趙小云 謝德芳

摘要：分散固相萃?。≦uEChERS）為樣品前處理方法，建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時檢測香蕉中苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺農(nóng)藥殘留的分析方法。樣品經(jīng)乙腈提取，N-丙基乙二胺凈化，超高效液相色譜分離，電噴霧電離、正負離子掃描，單四極桿串聯(lián)質(zhì)譜以多反應監(jiān)測掃描方式對樣品進行檢測，采用基質(zhì)匹配標準品外標法進行定量分析。結(jié)果表明，苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺在0.05～0.50 μg/L時呈良好的線性關(guān)系，基質(zhì)標準曲線分別為y=3.17×104x+1.18×106（r=0.999 4）、y=6.04×103x+8.3×105（r=0.999 3）。在0.1、1.0、10.0 mg/kg 3個添加水平下，苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺的平均回收率分別為94.9%～107.5%、93.6%～102.3%;相對標準偏差分別為7.2%～9.0%、3.2%～9.3%;苯醚甲環(huán)唑的檢出限和定量限分別為1.0、3.3 μg/kg，噻呋酰胺的檢出限和定量限分別為0.5、3.3 μg/kg。樣品經(jīng)測定，發(fā)現(xiàn)不套袋處理下，苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺的半衰期分別為11.0、14.7 d;套袋前施藥，苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺的半衰期分別為23.1、16.1 d;2種農(nóng)藥的安全間隔期都是35 d。

關(guān)鍵詞：苯醚甲環(huán)唑;噻呋酰胺;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;香蕉;農(nóng)殘檢測

中圖分類號： S482.2;TQ450.2+63 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0181-05

苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺都是新型的廣譜、低毒、內(nèi)吸性強、環(huán)境友好型的高效殺菌劑[1-3]，對真菌引起的葉斑病、炭疽病和立枯病等有較好的治療和防治作用[4-6]，是防治香蕉葉斑病的主要農(nóng)藥品種。

目前已報到的苯醚甲環(huán)唑的檢測方法有氣相色譜-電子捕獲檢測器（GC-ECD）[7]、表面增強拉曼光譜的快速檢測[8]、直接酶聯(lián)免疫[9]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[10-11]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[12-14]等，噻呋酰胺的檢測方法有高效液相色譜[15]、GC-ECD[16]、氣相色譜-離子阱質(zhì)譜[17]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[18]等。但同時檢測這2種農(nóng)藥的方法還未見報道，其中氣相色譜檢測時間較長，不適合大量樣品的使用，拉曼光譜和酶聯(lián)免疫等快速檢測技術(shù)的靈敏度較低，尚不能普遍使用。

隨著串聯(lián)質(zhì)譜的發(fā)展，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜也越來越多地出現(xiàn)在農(nóng)藥殘留分析中，其具有靈敏度高、檢測時間短、準確度高等特點。農(nóng)藥前處理方法使用最廣的當屬分散固相萃?。≦uEChERS），因其具有快速、簡單、廉價、有效、可靠及安全的特點，成為國內(nèi)外的研究熱點，QuEChERS起初是高水分含量的果蔬中農(nóng)藥殘留分析的前處理方法，后來在固相微萃取和鹽溶緩沖的提取和凈化過程中得到應用，現(xiàn)可以用在大量樣品的廣譜分析中。林濤等使用QuEChERS前處理方法和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測定蔬菜中的41種農(nóng)藥殘留，檢出限為0.003～1.000 μg/kg，該方法的回收率為74.1%～120.4%，相對標準偏差為2.8%～11.9%，該方法快速、簡便、靈敏度高、凈化效果好[18]。王連珠等采用QuEChERS-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測定蔬菜中66種有機磷農(nóng)藥的殘留量，該方法的回收率為55%～122%，相對標準偏差為1.6%～18.0%，定量限為0.1～8.0 μg/kg，該方法靈敏簡便，符合法規(guī)殘留限量檢測要求[19]。

