杜曉娟 孟 麟 孫天一 壽成超

(北京大學(xué)臨床腫瘤學(xué)院，北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所，生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室，惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100142)

肺癌一直以來都是我國乃至全世界發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung carcinoma，NSCLC)占所有類型肺癌的85%，且多數(shù)患者確診時(shí)已為晚期肺癌[1，2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，異檸檬酸脫氫酶1(Isocitrate dehydrogenases 1，IDH1)在NSCLC 患者血漿中表達(dá)明顯上調(diào)，有望成為一種新的肺癌外周血標(biāo)志物[3]。IDH1是一種由人類2號染色體上IDH1 基因編碼的酶，定位于細(xì)胞質(zhì)、過氧化物酶體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[4,5]。IDH1不僅參與葡萄糖代謝，催化異檸檬酸的可逆氧化脫羧，產(chǎn)生還原的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和α-酮戊二酸，也間接參與脂質(zhì)代謝，減輕氧化損傷以及葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌的調(diào)節(jié)[4-9]。IDH1的高表達(dá)及突變促使腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展、急性髓性白血病顯著的表觀遺傳變化以及轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的發(fā)生；敲低IDH1或應(yīng)用IDH1突變體抑制劑之后，增加胰腺癌對多西環(huán)素的敏感性，增強(qiáng)DNA損傷修復(fù)能力，激活c-Jun 氨基端激酶信號途徑并促進(jìn)神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[10-15]。

為實(shí)現(xiàn)對外周血中IDH1的檢測，本課題組應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備獲得了8株高特異性、高親和力的抗IDH1單克隆抗體，并對其識(shí)別的抗原表位進(jìn)行鑒定，確定各株單抗的表位分布，還初步建立雙抗體夾心ELISA以檢測游離的IDH1蛋白。

1 材料與方法

1.1材料 單克隆抗體的制備、純化和標(biāo)記：實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物為6～8周齡雌性Balb/c小鼠及昆明鼠購自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，由北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院動(dòng)物室(SPF級)飼養(yǎng)，小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0由北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室抗體組保存，RPMI1640、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素均購自Gibco公司，細(xì)胞消化液(0.25%胰酶和0.02%EDTA)、HAT、HT選擇性培養(yǎng)液均為使用時(shí)配制，細(xì)胞培養(yǎng)皿購自NEST公司。完全弗氏佐劑(Complete freund′s adjuvant)、不完全弗氏佐劑(Incomplete freund′s adjuvant)、降植烷(Pristane：2，6，10，14-tetramethyldecanoicacid)、HAT選擇培養(yǎng)液添加劑購自Sigma公司?？贵w純化及標(biāo)記所用試劑包括抗體結(jié)合緩沖液、抗體洗脫緩沖液、中和緩沖液、0.06 mol/L pH4.0 醋酸鈉緩沖液、飽和硫酸銨、碳酸鹽緩沖液、辣根過氧化物酶、過碘酸鈉、醋酸鈉、碳酸鈉、硼氰化鈉均為自制。

抗原表位的鑒定及雙抗體夾心方法建立中ELISA檢測所用試劑如下：辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG(HRP-羊抗鼠IgG)購自中杉生物公司，ELISA包被液(0.05 mol/L碳酸緩沖液pH9.6)、洗液(PBST)、封閉液、抗體稀釋液、HRP底物反應(yīng)液、終止液均為自制，酶標(biāo)儀Model 680購自Bio-Rad公司。

