楊洋 張夢芹 周小小 劉炬 蔡攀 胥正鋒

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜增生、關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)周圍組織損害為特點(diǎn)的自身免疫性疾病[1]。RA患者關(guān)節(jié)破壞呈進(jìn)行性、不可逆性并累及全身多處小關(guān)節(jié)，重者勞動(dòng)力喪失，并嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。RA發(fā)病機(jī)制目前仍未完全闡明，炎癥反應(yīng)在RA發(fā)展中起重要作用[2]。RA患者炎癥滑膜能高表達(dá)Toll樣受體 4（Toll-like receptor 4，TLR4）并激活 Toll樣受體 2（Toll-like receptor 2，TLR2）、Toll樣受體 3（Toll-like receptor 3，TLR3）及 TLR4信號(hào)通路，TLR2 及 TLR4可與其下游銜接蛋白髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）結(jié)合，進(jìn)一步強(qiáng)化炎癥反應(yīng)[3]。研究表明特異性TLR4拮抗劑能夠通過抑制TLR4信號(hào)通路阻斷免疫性關(guān)節(jié)炎小鼠的炎癥反應(yīng)，減輕RA患者的臨床表現(xiàn)和病理學(xué)改變，因此可作為治療RA的潛在藥物靶點(diǎn)。研究顯示蛋白酶體抑制劑能夠抑制RA患者NF-κB誘導(dǎo)細(xì)胞因子釋放及誘導(dǎo)活化T細(xì)胞凋亡[4]?？ǚ亲裘祝╟arfilzomib，CFZ）為二代蛋白酶體抑制劑，相比于一代蛋白酶體抑制劑具有抗多發(fā)性骨髓瘤的高效性和低毒性[5]。CFZ能夠通過破壞RANKL誘導(dǎo)的NF-κB活化，有效抑制破骨細(xì)胞分化和形成[6]。但CFZ能否治療RA目前尚不清楚。因此本研究采用不同劑量CFZ治療佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（adjuvant-induced arthritis，AIA）大鼠，觀察療效，并探究其潛在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 適齡SPF級(jí)雄性SD大鼠35只（SCXK，#2013-0006，上海杰思捷公司），體重（180±5）g。所有大鼠均飼養(yǎng)于上海分子與細(xì)胞生物學(xué)研究中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，維持室溫22～25℃，相對(duì)濕度65%～75%，自由攝食水，模擬正常晝夜規(guī)律，每日光照12h。

1.2 試劑和儀器 CFZ購自加拿大Onyx Pharmaceuticals公司；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色試劑盒購自美國Sigma-Aldrich公司；抗-誘導(dǎo)型氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗體、抗-環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase 2，COX-2）抗體購自美國Boster公司；抗兔IgG H&L購自英國Abcam公司；Trizol試劑盒、EDTA緩沖液購自美國Thermo Fisher Scientifc公司；硝酸纖維膜購自上海天能科技有限公司；HRP羊抗鼠IgG及HRP羊抗兔IgG購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Nanodrop 2000分光光度計(jì)購自美國Applied Biosystems公司；凝膠成像系統(tǒng)購自美國Eastern Kodak公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組、造模及給藥 采用抽簽法將35只大鼠分為預(yù)治療組、同時(shí)治療組、低劑量治療組（1.0mg/kg）、中劑量治療組（1.5mg/kg）、高劑量治療組（2.0mg/kg）、模型對(duì)照組和空白對(duì)照組7組，每組5只。造模方法：在SD大鼠右后足底皮下注射0.1ml完全弗氏佐劑[7]，1周后采用上述方式注射不完全弗氏佐劑強(qiáng)化免疫，2周后造模成功。預(yù)治療組：從實(shí)驗(yàn)第1天開始每隔2d腹腔內(nèi)注射1.5mg/kg CFZ（溶解于 0.5ml DMSO溶液），持續(xù) 2周，注射時(shí)間為實(shí)驗(yàn)開始后的第1、4、7、10和13天；在第14天開始造模，2周后終止。同時(shí)治療組：實(shí)驗(yàn)第1天開始造模同時(shí)腹腔內(nèi)注射1.5mg/kg CFZ（溶解于0.5ml DMSO溶液），CFZ注射時(shí)間為實(shí)驗(yàn)開始后的第1、4、7、10和13天。低劑量治療組、中劑量治療組、高劑量治療組：在SD大鼠造模成功后第1天即實(shí)驗(yàn)開始后第15天每隔2d腹腔內(nèi)注射不同劑量（1.0、1.5和2.0mg/kg）CFZ（均溶解于0.5ml DMSO溶液），注射時(shí)間為實(shí)驗(yàn)開始后的第 15、18、21、24和27天。模型對(duì)照組：造模成功后每隔2d腹腔內(nèi)注射0.5ml DMSO溶液，注射時(shí)間為實(shí)驗(yàn)開始的第15、18、21、24和27天?？瞻讓?duì)照組：未接受任何處理的健康SD大鼠。

