劉貝，華敏，劉堯，孫媛媛，申文#（.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院疼痛科，江蘇徐州22004；2.徐州醫(yī)科大學(xué)江蘇省麻醉與疼痛應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 22002）

全球每年癌癥新發(fā)患者眾多，據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，預(yù)計(jì)到2020年，癌癥新發(fā)病例將超過1 500萬人[1]。疼痛是癌癥患者常見的臨床癥狀，晚期癌癥患者的疼痛發(fā)生率可高達(dá)70%～90%[2]。盡管臨床針對癌痛的治療方法很多，但大部分患者難以獲得滿意的鎮(zhèn)痛效果。有研究指出，不同個(gè)體的疼痛敏感性和藥物鎮(zhèn)痛效果有所差異，而上述差異可能與環(huán)境因素及患者的遺傳特征有關(guān)[3]。5-羥色胺（5-HT）是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，當(dāng)其被相應(yīng)受體介導(dǎo)后，便可參與痛覺等生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)[4]。5-羥色胺2A受體（5-HT2AR）編碼基因（5-HT2AR）定位于人染色體13q14～21，包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，長約 20 kb[5]。其中，rs6313（102C/T）位于第1外顯子，該位點(diǎn)突變雖不引起編碼氨基酸的改變，但可能與患者疼痛個(gè)體差異和阿片類藥物需求量有關(guān)[6-7]。Polesskaya OO等[8]研究發(fā)現(xiàn)，正常人顳葉皮質(zhì)5-HT2AR基因rs6313位點(diǎn)C等位基因mRNA及編碼蛋白的表達(dá)量均低于T等位基因，這可能是導(dǎo)致患者個(gè)體疼痛敏感性及阿片類藥物需求量差異的主要原因。為此，本研究擬分析5-HT2AR基因rs6313位點(diǎn)多態(tài)性與肺癌患者疼痛發(fā)生的相關(guān)性，并進(jìn)一步探討其對患者阿片類藥物需求量的影響，以期為實(shí)現(xiàn)肺癌患者個(gè)體化基因靶向鎮(zhèn)痛治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 納入與排除患者

1.1.1 肺癌患者 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理學(xué)和/或細(xì)胞學(xué)診斷為肺惡性腫瘤（不限定腫瘤分期及分型）；（2）年齡為18～80歲，性別不限；（3）神志清楚，不存在交流障礙；（4）漢族（不限定區(qū)域）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）曾患有或現(xiàn)患有嚴(yán)重精神疾病或神志不清者；（2）患有嚴(yán)重心、腦血管等中樞系統(tǒng)疾病者；（3）伴有中、重度肝腎功能損傷者；（4）不能進(jìn)行自我評估者；（5）合并其他慢性疼痛者；（6）研究過程中自行退出和病情突然惡化者。

1.1.2 健康者 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）在徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院體檢中心進(jìn)行體檢的健康者；（2）簽署知情同意書；（3）年齡為18～80歲，性別不限；（4）漢族（不限定區(qū)域）。排除研究過程中自行退出或拒絕配合者。

1.2 研究對象

本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（倫理批件號：XYFY2015-KL002-01），所有受試者或其家屬均已知情并簽署了知情同意書。選取2017年12月－2018年6月在徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院就診的經(jīng)病理學(xué)和/或細(xì)胞學(xué)診斷為肺惡性腫瘤的患者，作為肺癌組（332例，非連續(xù)入組）；據(jù)其是否伴有疼痛分為疼痛組（177例，男性120例、女性57例）和無痛組（155例，男性102例、女性53例）。另選取同一時(shí)期于該院進(jìn)行體檢的健康者，作為對照組（116例，男性72例、女性44例）。各組受試者均無血緣關(guān)系。

1.3 樣本采集與疼痛評估

于入院當(dāng)日記錄所有受試者的一般資料，包括性別、年齡、身高、體質(zhì)量、病理類型、TNM分期等。采用視覺模擬評分法（VAS）評估肺癌疼痛組患者的疼痛程度，首次評分記為其用藥前VAS評分。VAS評分標(biāo)準(zhǔn)：0分為無痛，1～3分為輕度疼痛，4～6分為中度疼痛，7～10分為重度疼痛[9]。

1.4 疼痛治療

肺癌疼痛組患者的藥物治療及方案調(diào)整均嚴(yán)格遵循《歐洲癌痛阿片類藥物鎮(zhèn)痛指南》[10]，并以治療后VAS評分≤3分為“鎮(zhèn)痛效果滿意”[11]。記錄患者鎮(zhèn)痛效果滿意時(shí)的阿片類藥物日均需求量，按“曲馬多（口服制劑）200 mg/d＝羥考酮（口服制劑）30 mg/d＝芬太尼（透皮貼劑）25 μg/d＝嗎啡（靜脈注射/皮下注射制劑）20mg/d＝嗎啡（口服制劑）60 mg/d”的標(biāo)準(zhǔn)[10]換算為每日等效嗎啡口服劑量（MEDD）。

1.5 基因型檢測

采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性方法（PCR-RFLP）對所有受試者的基因型進(jìn)行檢測。

1.5.1 DNA提取 抽取所有受試者外周靜脈血2 mL，于－80℃冰箱保存，備用。取上述血樣500 μL，采用樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒（上海賽百盛基因技術(shù)有限公司）提取患者DNA，使用NanoDrop 2000型紫外分光光度計(jì)[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]檢測其DNA濃度和純度。