本研究采用QuEChERS為樣品前處理方法，建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法同時對香蕉中的苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺進行檢測，以期為農(nóng)藥殘留檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國AB SCIEX公司生產(chǎn)）;多管漩渦混合器（北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司生產(chǎn)）;電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn)];落地式高速冷凍離心機（賽默公司生產(chǎn)）;渦旋混合器（上海青浦滬西儀器廠生產(chǎn)）;有機相針式濾器（尼龍）（13 mm，0.22 μm，上海安譜實驗科技股份有限公司生產(chǎn)）;一次性使用無菌注射器（江西宏達醫(yī)療器械集團有限公司生產(chǎn)）;氮吹儀（杭州德克爾實驗設備有限公司生產(chǎn)）;色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×50 mm，Waters公司生產(chǎn)）。

甲醇[賽默飛世爾科技（中國）有限公司生產(chǎn)]，分析純;乙腈[賽默飛世爾科技（中國）有限公司生產(chǎn)];氯化鈉（廣州化學試劑廠生產(chǎn)）;C18、石墨化碳（GCB）、N-丙基乙二胺（PSA）（美國安捷倫公司生產(chǎn)）;噻呋酰胺標準品、苯醚甲環(huán)唑標準品（阿拉丁公司生產(chǎn)）。

1.2 田間試驗

試驗時間：2017年2月22日至5月12日。試驗地點：海南省?？谑兄袊鵁釒мr(nóng)業(yè)科學院分析測試中心試驗基地。試驗藥劑：27.8%噻呋酰胺·苯醚甲環(huán)唑懸浮劑（噻呋酰胺含量為13.9%、苯醚甲環(huán)唑含量為13.9%）。試驗作物：香蕉。施藥時期及施藥方法：果實半大時，在果實不套袋、套袋前、套袋后整株噴施藥劑。樣品的采集與制備：采樣距施藥間隔期分別為0、1、3、5、7、14、21、28、35、42、49 d。按照試驗設計時間要求，以隨機方法用小刀在試驗香蕉樹不同方向及上、中、下等不同部位采集7～8條（不少于2 kg）生長正常、無病害、施藥時確定已著藥的香蕉，裝入塑料袋中包扎妥當，并貼上標簽。將采集的樣品切碎，勻漿裝袋，貼上標簽后于-20 ℃冰柜中冷凍保存，待測。

1.3 樣品前處理方法

準確稱取10.0 g香蕉樣品于50 mL離心管中，加入 20 mL 乙腈，勻漿2 min，渦旋2 min提取，以8 000 r/min離心5 min;取全部上清液于加入10 g氯化鈉的離心管中，渦旋 1 min，以8 000 r/min離心5 min;取10 mL上清液于含PSA和無水硫酸鎂的離心管中，渦旋1 min后，以8 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm有機膜，待進樣。

1.4 凈化劑優(yōu)化方法

本試驗采用QuEChERS為樣品前處理方法，對常用的凈化劑PSA、GCB和C18進行選擇。3種凈化劑可有效除去樣品中的脂肪酸、色素、甾醇類等物質(zhì)[20]。本試驗以 0.1 mg/kg 為添加水平，對比分析3種凈化劑對苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺的回收率。

1.5 基質(zhì)標準溶液的配制和基質(zhì)效應測定

精確稱取0.010 0 g苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺（99.8%）標準品（精確至0.000 1 g），用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成濃度為100 μg/mL的儲備液，于4 ℃冰箱中保存。準確移取適量儲備液，分別用甲醇稀釋成10.00、5.00、1.00、0.10、0.05 μg/mL系列濃度的標準品溶液。按照“1.2”節(jié)中所述的方法，對空白香蕉樣品進行處理，取一定體積的適量濃度標準溶液，加入2 mL的容量瓶中，氮氣吹干，加處理過的空白香蕉基質(zhì)，配制成0.05、0.10、0.20、0.30、0.50 μg/mL基質(zhì)標準溶液，過0. 22 μm有機膜，待進樣。本研究采用相對響應值法：基質(zhì)效應=空白基質(zhì)標準響應值/純?nèi)軇藴薯憫担|(zhì)效應>1時，表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應;基質(zhì)效應<1時，表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應。