1.4 大鼠患足觀察 每隔2d觀察大鼠肢體并記錄關(guān)節(jié)病變程度。采用5分法關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）評(píng)估大鼠RA病情。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，肢體關(guān)節(jié)無明顯影響；1分，小趾關(guān)節(jié)輕度腫脹；2分，小趾關(guān)節(jié)及足部腫脹；3分，踝關(guān)節(jié)以下腫脹；4分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全足腫脹。

1.5 標(biāo)本提取

1.5.1 滑膜細(xì)胞分離及培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)第28天處死各組大鼠，無菌條件下取踝關(guān)節(jié)滑膜組織，Ⅷ型膠原酶（1mg/ml）消化至少2h后采用100μm濾網(wǎng)過濾。在IMDM培養(yǎng)液中（含 10%FBS、0.05μg/ml慶大霉素和 2.5μg/ml兩性霉素B）中培養(yǎng)3～5d，隔天換液。細(xì)胞融合后胰酶消化，1:3傳代。

1.5.2 踝關(guān)節(jié)切片 取大鼠踝關(guān)節(jié)標(biāo)本固定于10%甲醛中，予 10%EDTA脫鈣 7d，石蠟包埋，5～7μm 沿縱軸切片。

1.6 iNOS和COX-2表達(dá)水平檢測 采用免疫組化法。大鼠踝關(guān)節(jié)切片置于65℃恒溫箱30min，二甲苯脫蠟，乙醇清洗。加熱EDTA緩沖液（1∶10稀釋）至沸騰，將切片放入裝有EDTA緩沖液的修復(fù)缸中，在100℃下煮沸持續(xù)30min，冷卻至室溫。然后，將切片用抗原浸泡在1×PBS緩沖液中數(shù)分鐘，用PBST緩沖液（1×PBS+0.1%Tween20）洗滌3次，每次5min。內(nèi)源性過氧化物酶用3%的雙氧水阻斷5min，然后用一抗（抗-iNOS抗體、抗-COX-2抗體）分別孵育踝關(guān)節(jié)切片進(jìn)行免疫組化。再進(jìn)行二抗（抗兔 IgG H&L）重吸收反應(yīng)后，用PBST緩沖液沖洗玻片3次，每次5min。用DAB染色液避光染色5min，洗滌后染色終止。使用光學(xué)顯微鏡對(duì)圖像進(jìn)行采集和分析。使用Image J 1.8.0分析積分光密度值（IOD）。IOD=觀測圖片中所有陽性染色點(diǎn)的光密度之和。

1.7 破骨細(xì)胞檢測 采用TRAP染色。將大鼠踝關(guān)節(jié)切片脫蠟同1.6。脫蠟后切片置于含0.1%TRAP混合液中37℃溫育1h。清洗后甲基綠復(fù)染5min，晾干，中性凝膠封閉。含有≥3個(gè)細(xì)胞核TRAP染色陽性的細(xì)胞為破骨細(xì)胞并在倒置相差熒光顯微鏡（×100和×200）下計(jì)數(shù)破骨細(xì)胞。顯微鏡下拍照后使用Image J 1.8.0分析IOD值。IOD=觀測圖片中所有TRAP染色陽性點(diǎn)的光密度之和。

1.8TLR2、TLR4及MyD88 mRNA表達(dá)水平檢測 采用qRT-PCR法。應(yīng)用Trizol試劑盒提取滑膜細(xì)胞總RNA并測定濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GAPDH作為內(nèi)參，GAPDH 上游引物：5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′，下游引物：5′-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3′；TLR2上游引物：5′-CTACCAGATGCCTCCCTCTTACC-3′，下游引物：5′-GTGCTTGCTGCTCCTGAGTG-3′；TLR4 上游引物：5′-CACAGACTTGCGGGTTCTACATC-3′，下游引物：5′-AGTTCATAGGGTTCAGGGACAGG-3′；MyD88 上游引物：5′-AAGGAATGTGACTTCCAGACCA-3′；下游引物：5′-GGAATTCAGTCGCTTCTGTTGGA-3′。反應(yīng)條件為先行 95℃ 30s，然后 95℃ 5s，60℃ 30s，95℃ 15s，55℃ 30s，95℃ 15s循環(huán)45次。使用Nanodrop 2000分光光度計(jì)檢測TLR2、TLR4及MyD88 mRNA表達(dá)水平，使用 2-ΔΔCT法分析結(jié)果。

