孔征，毛樂(lè)靜，霍仕霞，蘇婭，姜萌，閆明#（.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊8300；.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，烏魯木齊 830049）

管花肉蓯蓉為列當(dāng)科植物管花肉蓯蓉[Cistanche tubulosa（Schenk）R.Wight]的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖，性溫、味甘咸，為補(bǔ)腎壯陽(yáng)、潤(rùn)腸通便之要藥，是中亞地區(qū)及新疆特有的藥用植物，主要分布于南疆塔克拉瑪干沙漠邊緣地區(qū)[1]。管花肉蓯蓉收載于2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[2]，其主要功能成分為苯乙醇苷類化合物[3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，管花肉蓯蓉中的苯乙醇苷類化合物在神經(jīng)保護(hù)[4]和延緩神經(jīng)退行性疾病[4-5]方面具有良好的開(kāi)發(fā)前景，現(xiàn)已成為研究的熱點(diǎn)之一。毛蕊花糖苷為苯乙醇苷類化合物中的活性成分之一，本課題組前期藥效評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，毛蕊花糖苷對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用[4]、對(duì)東莨菪堿所致小鼠學(xué)習(xí)記憶獲得性障礙具有改善作用[5]、對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠的氧化損傷具有抑制作用[6]。毛蕊花糖苷在管花肉蓯蓉中的含量約為0.05～8%[7]，對(duì)其進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用具有很大的藥用前景。藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，毛蕊花糖苷具有多靶點(diǎn)作用，有望開(kāi)發(fā)成保護(hù)腦神經(jīng)、改善記憶的腦病藥物[8-9]。

Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法是可靠的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及分析方法，可通過(guò)對(duì)過(guò)程的回歸擬合和響應(yīng)曲面、等高線的繪制來(lái)計(jì)算出響應(yīng)于各因素水平的響應(yīng)值，是解決多變量問(wèn)題的一種有效的統(tǒng)計(jì)方法[10]。鑒于此，本研究采用該法優(yōu)化管花肉蓯蓉中毛蕊花糖苷的提取工藝，為管花肉蓯蓉的深入開(kāi)發(fā)和綜合利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀，包括LC-20AB型二元泵、SPD-M20A型二極管陣列檢測(cè)器、CBM-20A型系統(tǒng)控制器、CTO-20A型柱溫箱、SIL-20A型自動(dòng)進(jìn)樣器（日本Shimadzu公司）；SQP-QUINTIX 35-1 CN型萬(wàn)分之一分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；DZTW型恒溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

管花肉蓯蓉炮制片（新疆維吾爾自治區(qū)和田蓯蓉堂2015年秋收炮制片，批號(hào)：20150806，毛蕊花糖苷含量：≥3.79%；將管花肉蓯蓉炮制片用藥錘敲碎，粉碎機(jī)粉碎后過(guò)四號(hào)篩，即得管花肉蓯蓉粉末，備用）；毛蕊花糖苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111530-201208，純度：92.5%）；甲醇為色譜純，甲酸、乙醇等為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 毛蕊花糖苷的含量測(cè)定

采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定。

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-3V（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.2%甲酸水溶液（40∶60，V/V）；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；進(jìn)樣量 10 μL。在上述色譜條件下，取“2.1.2”“2.1.3”“2.1.4”項(xiàng)下溶液進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取毛蕊花糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，置于10 mL棕色量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，得每1 mL含毛蕊花糖苷0.932 4 mg的對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取管花肉蓯蓉粉末100 g，按液料比8∶1（溶劑體積∶粉末質(zhì)量，mL/g，下同）加入63%乙醇，浸泡2 h，然后置于100℃恒溫水浴鍋中回流提取2次，每次1.5 h，趁熱濾過(guò)，放冷，合并提取液，精密量取提取液1 mL至25 mL量瓶中，加50%甲醇定容，即得。