1.6 色譜-質(zhì)譜條件

1.6.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）;柱溫為40 ℃;進樣量為 0.25 μL。色譜洗脫條件見表1。

1.6.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源;掃描模式為正、負離子掃描;離子源氣體1（GS1）為344.5 kPa，離子源氣體2（GS2）為344.5 kPa;離子噴霧電壓為5 500 V;氣簾氣為 137.8 kPa;離子源溫度為600 ℃。檢測方式為多重反應監(jiān)測。其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗條件的優(yōu)化

2.1.1 提取劑的優(yōu)化 本試驗對比分析了3種常用提取劑丙酮、乙酸乙酯和乙腈的提取效果，丙酮和乙酸乙酯易揮發(fā)，并且提取物中會有較多的其他成分，容易產(chǎn)生基質(zhì)干擾[21]。香蕉具有較大的黏性，用乙腈作為提取劑，可以大大減少香蕉樣品基質(zhì)中蠟質(zhì)、脂肪和一些親脂性色素的提取量，并且乙腈對各種農(nóng)藥均有較好的提取效果[22]。因此本試驗選擇乙腈作為提取劑。

2.1.2 凈化劑的優(yōu)化 由表3可知，使用PSA、GCB、C18做凈化劑，苯醚甲環(huán)唑回收率的平均值分別為104.2%、91.2%、96.2%。相對標準偏差分別為8.5%、8.2%、3.5%，3種凈化劑對苯醚甲環(huán)唑都有較好的回收率，都能滿足試驗要求。以PSA、GCB、C18做凈化劑，對噻呋酰胺回收率的平均值分別為94.1%、117.3%、104.3%，相對標準偏差分別為9.2%、15.5%、15.8%，PSA凈化劑對噻呋酰胺的回收率和相對標準偏差能滿足要求，GCB對噻呋酰胺的回收率為117.3%，可見對溶劑有一定的吸收，回收率偏高，且相對標準偏差大于10%，不滿足試驗要求，C18的相對標準偏差也不達標。因此綜合來看，本試驗使用PSA做凈化劑能同時對苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺有較好的回收率，且能滿足試驗要求。

2.1.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化 本試驗通過對影響定量離子響應度和靈敏度的關(guān)鍵質(zhì)譜參數(shù)去簇電壓和碰撞能量進行優(yōu)化，苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺最優(yōu)去簇電壓和碰撞能量分別為 138.0 V、35.0 eV和-96.0 V、-28.9 eV。

2.1.4 色譜條件優(yōu)化 色譜柱的選擇：苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺是極性較強的化合物，適合采用反相色譜分離，本試驗采用ACQUITY UPLCBEH C18（2.1 mm×50.0 mm，1.7 μm）色譜柱具有較好的分離效果。流動相組成、比例和流速的選擇：使用0.1%甲酸溶液，相比超純水，甲醇溶液具有較高的靈敏度。按照“1.6.1”中的梯度洗脫條件，目標物具有較好的保留時間、峰形和和分離效果。優(yōu)化條件下的色譜圖如圖1、圖2所示。

2.2 基質(zhì)效應

在超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）分析中，基質(zhì)效應是影響定量分析結(jié)果最重要的因素之一[23]?；|(zhì)效應可導致目標分析物信號的增強或減弱，從而使分析結(jié)果不可靠。