1.9 TLR2、TLR4、NF-κB、磷酸化 NF-κB（p-NF-κB）及MyD88蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。使用裂解酶和苯甲基磺酰氟充分裂解滑膜細(xì)胞，完全裂解后離心，取上清液進(jìn)行蛋白定量分析。使用10%SDSPAGE分離蛋白并分別轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，5%脫脂奶粉封閉1h，所得的膜使用一抗（抗TLR2抗體、抗TLR4抗體、抗 NF-κB 抗體、抗 p-NF-κB 抗體、抗 MyD88抗體和抗GAPDH抗體）在4℃條件下孵育過夜。第2天再用二抗（HRP羊抗兔 IgG）在室溫下將膜孵育2h，然后在膜上滴加適量ECL顯影液，最后使用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnet-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AIA大鼠后足變化 造模后28d拍攝后足變化典型圖片顯示AIA大鼠足踝部各關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯腫脹，AI指數(shù)達(dá)到4分，見圖1。分析各組大鼠后足AI發(fā)現(xiàn)，模型對(duì)照組、預(yù)治療組、同時(shí)治療組及低、中、高劑量治療組大鼠AI在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)均有所下降。與模型對(duì)照組比較，預(yù)治療組、同時(shí)治療組及低、中、高劑量治療組AI均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中高劑量治療組降低最明顯，見圖2。

圖1 AIA大鼠后足變化典型圖片

圖2 各組大鼠后足AI變化曲線

2.2 各組大鼠iNOS和COX-2表達(dá)水平比較 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組踝關(guān)節(jié)切片iNOS和COX-2表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。與模型對(duì)照組比較，預(yù)治療組、同時(shí)治療組及不同劑量治療組iNOS和COX-2表達(dá)水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表 1。

2.3 各組破骨細(xì)胞數(shù)及IOD值比較 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組破骨細(xì)胞數(shù)及IOD值均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。與模型對(duì)照組比較，中、高劑量治療組破骨細(xì)胞數(shù)及IOD值均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；但低劑量治療組、預(yù)治療組和同時(shí)治療組與模型對(duì)照組破骨細(xì)胞數(shù)及IOD值比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

表1 各組大鼠iNOS和COX-2表達(dá)水平比較

表2 各組大鼠破骨細(xì)胞數(shù)及IOD值比較

2.4 各組大鼠滑膜細(xì)胞TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表達(dá)水平比較 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表達(dá)水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。與模型對(duì)照組比較，中劑量治療組和預(yù)治療組MyD88 mRNA表達(dá)水平均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），但兩組TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；高劑量治療組TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表達(dá)水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；同時(shí)治療組TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），但兩組MyD88表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；低劑量治療組TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表達(dá)水平與模型對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖3。

圖3 各組大鼠滑膜細(xì)胞TLR2、RLT4和MyD88 mRNA表達(dá)水平比較（與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白對(duì)照組比較，△P＜0.01）

2.5 不同劑量CFZ對(duì)Toll樣受體（TLRs）/MyD88/NF-κB信號(hào)通路影響 低、中、高劑量CFZ均可明顯抑制TLR2、TLR4和 NF-κB蛋白表達(dá)，中、高劑量CFZ可明顯抑制p-NF-κB蛋白表達(dá)，僅在高劑量治療組中可觀察到MyD88蛋白表達(dá)抑制，見圖4。

圖4 不同劑量CFZ作用后TLRs/MyD88/NF-κB信號(hào)通路各蛋白表達(dá)的電泳圖

3 討論

RA是一種慢性自身免疫性疾病，好發(fā)于中年女性，其病理學(xué)特點(diǎn)為慢性滑膜炎、滑膜細(xì)胞增生浸潤，血管翳形成，最終導(dǎo)致四肢對(duì)稱性關(guān)節(jié)破壞。RA早期臨床常表現(xiàn)為對(duì)稱性四肢小關(guān)節(jié)腫痛、晨僵、關(guān)節(jié)功能下降，終末期常出現(xiàn)不可逆關(guān)節(jié)損傷、關(guān)節(jié)畸形、功能障礙，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。目前RA的治療藥物主要有非甾體類抗炎藥物、包括改善病情抗風(fēng)濕藥和免疫抑制劑在內(nèi)的慢作用抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素和生物制劑等[8]。這些藥物因能夠調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抑制局部炎癥、緩解關(guān)節(jié)腫痛、延緩病情發(fā)展而廣泛應(yīng)用于RA治療。雖然這些藥物能夠在一定程度上改善患者癥狀，延緩病情進(jìn)展，但仍無法逆轉(zhuǎn)RA病變。因此有必要尋找一種新的有效的RA潛在治療藥物。

CFZ為第二代不可逆性蛋白酶體抑制劑，通過特異性抑制20S蛋白酶體的糜蛋白催化位點(diǎn)達(dá)到抑制細(xì)胞生長作用，主要應(yīng)用于多發(fā)性骨髓瘤治療[9]。也有文獻(xiàn)報(bào)道CFZ可以對(duì)未分化型甲狀腺癌[10]、頭頸部癌[5]和結(jié)腸癌[11]等起到一定治療作用。文獻(xiàn)報(bào)道顯示第一代蛋白酶體抑制劑對(duì)AIA大鼠有抗炎、抗RA作用[12]，但到目前為止，CFZ研究多集中在惡性腫瘤治療上，尚無關(guān)于CFZ對(duì)RA治療效果的研究報(bào)道。

