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        HPLC法同時測定大黃藥材中8個非蒽醌類成分的含量Δ

        2019-08-13 10:02:38陸文瑾竇志華曹瑞倪麗麗戴瑩宜興市第二人民醫(yī)院藥劑科江蘇宜興214221南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院藥學(xué)部江蘇南通226006南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院南京21002
        中國藥房 2019年14期
        關(guān)鍵詞:丁酮蒽醌白藜蘆醇

        陸文瑾,竇志華,曹瑞,倪麗麗,戴瑩(1.宜興市第二人民醫(yī)院藥劑科,江蘇宜興214221;2.南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院藥學(xué)部,江蘇南通 226006;.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,南京 21002)

        大黃為蓼科植物掌葉大黃(Rheum palmatumL.)或唐古特大黃(Rheum tanguticumMaxim.et Balf.)或藥用大黃(Rheum officinaleBail.)的干燥根和根莖[1],是世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用的中草藥之一[2-3]。我國國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中的800多個中成藥處方中均含有大黃,故其質(zhì)量的優(yōu)劣可影響用藥的有效性和安全性[4-5]。2015年全國范圍內(nèi)的抽檢結(jié)果顯示,目前市場上流通的大黃藥材合格率僅約為80%,其檢驗(yàn)項(xiàng)目包括性狀、顯微鑒別、薄層鑒別、土大黃苷檢查、總灰分檢查、游離型蒽醌類成分含量測定等[6]。大黃中含有蒽醌類及蒽酮類、鞣質(zhì)類、二苯乙烯類、苯丁酮類等非蒽醌類成分[7],但部分研究僅以大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素和大黃素甲醚等蒽醌類成分作為評價大黃質(zhì)量的指標(biāo),存在一定的局限性[8],而大黃中含有的非蒽醌類成分也同樣具有一定的藥理作用[9]。如蒽酮類成分瀉下作用最強(qiáng)[10],收斂止血作用主要為鞣質(zhì)類成分[11],二苯乙烯苷類成分具有抗氧化、抗腫瘤、保肝、調(diào)脂、預(yù)防并治療動脈粥樣硬化作用[12],苯丁酮苷類是大黃中具有活性的一類重要化合物[13]。2015年版《中國藥典》(一部)[1]僅對大黃藥材中5個游離型蒽醌類成分的含量作出規(guī)定:不得少于0.20%,其酸解后的總蒽醌含量不得少于1.5%;《歐洲藥典》(9.0版)[14]也僅規(guī)定了總蒽醌含量不得少于2.2%。鑒于對單一組分的檢測尚無法全面評價大黃的質(zhì)量,因此增加非蒽醌類成分的含量測定對大黃質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善具有重要意義[15]。

        本課題組前期建立了22批大黃藥材的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜,并在280 nm波長處得到了41個共有峰,通過外標(biāo)法測定了5個游離型蒽醌和總蒽醌的含量,通過一測多評法測定了8個結(jié)合型蒽醌的含量[16]。在此基礎(chǔ)上,本研究建立了同時測定大黃藥材中沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷、表兒茶素沒食子酸酯、白藜蘆醇4′-O-β-D-(6″-O-沒食子酰)-葡萄糖苷、番瀉苷A、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-(2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰)-葡萄糖苷等8個非蒽醌類成分含量的HPLC法,旨在為建立更全面的大黃質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

        1 材料

        1.1 儀器

        Alliance e2695型HPLC儀,包括e2695型分離單元、2998型二極管陣列檢測器、Empower 3色譜工作站(美國Waters公司);SK5200H型超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司);BT 25S型十萬分之一電子天平(德國Sartorius公司)。

        1.2 藥品與試劑

        沒食子酸對照品(批號:150226,純度:≥98%)、兒茶素對照品(批號:141224,純度:≥98%)、表兒茶素對照品(批號:140730,純度:≥98%)、表兒茶素沒食子酸酯對照品(批號:140923,純度:≥98%)、番瀉苷A對照品(批號:CHB170508,純度:≥98%)均購自成都克洛瑪生物科技有限公司;白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷對照品(批號:38963-95-0,純度:98%)、白藜蘆醇4′-O-β-D-(6″-O-沒食子酰)-葡萄糖苷對照品(批號:92834097-0,純度:98%)、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-(2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰)-葡萄糖苷(批號:950184-00-6,純度:98%)均購自上海一林生物科技有限公司;甲醇為色譜純,其他試劑均為分析純,水為純凈水。