由表4可知，苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺的基質(zhì)效應均小于1，表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應，且低濃度時基質(zhì)抑制效應較大;濃度越高，基質(zhì)抑制效應整體越弱。因此試驗采用基質(zhì)匹配標準溶液校正方法對基質(zhì)效應進行補償，以降低基質(zhì)效應的干擾。

2.3 標準曲線和線性范圍

將 0.05、0.10、0.20、0.30、0.50 μg/mL系列濃度的苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺標準溶液和香蕉基質(zhì)標準溶液在“1.5”節(jié)所述的條件下進樣，以其峰面積（y）和相應標準樣品濃度（x）作標準曲線。苯醚甲環(huán)唑的基質(zhì)標準曲線為y=3.17×104x+1.18×106（r=0.999 4）;噻呋酰胺的基質(zhì)標準曲線為y=6.04×103x+8.3×105（r=0.999 3）。

2.4 方法的準確度、精密度

在空白香蕉中分別進行0.1、1.0、10.0 mg/kg 3個水平的加標回收試驗，每個水平重復測定5次，計算加標回收率和相對標準偏差。由表5可知，在0.1、1.0、10.0 mg/kg 3個添加水平下，苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺的平均回收率分別為94.9%～107.5%、93.6%～102.3%，相對標準偏差分別為7.2%～9.0%、3.2%～9.3%，方法顯示出良好的準確度和精密度，可以滿足試劑樣品中農(nóng)藥殘留的檢測要求。

2.5 方法的檢出限和定量限

檢出限是指使檢測系統(tǒng)產(chǎn)生3倍噪音信號所需待測物的濃度或質(zhì)量（3倍信噪比計算）。定量限是指使用添加方法能檢測出待測物在樣品中的最低含量（10倍信噪比計算）。分別以0.01、0.02 mg/kg添加水平的色譜圖進行衡量，得到苯醚甲環(huán)唑的檢出限和定量限分別為1.0、3.3 μg/kg，噻呋酰胺的檢出限和定量限分別為0.5、3.3 μg/kg。如圖3、圖4所示。

2.6 樣品檢測結(jié)果與分析

2.6.1 苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺的消解動態(tài)分析 由表6可知，不套袋施藥，苯醚甲環(huán)唑在香蕉中消解的一級熱力學方程為C=2.024 9e-0.063 0t（R2=0.953 4），半衰期=11.0 d;套袋前施藥，苯醚甲環(huán)唑在香蕉中消解的一級熱力學方程為 C=1.152 4e-0.030 0t （R2 = 0.853 6）， 半衰期=23.1 d。由表7可知，不套袋處理下，噻呋酰胺在香蕉中的消解的一級熱力學方程為方C=1.459 3e-0.047 0t（R2=0.935 6），半衰期=14.7 d;套袋前施藥，噻呋酰胺在香蕉中的消解的一級熱力學方程為C= 2.050 6e-0.040 0t（R2=0.879 4），半衰期=16.1 d。

2.6.2 苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺最終殘留分析 對香蕉樣品進行檢測，得到苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺的最終殘留數(shù)據(jù)（表8）。在35 d時，苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺的最終殘留量均小于其最大殘留限量（1 mg/kg）。因此安全間隔期均為35 d。

3 結(jié)論

本研究通過對樣品前處理方法、質(zhì)譜條件和色譜條件的優(yōu)化，建立了QuEChERS-HPLC-MS/MS同時測定香蕉中苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺殘留量的分析方法，該方法前處理簡單、快速、回收率高，方法的靈敏度、準確度和精密度等均滿足農(nóng)藥殘留分析的要求，適用于大量樣品的快速檢測。

通過對香蕉樣品進行檢測，得到苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺在香蕉中的消解動態(tài)和最終殘留數(shù)據(jù)，不套袋處理下，苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺的半衰期分別為11.0、14.7 d，套袋前施藥，苯醚甲環(huán)唑和噻呋酰胺的半衰期分別為23.1、16.1 d，2種農(nóng)藥的安全間隔期都是35 d。

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