2.1.4 陰性對(duì)照溶液的制備 分別以50%甲醇與63%乙醇作為陰性對(duì)照溶液。

2.1.5 方法學(xué)考察 精密量取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.2、0.5、1、2、3、5、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝19 952x－218 412（r＝0.999 8），表明毛蕊花糖苷檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為18.65～932.4 μg/mL。以信噪比10∶1、3∶1測(cè)得定量限、檢測(cè)限分別為0.229 6、0.071 8μg/mL。方法學(xué)考察結(jié)果顯示，精密度[毛蕊花糖苷峰面積的RSD為0.57%（n＝6）]、穩(wěn)定性[毛蕊花糖苷峰面積的RSD為1.38%（n＝6）]、重復(fù)性[毛蕊花糖苷峰面積的RSD為0.87%（n＝6）]、加樣回收率[毛蕊花糖苷低、中、高質(zhì)量濃度的平均加樣回收率依次為99.6%、100.5%、100.7%，RSD分別為2.55%、0.83%、0.44%（n＝9）]均符合2015年版《中國(guó)藥典》（四部）要求[11]。

2.2 提取方法

準(zhǔn)確稱取管花肉蓯蓉粉末，按一定液料比加入適宜濃度的乙醇，浸泡一定時(shí)間后，置于100℃恒溫水浴鍋中回流提取數(shù)次，趁熱濾過(guò)，放冷，合并提取液，精密移取提取液1 mL至25 mL量瓶中，以50%甲醇定容后，取樣10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算毛蕊花糖苷含量。另取管花肉蓯蓉粉末，采用2015年版《中國(guó)藥典》（一部）項(xiàng)下方法[2]進(jìn)行含量測(cè)定，并通過(guò)以下公式計(jì)算毛蕊花糖苷提取率[12]：提取率（%）＝{[提取液體積（mL）×提取液含量（mg/mL）]/[藥材質(zhì)量（g）×藥材含量（mg/g）]}×100%。

2.3 單因素試驗(yàn)

在管花肉蓯蓉苯乙醇苷類成分乙醇回流提取的過(guò)程中，浸泡時(shí)間、乙醇濃度、提取時(shí)間、液料比、提取次數(shù)等因素對(duì)提取效果有重要影響[13-14]。因此本研究以毛蕊花糖苷提取率為考察指標(biāo)，對(duì)上述因素進(jìn)行考察。

2.3.1 浸泡時(shí)間 稱取管花肉蓯蓉粉末100 g，共5份，固定提取時(shí)間為1 h、液料比為10∶1、溶劑濃度為60%、提取次數(shù)為1次，分別對(duì)浸泡時(shí)間0、2、8、12、24 h進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)圖2A。由圖2A可見(jiàn)，當(dāng)浸泡時(shí)間≥2 h，毛蕊花糖苷的提取率基本趨于穩(wěn)定，綜合考慮提取效率，最終確定最佳浸泡時(shí)間為2 h。

2.3.2 乙醇濃度 稱取管花肉蓯蓉粉末100 g，共4份，固定提取時(shí)間為1 h、液料比為10∶1、浸泡時(shí)間為2 h、提取次數(shù)為1次，分別對(duì)提取溶劑水、40%乙醇、60%乙醇和80%乙醇進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)圖2B。由圖2B可見(jiàn)，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，毛蕊花糖苷的提取效果最好；提高乙醇濃度至80%時(shí)，毛蕊花糖苷的提取效率反而下降，故選擇乙醇濃度50%～70%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3.3 提取時(shí)間 稱取管花肉蓯蓉粉末100 g，共4份，固定液料比為10∶1、乙醇濃度為60%、浸泡時(shí)間為2 h、提取次數(shù)為1次，分別對(duì)提取時(shí)間1、1.5、2、2.5 h進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)圖2C。由圖2C可見(jiàn)，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，毛蕊花糖苷提取率先增大后減小，于1.5 h達(dá)到峰值，故選擇提取時(shí)間1～2 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3.4 液料比 稱取管花肉蓯蓉粉末，100 g，共4份，固定提取時(shí)間為1.5 h、乙醇濃度為60%、浸泡時(shí)間為2 h、提取次數(shù)為1次，分別對(duì)液料比6∶1、8∶1、10∶1、12∶1進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)圖2D。由圖2D可見(jiàn)，當(dāng)液料比為8∶1時(shí)，毛蕊花糖苷的提取率最高；隨著液料比增加，毛蕊花糖苷提取率先增大后減小，故選擇液料比6∶1～10∶1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig 2 Results of single factor tests

2.3.5 提取次數(shù) 稱取管花肉蓯蓉粉末100 g，共4份，固定液料比為8∶1、乙醇濃度為60%、浸泡時(shí)間為2 h、提取時(shí)間為1.5 h，分別對(duì)提取次數(shù)1、2、3、4次進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)圖2E。由圖2E可見(jiàn)，提取2次后毛蕊花糖苷的提取率為73.57%，提取第3次與第4次時(shí)毛蕊花糖苷提取率基本不變，考慮工藝的成本，最終確定最佳提取次數(shù)為2次。