質(zhì)粒、菌株、單克隆抗體:pGEX-4T1-IDH1重組原核質(zhì)粒由本課題組保存，Taq聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶皆購自New England Biolabs，凝膠DNA回收純化試劑盒為QIAGEN產(chǎn)品，感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)購自生工生物工程(上海)股份有限公司，LB培養(yǎng)液、LB 平板均為自制，單克隆抗體1H8、4H7、5C8、7C3、7E12、13F6、16B11、16H7為純化抗體，GST抗體和小鼠IgG由本室保存；其余試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1IDH1截短體PCR引物的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)IDH1序列共設(shè)計(jì)了6個(gè)IDH1截短體，其中C1F、C2F和C3F分別代表從C端去除294、202和88個(gè)氨基酸殘基的IDH1截短體，N1S、N2S和 N3S分別代表從N端去除103、197和314個(gè)氨基酸殘基的IDH1截短體,根據(jù)設(shè)計(jì)的截短體分別設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增截短體DNA片段(表1)，上游引物設(shè)計(jì)添加BamH Ⅰ 酶切位點(diǎn)，下游引物設(shè)計(jì)添加EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，其中，C1F、C2F和C3F共用上游引物，N1S、N2S和 N3S共用下游引物，依據(jù)不同單抗與不同 IDH1截短體融合蛋白的反應(yīng)，推知其可能的識(shí)別表位區(qū)域。引物及寡核苷酸片段均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2IDH1單克隆抗體的制備、純化和標(biāo)記 用GST-IDH1融合蛋白加弗氏佐劑免疫6～8周齡雌性Balb/c小鼠，3周后用GST-IDH1加不完全佐劑強(qiáng)化免疫2次，末次免疫3 d后取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0融合。ELISA篩選僅與GST-IDH1反應(yīng)而與GST不反應(yīng)的陽性單克隆雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)3次亞克隆及ELISA檢測完全陽性后，擴(kuò)大培養(yǎng)并建株。以1～2×106個(gè)/只數(shù)量的雜交瘤細(xì)胞接種于已經(jīng)腹腔注射降植烷后7～10 d的雌性Balb/c小鼠，待小鼠腹部顯著膨隆后，吸出含有單克隆抗體的腹水，應(yīng)用Protein G 凝膠柱進(jìn)行純化；純化后抗體分別用OD280 nm及SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行定量和純度鑒定。

表1 IDH1截短體引物的設(shè)計(jì)

Tab.1 Primer sequences for different forms of trunca-ted IDH1

PrimerSequences(5′-3′)IDH1 forwardGGAGGATCC atgtccaaaaaaatcagtgC1F reverseATCGGAATTCCTA ccgggggatatttttgcagC2F reverseATCGGAATTCCTA ggtgctcagatacaaaggC3F reverseATCGGAATTCCTA gaggttggtggacgtctcIDH1 reverseGAGGGAATTC ttaaagtttggcctgagcN1S forwardCGTAGGATCC ggtggcacggtcttcagagN2S forwardCGTAGGATCC cagatggctctgtctaagN3S forwardCGTAGGATCC cactaccgcatgtaccag

取親和力相對較高的單克隆抗體各1 mg，用pH9.5、0.01 mol/L碳酸鹽緩沖液透析過夜。取辣根過氧化物酶約2 mg溶于0.8 ml水中，加入0.1 mol/L 過碘酸鈉0.1 ml，室溫避光攪拌20 min，對pH4.4的1 mmol/L醋酸鈉透析過夜。取出酶液，用0.5 mol/L碳酸鈉調(diào)整其pH為9.5，均分成4份，分別將各抗體迅速加入酶液中，室溫避光攪拌2 h，各加4 mg/ml硼氰化鈉0.1 ml終止其反應(yīng)。用0.01 mol/L、pH7.2的PBS透析過夜。取出抗體標(biāo)記物，離心，上清加入已平衡好的Sephadex S-200層析柱，收集洗脫液，0.5 ml/管，測定OD403 nm和OD280 nm值，計(jì)算標(biāo)記率。

1.2.3IDH1截短體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和GST截短體融合蛋白的表達(dá) 以pGEX-4T1-IDH1質(zhì)粒為模板，通過PCR擴(kuò)增6個(gè)IDH1截短體DNA片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后用DNA回收試劑盒進(jìn)行純化，純化的PCR產(chǎn)物和pGEX-4T1-IDH1質(zhì)粒同時(shí)分別用BamH Ⅰ /EcoR Ⅰ 雙酶切，截短體片段和載體經(jīng)DNA凝膠回收后進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化 BL21感受態(tài)細(xì)菌，挑取克隆擴(kuò)增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，質(zhì)粒 DNA用BamHⅠ/EcoRⅠ進(jìn)行酶切鑒定，將酶切鑒定正確的質(zhì)粒委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21，挑取單克隆于LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600 nm為0.6～0.8，加入異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl B-D-thiogalactoside，IPTG)至終濃度為0.5 mmol/L，20℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h后，4℃、12 000 r/min離心5 min收菌。每1 ml細(xì)菌加入100 μl細(xì)菌裂解液(含溶菌酶1 mg/ml，苯甲基磺酰氟1 mmol/L，1%的Triton X-100，臨用前用PBS配制)，將細(xì)菌振蕩懸浮后，冰上放置 30 min，然后置冰上間歇超聲裂解，20 kHz、超聲5 s、暫停10 s，至菌液透亮不黏稠，然后4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清將細(xì)菌裂解蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色后觀察融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)情況。