        1.3 藥材

        22批大黃藥材中S2、S18、S22為中國食品藥品檢定研究院標(biāo)準(zhǔn)藥材粉末,S21購自南通三越中藥飲片有限公司,其余藥材樣品均由南通市食品藥品監(jiān)督中心葛建華主任中藥師饋贈。除標(biāo)準(zhǔn)藥材外,其余19批均由葛建華主任中藥師鑒定為蓼科植物掌葉大黃(R.palmatumL.)或唐古特大黃(R.tanguticumMaxim.et Balf.)或藥用大黃(R.officinaleBail.)的干燥根和根莖。除標(biāo)準(zhǔn)藥材粉末,其余藥材均粉碎成粉末,過四號篩,備用。大黃藥材來源見表1。

        表1 大黃藥材來源Tab 1 Source of Rheum palmatum

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件

        色譜柱:Symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脫(0~10 min,5%A→30%A;10~40 min,30%A→60%A;40~60 min,60%A;60~70 min,60%A→100%A;70~80 min,100%A);檢測波長:280 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:30 μL。在該色譜條件下,分離度均大于1.5,理論板數(shù)以沒食子酸計均不低于8 000,空白對照對測定無干擾,詳見圖1。

        圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

        2.2 溶液的制備

        2.2.1 供試品溶液 取樣品粉末約0.15 g,精密稱定,置于25 mL量瓶中,加甲醇24 mL,超聲(功率:200 W,頻率:53 kHz)處理30 min,冷卻后,加甲醇定容至刻度,搖勻,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

        2.2.2 對照品溶液 精密稱取兒茶素對照品9.35 mg、白藜蘆醇4′-O-β-D-(6″-O-沒食子酰)-葡萄糖苷對照品4.6 mg,分別置于2 mL量瓶中;另取沒食子酸對照品6.16 mg、表兒茶素沒食子酸酯對照品4.16 mg、番瀉苷A對照品8.04 mg、白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷對照品5.45mg、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-(2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰)-葡萄糖苷對照品11.72 mg,分別置于5 mL量瓶中;另取表兒茶素對照品5.09 mg,置于10 mL量瓶中;分別加甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,得各單一對照品貯備液。分別精密量取上述沒食子酸對照品貯備液、白藜蘆醇4′-O-β-D-(6″-O-沒食子酰)-葡萄糖苷對照品貯備液各0.5 mL,白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷對照品貯備液0.7 mL,兒茶素對照品貯備液0.8 mL,表兒茶素沒食子酸酯對照品貯備液、番瀉苷A對照品貯備液各1.0 mL,4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-(2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰)-葡萄糖苷對照品貯備液1.25mL,表兒茶素對照品貯備液1.5 mL,置于同一10 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,制得沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷、表兒茶素沒食子酸酯、白藜蘆醇4′-O-β-D-(6″-O-沒食子酰)-葡萄糖苷、番瀉苷A、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-(2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰)-葡萄糖苷質(zhì)量濃度分別為0.061 6、0.374、0.076 35、0.076 3、0.083 2、0.115、0.160 8、0.293 mg/mL的混合對照品貯備液。精密量取上述混合對照品貯備液1 mL,置于25 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻,即得沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷、表兒茶素沒食子酸酯、白藜蘆醇4′-O-β-D-(6″-O-沒食子酰)-葡萄糖苷、番瀉苷A、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-(2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰)-葡萄糖苷質(zhì)量濃度分別為0.002 464、0.014 96、0.003054、0.003 052、0.003 328、0.004 6、0.006 432、0.011 72 mg/mL的混合對照品溶液。

        2.2.3 空白對照溶液 以甲醇為空白對照。

        2.3 線性關(guān)系考察

        分別精密量取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液2.5、12.5、25 μL及混合對照品貯備液 5、10、20、30、40 μL,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄峰面積。以待測成分進(jìn)樣量(x,ng)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,回歸方程與線性范圍見表2。

        表2 回歸方程與線性范圍Tab 2 Regression equations and linear ranges

        2.4 定量限與檢測限考察

        精密量取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液適量,倍比稀釋,以信噪比10∶1、3∶1分別計算定量限、檢測限。結(jié)果,沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷、表兒茶素沒食子酸酯、白藜蘆醇4′-O-β-D-(6″-O-沒食子酰)-葡萄糖苷、番瀉苷A、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-(2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰)-葡萄糖苷的定量限分別為 3.48、4.30、6.40、4.40、3.39、2.87、8.40、4.95 ng,檢測限分別為2.32、2.58、2.40、2.64、2.26、1.23、4.20、2.97 ng。

        2.5 精密度試驗(yàn)

        取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品貯備液適量,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次,記錄峰面積。結(jié)果,沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷、表兒茶素沒食子酸酯、白藜蘆醇4′-O-β-D-(6″-O-沒食子酰)-葡萄糖苷、番瀉苷A、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-(2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰)-葡萄糖苷峰面積的RSD分別為1.66%、1.72%、2.27%、1.76%、2.29%、1.81%、2.53%、1.96%(n=6),表明儀器精密度良好。

