shí)別IDH1抗原表位的區(qū)域確定 用ELISA檢測不同單抗與不同IDH1截短體融合蛋白的反應(yīng),可見8株單抗均可與相應(yīng)表位區(qū)域的GST-IDH1融合蛋白反應(yīng)(圖3A)。Western blot檢測確定了8株單抗與相應(yīng)表位區(qū)域的GST-IDH1融合蛋白的反應(yīng)(圖3B)。綜合不同單抗與 IDH1截短體融合蛋白的 ELISA和 Western blot檢測結(jié)果,確定了各株IDH1單抗識(shí)別位點(diǎn)所在的區(qū)域(圖3C),分別是:5C8和7C3抗體的抗原表位位于IDH1 119~197位氨基酸,4H7抗體的抗原表位位于IDH1 197~211位氨基酸,7E12和16B11抗體的抗原表位位于 IDH1 211~314位氨基酸,1H8和16H7抗體的抗原表位位于IDH1 314~329位氨基酸,13F6抗體的抗原表位位于IDH1 314~415位氨基酸。

        2.4雙抗體夾心ELISA篩選配對抗體 以其中一株抗IDH1 抗體包被,之后加入IDH1-GST,再分別加入辣根過氧化酶標(biāo)記的不同抗IDH1抗體,加入底物之后檢測OD492 nm值(圖4),結(jié)果顯示,以4H7包被1H8檢測的效果最好;用5C8作為包被抗體,以其他抗體進(jìn)行檢測,也有相對較好檢測效果。

        圖3 IDH1單抗表位的鑒定Fig.3 Epitope mapping of anti-IDH1 monoclonal antibodiesNote: A.ELISA analysis of the specificities of different antibodies against truncated IDH1 fusion proteins;B.Western blot of the specificities of different antibodies against truncated IDH1 fusion proteins;C.Epitopes mapping of different antibodies (numbers represent amino acids of IDH1).

        圖4 不同抗體的雙抗體夾心配對檢測Fig.4 Sandwich ELISA of GST-IDH1 with different pairs of antibodiesNote: Plating antibodies are listed below the x-axis,detection antibodies are listed above the graphs.

        3 討論

        IDH1是一類表達(dá)于神經(jīng)組織和某些腫瘤中的小分子蛋白家族,包括IDH1、IDH2和IDH3,其中IDH1的異常表達(dá)與人類多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān),并且在多種腫瘤中均有異常表達(dá)[16-19]。目前研究表明IDH1的異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及耐藥相關(guān)[10-15],肺癌患者外周血中IDH1的水平升高[3],但是IDH1在肺癌中的生物學(xué)功能仍不清楚,其與肺癌發(fā)生發(fā)展的確切關(guān)系及機(jī)制也尚不明確,因此制備IDH1特異性單抗并建立外周血IDH1 的檢測方法,對IDH1的相關(guān)研究有重要意義。

        本研究制備獲得了多株IDH1特異性單克隆抗體,為進(jìn)行IDH1相關(guān)基礎(chǔ)研究提供了有力的工具。同時(shí)設(shè)計(jì)構(gòu)建了6個(gè)IDH1截短體,采用ELISA和Western blot檢測各株單抗與IDH1截短體的反應(yīng),對8株 IDH1單抗的抗原表位區(qū)域進(jìn)行了定位。 IDH1單抗識(shí)別表位的確定可以為 IDH1的相關(guān)研究、單抗的進(jìn)一步應(yīng)用及相關(guān)藥物的開發(fā)提供重要信息。此外,我們還初步建立了雙抗體夾心ELISA檢測游離IDH1的方法,可以為雙抗體夾心ELISA檢測病人血清選擇配對抗體及條件優(yōu)化提供有用的信息,以期可以為肺癌及其他腫瘤的早期診斷及預(yù)后評估提供新的方法,也可以為制定更為合理的治療方案提供有價(jià)值的參考指標(biāo)。

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