由上述單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，浸泡2 h以后，延長(zhǎng)浸泡時(shí)間所得毛蕊花糖苷的提取率基本保持不變；提取2次以后，增加提取次數(shù)所得提取率亦基本保持不變。故從節(jié)約能源與縮短試驗(yàn)周期的角度考慮，未將浸泡時(shí)間與提取次數(shù)作為后續(xù)優(yōu)化因素。

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

2.4.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度（A）、液料比（B）、提取時(shí)間（C）為考察因素，采用3因素3水平的響應(yīng)面法進(jìn)行試驗(yàn)。因素與水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 2 Box-Behnken experiment design and results

2.4.2 模型建立與方差分析 通過(guò)Design-Expert 8.0.5軟件對(duì)上述試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元二次回歸擬合，得到回歸方程：毛蕊花糖苷提取率（Y）＝75.86+5.38A+1.38B－0.58C+0.18AB+0.57AC+0.57BC－9.00A2－5.26B2－2.50C2（r＝0.993 3）。r＞0.09提示該模型擬合度較好，預(yù)測(cè)性較好[15]。對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

根據(jù)表3中F的大小，推測(cè)影響本試驗(yàn)提取率大小的影響因素為乙醇濃度＞液料比＞提取次數(shù)，所建模型經(jīng)檢驗(yàn)具有顯著性（P＜0.000 1），說(shuō)明模型與實(shí)際情況吻合良好；模型失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不具有顯著性（P＝0.671 5＞0.05），說(shuō)明未知因素對(duì)模型擬合結(jié)果的干擾少，模型誤差較小；可用該模型較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。因此，可用該模型預(yù)測(cè)毛蕊花糖苷的提取工藝條件。

2.4.3 響應(yīng)面圖與等高線圖分析 分別以乙醇濃度（A）、液料比（B）、提取時(shí)間（C）為響應(yīng)因子，以毛蕊花糖苷提取率為響應(yīng)值，使用Design-Expert 8.0.5軟件繪制響應(yīng)面和等高線圖，詳見(jiàn)圖3。

表3 擬合回歸分析結(jié)果Tab 3 Fitting regression analysis results

圖3 各因素對(duì)毛蕊花糖苷提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig 3 Response surface plots and contour plots for the effect of each factor on the extraction rate of verbascoside

乙醇濃度和液料比的交互作用對(duì)毛蕊花糖苷提取率的影響如圖3A、3B所示，固定液料比，乙醇濃度在50%～62.96%范圍內(nèi)，毛蕊花糖苷的提取率逐漸增高，當(dāng)乙醇濃度超過(guò)62.96%時(shí)，毛蕊花糖苷的提取率降低，當(dāng)固定乙醇濃度時(shí)，毛蕊花糖苷的提取率隨著液料比的增加，先增大后減??；圖3B等高線圖表明，乙醇濃度和液料比之間的交互作用顯著。乙醇濃度和提取時(shí)間的交互作用對(duì)毛蕊花糖苷的提取率影響如圖3C、3D所示，固定乙醇濃度，提取時(shí)間在1～2 h的范圍內(nèi)毛蕊花糖苷的提取率先升高后下降，提取率最高點(diǎn)對(duì)應(yīng)的提取時(shí)間為1.47 h；圖3D等高線圖表明，乙醇濃度和提取時(shí)間交互作用顯著。提取時(shí)間和液料比的交互作用對(duì)毛蕊花糖苷的提取率影響如圖3E、3F所示，固定提取時(shí)間，液料比在6∶1～10∶1的范圍內(nèi)毛蕊花糖苷提取率先增高后下降，提取率最高點(diǎn)對(duì)應(yīng)的液料比為8.26∶1；圖3F等高線圖表明，液料比和提取時(shí)間之間的交互作用顯著。

根據(jù)以上結(jié)果，運(yùn)用Design-Expert 8.0.5軟件優(yōu)化所得的毛蕊花糖苷提取最佳工藝為乙醇濃度62.96%、液料比8.26∶1、浸泡時(shí)間2 h、提取時(shí)間1.47 h、提取2次。在此條件下毛蕊花糖苷提取率的預(yù)測(cè)值為76.76%?？紤]到試驗(yàn)的便捷性、可行性與可操作性，筆者對(duì)預(yù)測(cè)的工藝參數(shù)進(jìn)行微調(diào)，選擇工藝參數(shù)為乙醇濃度63%、液料比8∶1、浸泡時(shí)間2 h、提取時(shí)間1.5 h、提取2次。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

