董雷 馬春芳 蔡宛如

小窩蛋白-1（caveolin-1，Cav-1）是細胞膜上膜內(nèi)陷型胞膜囊泡-小窩的結(jié)構(gòu)和功能性標志蛋白，在細胞信號轉(zhuǎn)導、膽固醇轉(zhuǎn)運、細胞內(nèi)吞等方面發(fā)揮重要作用[1]。Cav-1廣泛存在于肺泡Ⅰ型上皮細胞膜上。近年研究發(fā)現(xiàn)Cav-1在急性肺損傷肺水腫發(fā)病始動機制中起重要作用，與肺泡上皮細胞通透性、鈉水轉(zhuǎn)運有關(guān)[2]。本課題組前期研究結(jié)果也表明Cav-1在小鼠急性肺損傷時的表達水平明顯高于正常小鼠[3]，這提示Cav-1在急性肺損傷發(fā)病中起重要作用。本研究試圖構(gòu)建Cav-1重組慢病毒，并驗證其在293T細胞中的表達，以期為構(gòu)建Cav-1高表達的急性肺損傷動物模型提供實驗材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和質(zhì)粒 293T細胞購于上海ATCC細胞庫，大腸桿菌DH5α、GV287慢病毒載體購自上海吉凱基因公司。

1.1.2 實驗動物 清潔級雄性C57BL6小鼠24只購于上海斯萊克公司。

1.2 主要試劑和儀器 1kp DNA ladder Marker（批號：#SM0311）購于加拿大Fermentas公司，250bp DNA ladder Marker（批號：DL250+，100T）購于上海捷瑞公司，瓊脂糖（批號：GA4-100）購于上海賽百盛基因技術(shù)有限公司，Taq酶、dNTP、內(nèi)切酶等購于大連TAKARA公司，In-FusionTMPCR Cloning Kit（批號：63962）購于美國Clontech公司，質(zhì)粒抽提試劑盒（批號：A1460）購于美國Promega公司，F(xiàn)BS、DMEM細胞培養(yǎng)試劑購于美國Gibco公司，invitrogen lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購于美國 invitrogen公司，Cav-1（D46G3）X 兔單抗和 β-actin抗體購于美國CST公司。PCR儀（型號：2720 thermal cycler）購于美國Applied Biosystems公司，穩(wěn)壓DNA電泳儀購于美國Bio-Rad公司，凝膠成像儀購于上海天能科技有限公司，細菌搖床（型號：HI-9211K）購于華利達實驗設(shè)備公司。

1.3 方法

1.3.1 Cav-1重組慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建和檢驗 慢病毒載體GV287原件順序為Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP，克隆位點為BamHI/BamHI。根據(jù)目的基因Cav-1（NM_007616）設(shè)計 PCR 引物，上游引物：5′-GGAGGTAGTGGAATGGATCCCGCCACCATGTCTGGGGGCAAATACGTAG-3′，下游引物：5′-TCACCATGGTGGCGGGATCTATCTCTTTCTGCGTGCTGATGC-3′。該引物已含交換配對堿基、酶切位點，并含有目的基因5′端部分序列用于PCR釣取目的基因。采用PCR法獲取Cav-1基因。慢病毒質(zhì)粒經(jīng)酶切后瓊脂糖電泳回收，PCR產(chǎn)物Cav-1基因交換入線性GV287慢病毒質(zhì)粒，克隆成Cav-1重組慢病毒質(zhì)粒。經(jīng)過PCR鑒定，鑒定引物為Globin-F 上游引物：5′-ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC-3′，pEGFP-N-3 下游引物：5′-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3′，篩選出陽性克隆。用氯化鈣制備新鮮大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，對陽性克隆進行測序鑒定。

1.3.2 Cav-1重組慢病毒的包裝 將處于對數(shù)生長期的293T細胞接種于24孔板中，每孔細胞數(shù)約為2×104/ml，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細胞融合度達到約80%。按照invitrogen lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑使用說明轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染6h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基。1.3.3 Cav-1重組慢病毒的功能測定 轉(zhuǎn)染293T細胞24h后，觀察質(zhì)粒上熒光標記基因的表達情況，若熒光率＞80%，拍完熒光后補加500μl正常培養(yǎng)基，待長滿后收集細胞用于RNA提取或蛋白質(zhì)檢測。

1.3.4 293T細胞中Cav-1蛋白表達水平檢測 采用Western blot法收集轉(zhuǎn)染后24h的293T細胞，在冰浴條件下用細胞裂解液裂解細胞，13 000r/min低溫離心，收集上清液煮沸備用。取20μg上樣量用10%SDS-PAGE電泳分離，400mA 1.5h轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%BSA封閉2h，Cav-1（1∶1 000）4℃孵育過夜，次日 TBST 洗滌后，用標記二抗（1∶1 000）孵育 2h 后顯影。

1.3.5 Cav-1重組慢病毒質(zhì)粒的收集、濃縮及滴度測定收集富含病毒的細胞上清液，密度梯度離心和超濾去除絕大部分細胞蛋白，濃縮后得到高濃度重組慢病毒，分裝保存于-80℃。取少量采用實時定量PCR法測定病毒滴度，用質(zhì)粒作為標準品設(shè)立標準曲線，待測樣品與標準曲線比較后，得到Cav-1重組慢病毒的滴度。