AIA大鼠被廣泛應(yīng)用于人類RA研究，其病理生理學(xué)特性很好地模擬了人類RA，其中包括炎癥反應(yīng)、滑膜增生、骨破壞及關(guān)節(jié)退變[13]，常用于RA治療藥物的篩選研究。本研究采用弗氏佐劑誘導(dǎo)建立AIA大鼠，并使用AI對(duì)關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)估。免疫組化結(jié)果顯示關(guān)節(jié)切片中iNOS和COX-2高表達(dá)也同樣證實(shí)AIA大鼠炎癥因子大量釋放及建模成功。采用不同劑量CFZ對(duì)AIA大鼠治療觀察其抗RA療效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CFZ抗RA具有劑量依賴性、并表現(xiàn)出下調(diào)踝關(guān)節(jié)iNOS及COX-2表達(dá)水平的能力。預(yù)治療組和模型對(duì)照組比較結(jié)果顯示CFZ具有一定程度預(yù)防RA的作用；同時(shí)治療組和模型對(duì)照組比較結(jié)果提示在RA形成過程中使用CFZ可以達(dá)到更有效治療效果。TRAP染色結(jié)果同樣表明CFZ能夠抑制破骨細(xì)胞分化和形成，從而達(dá)到緩解RA進(jìn)展效果?；诒狙芯克⒌腁IA大鼠，采用不同劑量、不同治療時(shí)間對(duì)AIA大鼠進(jìn)行治療，結(jié)果顯示CFZ具有治療RA的潛在作用。

TLRs是炎癥反應(yīng)鏈的起始蛋白并通過募集多種適配蛋白、在細(xì)胞內(nèi)啟動(dòng)促炎癥/抗炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其亞型TLR4為關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)蛋白之一[14]。TLR2和TLR4主要在細(xì)胞膜中表達(dá)，研究顯示其在RA發(fā)病機(jī)制中起重要作用[15]。本研究采用qRT-PCR法分析治療組和模型對(duì)照組游離滑膜組織中TLR2、TLR4和MyD88 mRNA表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)隨著CFZ劑量增加，TLR2、TLR4和MyD88表達(dá)水平明顯下調(diào)。據(jù)此推斷CFZ的抗RA機(jī)制可能為：TLR2、TLR4被激活后與MyD88的TLR結(jié)構(gòu)域結(jié)合并聚集IL-1受體相關(guān)蛋白（IRAK），通過磷酸化IRAK4及IRAK1，進(jìn)一步激活腫瘤壞死因子相關(guān)因子6（TRAF6），并依次降低下游信號(hào)蛋白轉(zhuǎn)錄生長因子β激酶 1（TAK1）、NF-κB 誘導(dǎo)激酶（NIK）及 IκB 激酶（IKK）的表達(dá)，解除對(duì)NF-κB抑制作用，使NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核并形成活化的p-NF-κB參與炎癥反應(yīng)[16]。TLRs激活信號(hào)通路可能導(dǎo)致下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及前炎癥因子產(chǎn)物 TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS 和 COX-2 激活、表達(dá)與分泌，引發(fā)宿主炎癥反應(yīng)[17]。研究證實(shí)激活TLR4能夠進(jìn)一步通過MyD88激活下游NF-κB，同時(shí)在RA患者和膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠中均發(fā)現(xiàn)NF-κB被高度激活并參與滑膜炎癥性增生、關(guān)節(jié)軟骨破壞調(diào)節(jié)[18-19]。TLRs信號(hào)通路，尤其是TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路被證實(shí)是RA的重要發(fā)病機(jī)制[20]。本研究發(fā)現(xiàn)CFZ可以抑制滑膜細(xì)胞 TLR2、TLR4、MyD88 mRNA 表達(dá)，Western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)CFZ能夠抑制游離滑膜細(xì)胞中TLR2、TLR4、NF-κB、p-NF-κB 和 MyD88 蛋白表達(dá)。因此，筆者推斷CZF可能通過下調(diào)TLRs/MyD88/NF-κB信號(hào)通路達(dá)到抑制關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)的效果。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示CFZ對(duì)AIA大鼠有一定的治療作用及預(yù)防作用，其機(jī)制可能是通過下調(diào)關(guān)節(jié)iNOS及COX-2的表達(dá)，調(diào)控滑膜細(xì)胞TLRs/MyD88/NF-κB信號(hào)通路，降低關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)及抑制破骨細(xì)胞而起到抗RA效果。