取管花肉蓯蓉粉末100 g，共3份，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果，3次驗(yàn)證試驗(yàn)毛蕊花糖苷提取率的RSD為1.20%（n＝3），實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差分別為1.89%、0.25%、3.36%，表明方程與真實(shí)試驗(yàn)情況擬合較好，優(yōu)化的工藝可靠、可行，詳見(jiàn)表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 Results of validation tests

3 討論

響應(yīng)面法是通過(guò)一系列確定性的試驗(yàn)，擬合一個(gè)響應(yīng)面來(lái)模擬真實(shí)極限狀態(tài)的曲面圖，其基本思想是假設(shè)一個(gè)包括一些未知參量的極限狀態(tài)函數(shù)與基本變量之間的解析表達(dá)式來(lái)代替實(shí)際不能明確表達(dá)的結(jié)構(gòu)極限狀態(tài)函數(shù)[16-20]。而傳統(tǒng)數(shù)理統(tǒng)計(jì)不能在已有“點(diǎn)”數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上對(duì)整體的“面”數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè)。因此，傳統(tǒng)數(shù)理統(tǒng)計(jì)具有一定的局限性[17]。利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理來(lái)尋求最優(yōu)的考察因素和響應(yīng)值來(lái)避免傳統(tǒng)數(shù)理統(tǒng)計(jì)存在的問(wèn)題，最終精確找到最佳點(diǎn)并靈敏地考察各因素間的交互作用[17-22]。

有關(guān)管花肉蓯蓉中總苯乙醇苷類化合物的提取工藝報(bào)道較多[23-24]，但對(duì)于因素的優(yōu)化均采用正交試驗(yàn)方法進(jìn)行，因此本文采用Box-Behnken響應(yīng)面分析法對(duì)管花肉蓯蓉中毛蕊花糖苷的提取工藝進(jìn)行研究。本研究選擇浸泡時(shí)間、乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)等進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并從中篩選對(duì)提取率影響較明顯的3個(gè)因素（即乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間）及相應(yīng)水平，運(yùn)用3因素3水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行最佳提取工藝篩選。該方法獲得擬合程度較高的數(shù)學(xué)模型，交互作用結(jié)果表明乙醇濃度、提取時(shí)間和液料比對(duì)毛蕊花糖苷提取率的影響并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

在乙醇濃度考察中，乙醇濃度至80%時(shí)毛蕊花糖苷的提取效率反而下降的原因，筆者認(rèn)為，一方面，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到50%～70%時(shí)，藥物在該溶劑中的溶解度最高；另一方面，可能是由于“相似相溶”原理，60%乙醇的極性與毛蕊花糖苷極性相近[25]。在提取時(shí)間考察中，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，毛蕊花糖苷提取率反而下降，可能與毛蕊花糖苷發(fā)生降解有關(guān)。在提取液料比考察中，毛蕊花糖苷提取率的變化與其向溶劑擴(kuò)散有關(guān)。當(dāng)液料比低于6∶1時(shí)，兩相界面間的濃度差較小，不利于成分?jǐn)U散；當(dāng)液料比大于8∶1時(shí)，受到已提成分對(duì)未提成分協(xié)同浸提作用的影響，提取率反而降低；當(dāng)液料比大于10∶1時(shí)，成分質(zhì)量濃度下降，不利于協(xié)同浸提，毛蕊花糖苷提取率反而降低[25-26]。最終獲得的最佳工藝參數(shù)為乙醇濃度63%、液料比8∶1、提取時(shí)間1.5 h，并通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)證明了工藝的可行性。本工藝所用乙醇濃度為63%，濃度較低，可節(jié)省生產(chǎn)成本；同時(shí)，與其他提取方法[27-28]相比，具有更好的可重復(fù)性；此外，回流提取法簡(jiǎn)便易行，可作為進(jìn)一步擴(kuò)大生產(chǎn)的依據(jù)。

綜上所述，本研究?jī)?yōu)化所得管花肉蓯蓉中毛蕊花糖苷的提取工藝穩(wěn)定、可行，適用于該化合物的提取。