        2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

        取“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液(編號:S21)適量,分別于室溫下放置0、3、6、12、18、24 h時按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄峰面積。結(jié)果,沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷、表兒茶素沒食子酸酯、白藜蘆醇4′-O-β-D-(6″-O-沒食子酰)-葡萄糖苷、番瀉苷A、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-(2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰)-葡萄糖苷峰面積的RSD分別為4.84%、4.20%、4.14%、4.72%、4.16%、4.33%、1.36%、1.96%(n=6),表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

        取樣品粉末(編號:S21),共6份,每份約0.15 g,精密稱定,按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品中8個成分的含量。結(jié)果,沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷、表兒茶素沒食子酸酯、白藜蘆醇4′-O-β-D-(6″-O-沒食子酰)-葡萄糖苷、番瀉苷A、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-(2″-O-沒食子酰-6″-O-對羥基桂皮酰)-葡萄糖苷的平均含量分別為0.442、4.580、0.060、0.314、1.280、0.377、3.953、1.000 mg/g,RSD分別為1.53%、3.65%、1.23%、2.21%、2.29%、1.47%、2.59%、2.91%(n=6),表明本方法重復(fù)性良好。

        2.8 加樣回收率試驗(yàn)

        取已知含量的樣品粉末(編號:S21),共6份,每份約0.075 g,分別加入一定量的各單一對照品貯備液適量,按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄峰面積并計算加樣回收率,結(jié)果見表3。

        2.9 耐用性試驗(yàn)

        取樣品粉末(編號:S21)適量,按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件[流動相B不同濃度比例(0.05%磷酸水溶液、0.10%磷酸水溶液、0.15%磷酸水溶液)、不同流速(0.9、1.0、1.1 mL/min)、不同柱溫(20、25、30 ℃)]進(jìn)樣測定,記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品中8個成分的含量,結(jié)果見表4。結(jié)果表明,該方法能夠滿足試驗(yàn)要求,耐用性良好。

        2.10 樣品含量測定

        取22批樣品粉末適量,按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定,記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算各批樣品中8個成分的含量,結(jié)果見表5。

        表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab 3 Results of recovery tests(n=6)

        3 討論

        有研究指出,在280 nm波長處,大黃成分檢出最為全面[17]。鑒于此,本研究在200~800 nm波長范圍內(nèi)對樣品進(jìn)行了全波長掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn),8個待測成分在280 nm波長處均有較強(qiáng)吸收,故選擇280 nm作為檢測波長。同時,筆者又考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液兩種流動相體系對待測成分分離情況的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),以甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動相時的出峰數(shù)目較多,且分離度良好,故選擇甲醇-0.1%磷酸水溶液作為本研究的流動相。

        雖然有研究采用HPLC法同時測定了大黃中2個蒽酮、3個鞣質(zhì)和4個苯丁酮類成分含量[18],4個苯丁酮類成分含量[19],2個蒽酮和2個鞣質(zhì)類成分含量[4,20],1個蒽酮和2個鞣質(zhì)類成分含量[21]以及2個苯丁酮類和1個二苯乙烯類成分的含量[22],但均未建立鞣質(zhì)類成分表兒茶素和二苯乙烯類成分白藜蘆醇4′-O-β-D-(6″-O-沒食子酰)-葡萄糖苷含量的測定方法。本研究結(jié)果顯示,大黃藥材樣品中這兩個成分的含量較高,分別為0.060~16.700、0.341~16.966 mg/g,因此有必要對其進(jìn)行定量分析。

        表4 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Results of durability tests

        表5 樣品含量測定結(jié)果(n=3,mg/g)Tab 5 Results of content determination of samples(n=3,mg/g)

        含量測定結(jié)果顯示,22批大黃藥材中8個成分含量存在較大差異,S1、S2、S21中8個成分的含量相對較低,而S3、S4、S14、S17含量相對較高,其含量差異可能與藥材原植物的生長年限有關(guān)。本課題組在大黃產(chǎn)區(qū)考察發(fā)現(xiàn),藥用大黃、掌葉大黃和唐古特大黃的生長年限一般分別為1、3、5年;同一基源、同一產(chǎn)區(qū)的成分含量也會存在較大差異,這可能與其生長環(huán)境如海拔、經(jīng)度、緯度、光照、種子遺傳等有關(guān)[4,23-24]。

        綜上所述,本研究所建方法簡便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng),可用于同時測定大黃藥材中8個非蒽醌類成分的含量。

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