1.2.4Western blot和ELISA法鑒定IDH1單克隆抗體的抗原結(jié)合部位 取待測蛋白約0.1 μg進(jìn)行 SDS-PAGE，電泳結(jié)束后250 mA恒流轉(zhuǎn)膜 1.5 h至硝酸纖維素膜，用 5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別與濃度約為 2 μg/ml的 IDH1單抗在4℃反應(yīng)過夜，同時(shí)以小鼠 IgG和GST抗體作為陰、陽性對照。經(jīng)0.1%Tween 20/PBS(即PBST buffer)洗5次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG室溫反應(yīng) 1 h，PBST洗5次后使用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行發(fā)光檢測。

取待測蛋白的細(xì)菌裂解上清用 ELISA包被緩沖液(0.1 mol/L、pH8.9的碳酸緩沖液)稀釋至3 μg/ml 包被96孔板，50 μl/孔，4℃包被過夜。PBST洗5次，加入 5%脫脂奶粉 200 μl/孔封閉過夜，室溫封閉2 h，PBST洗5次，分別加入濃度約為2 μg/ml的不同 IDH1單抗，50 μl/孔，室溫反應(yīng)1 h。同時(shí)以小鼠IgG和GST抗體作為陰、陽性對照。室溫反應(yīng)1 h，PBST洗5次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，50 μl/孔，室溫反應(yīng)1 h。PBST洗5次，加入鄰苯二胺顯色液，100 μl/孔，室溫避光顯色，顯色充分后加入12.5%H2SO4，50 μl/孔，終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定OD492 nm。

1.2.5雙抗體夾心ELISA的建立 操作步驟同上ELISA，以其中一株抗體包板，之后加入IDH1-GST抗原，再分別加入辣根過氧化酶標(biāo)記的8株抗IDH1抗體，加入底物之后檢測OD492 nm讀值。

2 結(jié)果

2.1IDH1單克隆抗體的結(jié)合特異性鑒定 經(jīng)免疫、融合及篩選，共獲得8株抗IDH1抗體(1H8、4H7、5C8、7C3、7E12、13F6、16B11、16H7)，純化時(shí)根據(jù)洗脫的OD值進(jìn)行初步定量，之后8株抗體各取10 μl行SDS-PAGE，再次定量抗體(圖1A)。

Western blot檢測不同IDH1單抗與GST-IDH1融合蛋白和GST蛋白的反應(yīng)，結(jié)果顯示，這些抗體均能識(shí)別GST-IDH1(圖1B)，但與GST 無反應(yīng)(圖1C)；ELISA檢測不同IDH1單抗與GST-IDH1融合蛋白的反應(yīng)，證明抗體亦能特異性結(jié)合未變性狀態(tài)下的IDH1，與GST 不反應(yīng)(圖1D)。

2.2不同pGEX-4T1-IDH1截短體重組質(zhì)粒的鑒定

圖1 IDH1單克隆抗體的鑒定Fig.1 Characterization of monoclonal antibodies again-st IDH1Note: A.SDS-PAGE of purified antibodies；B.Western blot analysis of the antibody′s specificity with GST-IDH1 as antigen；C.Western blot analysis of the antibody′s specificity with GST as antigen；D.ELISA analysis of the antibody′s specificity.

圖2 IDH1融合蛋白的表達(dá)及鑒定Fig.2 Expression and characterization of different IDH1 fusion proteinsNote: A.Schematic representation of different truncated IDH1；B.Enzymatic digestion of expression plasmids for different truncated IDH1；C.Induced expression of truncated IDH1 fusion proteins (arrows)；D.Western blot analysis of truncated IDH1 fusion proteins.