1.3.6 Cav-1重組慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠 將24只C57BL6 小鼠分為陰性對照組、1×108pfu/鼠組、5×108pfu/鼠組和10×108pfu/鼠組4組，每組6只。所有小鼠均采用乙醚麻醉，固定頭部使鼻腔垂直向上。陰性對照組用1×108pfu/鼠濃度的Cav-1空載體病毒經(jīng)鼻腔滴注至肺內(nèi)，對肺組織中的支氣管平滑肌細胞、肺泡上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞進行轉(zhuǎn)染；1×108pfu/鼠組、5×108pfu/鼠組和 10×108pfu/鼠組分別采用 1×108pfu/鼠、5×108pfu/鼠、10×108pfu/鼠3個梯度的重組慢病毒Cav-1經(jīng)鼻腔滴注至肺內(nèi)進行轉(zhuǎn)染，3d后采用免疫組化法檢測肺組織中Cav-1的表達情況。

2 結(jié)果

2.1 目的載體酶切結(jié)果以及目的基因獲取 慢病毒載體經(jīng)BamHI酶切電泳后，為6kb左右的載體片段（圖1）。目的基因 Cav-1（NM_007616）經(jīng) PCR擴增后獲得580bp的片段（圖2）。

圖1 目的載體酶切電泳圖（1：10kb Marker；2：載體酶切電泳；3：未酶切載體電泳）

圖2 目的基因Cav-1 PCR產(chǎn)物電泳圖（1：Marker；2：Cav-1 產(chǎn)物）

2.2 Cav-1重組慢病毒構(gòu)建及PCR擴增鑒定測序 PCR產(chǎn)物交換入線性化表達載體，PCR鑒定的陽性轉(zhuǎn)化子為805bp（圖3），經(jīng)過測序鑒定，序列正確。

圖 3 PCR 擴增鑒定結(jié)果（1：Marker；2~6：陽性轉(zhuǎn)化子）

2.3 Cav-1重組慢病毒轉(zhuǎn)染293T細胞及鑒定 Cav-1重組慢病毒轉(zhuǎn)染293T細胞后進行熒光檢測，細胞內(nèi)可觀察到明顯的熒光（圖4），說明目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常、目的質(zhì)粒熒光標記基因表達正常。Western blot法檢測293T細胞Cav-1蛋白表達，目的基因融合蛋白大小為48kd，結(jié)果可見48kd附近有特征條帶，與目的基因融合蛋白相吻合（圖5）。

圖4 Cav-1重組慢病毒轉(zhuǎn)染293T細胞的熒光檢測（a：明場；b：暗場；熒光顯微鏡下，×200）

圖 5 Western blot法檢測 Cav-1蛋白表達（M：蛋白 Marker；1：SURVIVIN-3FLAG-GFP陽性對照；2：未轉(zhuǎn)染293T細胞樣品；3：Cav-1重組慢病毒轉(zhuǎn)染293T后樣品）

2.4 Cav-1重組慢病毒滴度測定 實時定量PCR法檢測重組慢病毒滴度，結(jié)果得出Cav-1重組慢病毒滴度為1.3×1012copies/ml。

2.5 Cav-1重組慢病毒在動物體內(nèi)的驗證 Cav-1重組慢病毒轉(zhuǎn)染3d后，免疫熒光顯示，小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，Cav-1在平滑肌細胞、肺泡上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞呈現(xiàn)表達，其中陰性對照組Cav-1表達稍微弱，隨著Cav-1重組慢病毒在小鼠體內(nèi)的濃度升高，其肺組織中Cav-1 表達也逐漸增高，其中 5×108pfu/鼠組、10×108pfu/鼠組轉(zhuǎn)染后肺組織Cav-1表達水平均明顯高于1×108pfu/鼠組和陰性對照組（圖6）。

圖6 慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠體內(nèi)肺組織中Cav-1的表達情況（a：陰性對照組；b：1×108pfu/鼠組；c：5×108pfu/鼠組；d：10×108pfu/鼠組；免疫組化法，×400）

3 討論

急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征的發(fā)病過程極其復雜，其機制尚未完全明了，但目前認為肺泡上皮屏障的破壞是其重要的發(fā)病機制之一，即肺泡上皮細胞的彌漫性損害，肺泡表面活性物質(zhì)減少，基底膜通透性增加，導致肺臟實質(zhì)細胞損傷和肺間質(zhì)水腫[2]。Cav-1是肺泡上皮細胞膜上小窩的主要結(jié)構(gòu)蛋白，處于細胞各路信息平臺的中心位置，使得各路信號通路之間相互影響成為可能[4]。當肺泡上皮細胞受到外界有害物質(zhì)（如脂多糖）侵襲后，首先激活的是位于細胞膜小窩內(nèi)的磷脂酶A2（PLA2），水解肺泡上皮細胞膜磷脂，造成膜結(jié)構(gòu)和功能破壞，導致滲透性肺水腫；其次PLA2啟動炎癥介質(zhì)生成，促進炎癥介質(zhì)聚集和活化，并作用于其他細胞如肺泡巨噬細胞、肺血管內(nèi)皮細胞、中性粒細胞等效應(yīng)細胞，釋放各類炎癥介質(zhì)如TNF-α、IL-6等[5-6]。這些炎癥介質(zhì)又可激活小窩內(nèi)各類絡(luò)氨酸膜類受體及下游分子、G蛋白偶聯(lián)受體及下游分子、非受體類絡(luò)氨酸激酶等。這其中Cav-1通過其“腳手架”結(jié)構(gòu)域與各信號通路起到了調(diào)節(jié)信號傳導互通的功能。因此Cav-1在急性肺損傷炎癥反應(yīng)中起重要作用。

本實驗成功構(gòu)建Cav-1重組慢病毒，為進一步建立過表達Cav-1的肺泡上皮細胞株及動物小鼠C57BL6的肺損傷模型，研究Cav-1在急性肺損傷中肺泡Ⅰ型上皮細胞炎癥反應(yīng)中的作用以及與各信號通路之間的作用和關(guān)系提供了實驗依據(jù)。