及融合蛋白的表達(dá) 構(gòu)建的pGEX-4T1-IDH1截短體質(zhì)粒分別用BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切進(jìn)行鑒定，可見釋放出的相應(yīng)截短體DNA大小的片段(圖2A、2B)；測序結(jié)果正確(圖略)，說明截短體融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功；質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 BL21細(xì)菌后用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)GST融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE 鑒定，在相應(yīng)位置處有融合蛋白的表達(dá)(圖2C，箭頭所示)。用抗GST抗體進(jìn)行Western blot檢測，這些融合蛋白也均能被識(shí)別(圖2D)。

2.3不同單抗識(shí)別IDH1抗原表位的區(qū)域確定 用ELISA檢測不同單抗與不同IDH1截短體融合蛋白的反應(yīng)，可見8株單抗均可與相應(yīng)表位區(qū)域的GST-IDH1融合蛋白反應(yīng)(圖3A)。Western blot檢測確定了8株單抗與相應(yīng)表位區(qū)域的GST-IDH1融合蛋白的反應(yīng)(圖3B)。綜合不同單抗與 IDH1截短體融合蛋白的 ELISA和 Western blot檢測結(jié)果，確定了各株IDH1單抗識(shí)別位點(diǎn)所在的區(qū)域(圖3C)，分別是：5C8和7C3抗體的抗原表位位于IDH1 119～197位氨基酸，4H7抗體的抗原表位位于IDH1 197～211位氨基酸，7E12和16B11抗體的抗原表位位于 IDH1 211～314位氨基酸，1H8和16H7抗體的抗原表位位于IDH1 314～329位氨基酸，13F6抗體的抗原表位位于IDH1 314～415位氨基酸。

2.4雙抗體夾心ELISA篩選配對抗體 以其中一株抗IDH1 抗體包被，之后加入IDH1-GST，再分別加入辣根過氧化酶標(biāo)記的不同抗IDH1抗體，加入底物之后檢測OD492 nm值(圖4)，結(jié)果顯示，以4H7包被1H8檢測的效果最好；用5C8作為包被抗體，以其他抗體進(jìn)行檢測，也有相對較好檢測效果。

圖3 IDH1單抗表位的鑒定Fig.3 Epitope mapping of anti-IDH1 monoclonal antibodiesNote: A.ELISA analysis of the specificities of different antibodies against truncated IDH1 fusion proteins；B.Western blot of the specificities of different antibodies against truncated IDH1 fusion proteins；C.Epitopes mapping of different antibodies (numbers represent amino acids of IDH1).

圖4 不同抗體的雙抗體夾心配對檢測Fig.4 Sandwich ELISA of GST-IDH1 with different pairs of antibodiesNote: Plating antibodies are listed below the x-axis,detection antibodies are listed above the graphs.

3 討論

IDH1是一類表達(dá)于神經(jīng)組織和某些腫瘤中的小分子蛋白家族，包括IDH1、IDH2和IDH3，其中IDH1的異常表達(dá)與人類多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，并且在多種腫瘤中均有異常表達(dá)[16-19]。目前研究表明IDH1的異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及耐藥相關(guān)[10-15]，肺癌患者外周血中IDH1的水平升高[3]，但是IDH1在肺癌中的生物學(xué)功能仍不清楚，其與肺癌發(fā)生發(fā)展的確切關(guān)系及機(jī)制也尚不明確，因此制備IDH1特異性單抗并建立外周血IDH1 的檢測方法，對IDH1的相關(guān)研究有重要意義。

本研究制備獲得了多株IDH1特異性單克隆抗體，為進(jìn)行IDH1相關(guān)基礎(chǔ)研究提供了有力的工具。同時(shí)設(shè)計(jì)構(gòu)建了6個(gè)IDH1截短體，采用ELISA和Western blot檢測各株單抗與IDH1截短體的反應(yīng)，對8株 IDH1單抗的抗原表位區(qū)域進(jìn)行了定位。 IDH1單抗識(shí)別表位的確定可以為 IDH1的相關(guān)研究、單抗的進(jìn)一步應(yīng)用及相關(guān)藥物的開發(fā)提供重要信息。此外，我們還初步建立了雙抗體夾心ELISA檢測游離IDH1的方法，可以為雙抗體夾心ELISA檢測病人血清選擇配對抗體及條件優(yōu)化提供有用的信息，以期可以為肺癌及其他腫瘤的早期診斷及預(yù)后評估提供新的方法，也可以為制定更為合理的治療方案提供有價(jià)值的參考指標(biāo)。