1.5.2 引物設(shè)計(jì)與合成 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。上游引物：5′-TCTGCTACAAGTTCTGGCTT-3′，下 游 引 物 ：5′-CTGCAGCTTTTTCTCTAGGG-3′。

1.5.3 PCR擴(kuò)增 采用TProfessional Standard型高性能梯度PCR儀（德國Whatman Biometra公司）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（共25 μL）：DNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，無核酶水8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。

1.5.4 酶切 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用限制性核酸內(nèi)切酶MspⅠ[12]進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系（共31 μL）：PCR產(chǎn)物10 μL、10×Buffer Tango 2 μL、MspⅠ酶1 μL、焦碳酸二乙酯（DEPC）水18 μL，于37 ℃的SHP-080型高階恒溫箱[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]中酶切3～6 h。其中，T等位基因不能被限制性核酸內(nèi)切酶切斷，片段大小為342 bp；C等位基因可被限制性核酸內(nèi)切酶切斷，片段大小為126、216 bp；各基因型酶切產(chǎn)物片段大小——野生型純合子（CC）：126、216 bp，突變型雜合子（CT）：126、216、342 bp，突變型純合子（TT）：342 bp[13]。酶切完成后，將各酶切產(chǎn)物置于2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳（電壓：120 V，時(shí)間：45 min），使用ChemiDoc XRS+型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）拍照。

1.5.5 驗(yàn)證 隨機(jī)抽取不同基因型的PCR產(chǎn)物采用Sanger測序法進(jìn)行驗(yàn)證，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0和Graphpad Prism 5.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Kolmogorov-Smirnov法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用χ2檢驗(yàn)分析受試者基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡；采用Hosmer-Lemeshaw檢驗(yàn)評價(jià)模型擬合度，采用二元Logistic回歸分析對肺癌疼痛發(fā)生的影響因素進(jìn)行評價(jià)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

3組受試者的性別、年齡、身高、體質(zhì)量等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，詳見表1。

表1 3組受試者一般資料比較Tab 1 Comparison of general data of subjects among 3 groups

2.2 基因型與等位基因頻率分布

本研究共檢出5-HT2AR基因rs6313位點(diǎn)CC、CT、TT等3種基因型，各基因型酶切產(chǎn)物片段大小分別為126、216 bp（CC型），126、216、342 bp（CT型），342 bp（TT型），詳見圖1。經(jīng)驗(yàn)證，Sanger測序結(jié)果與PCR-RFLP方法基因型鑒定結(jié)果一致，詳見圖2。

圖1 rs6313位點(diǎn)酶切產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig 1 Gel electrophoresis of rs6313 locus enzyme products

各組受試者5-HT2AR基因rs6313位點(diǎn)CC、CT、TT型和T、C等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），表明本研究納入的對象可代表整個(gè)群體的分布情況。同時(shí)，肺癌組患者5-HT2AR基因rs6313位點(diǎn)CC、CT、TT型和T、C等位基因頻率與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表2。

2.3 肺癌患者疼痛發(fā)生相關(guān)因素分析

以肺癌患者是否疼痛為應(yīng)變量，患者性別、年齡、身高、體質(zhì)量、病理類型、TNM分期、rs6313基因型等因素為自變量進(jìn)行二元Logistic回歸分析，各自變量賦值——性別：男＝0，女＝1；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ＝0，Ⅲ～Ⅳ＝1；基因型：CC＝1，CT＝2，TT＝3；病理類型：鱗癌＝1，腺癌＝2，小細(xì)胞癌＝3，其他＝4。分析結(jié)果顯示，模型擬合度良好（Hosmer-Lemeshaw 檢驗(yàn)：χ2＝13.811，P＝0.087＞0.05）。其中，TNM分期（Ⅲ～Ⅳ期）對肺癌患者疼痛發(fā)生有影響[比值比（OR）＝3.661，95%置信區(qū)間（CI）（1.972，6.797），P＜0.001]，是肺癌疼痛發(fā)生的危險(xiǎn)因素，而rs6313位點(diǎn)基因型及性別、年齡等其他因素與肺癌患者疼痛的發(fā)生無關(guān)（P＞0.05），詳見表3[表中，（1）、（2）、（3）等表示啞變量，啞變量個(gè)數(shù)＝自變量水平數(shù)減1]。

圖2 rs6313位點(diǎn)基因型測序圖（Sanger測序法）Fig 2 Genotype sequencing diagram of rs6313 locus（Sanger sequencing）

表2 各組受試者rs6313位點(diǎn)基因型及等位基因分布[例（%%）]Tab 2 Distributions of genotype and allele of rs6313locus in subjects of each group[cases（%%）]

表3 肺癌患者疼痛發(fā)生相關(guān)因素的二元Logistic回歸分析Tab 3 Binary Logistic regression analysis of pain-related factors in patients with lung cancer

2.4 基因型與肺癌疼痛組患者疼痛程度的相關(guān)性

根據(jù)用藥前VAS評分將肺癌疼痛組患者分為輕度疼痛、中度疼痛和重度疼痛組等3個(gè)亞組，對其臨床特征和基因型與疼痛程度的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果，3個(gè)亞組患者的性別、年齡、身高、體質(zhì)量、病理類型、TNM分期等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。3個(gè)亞組患者各基因型頻率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表4。

表4 不同疼痛程度患者rs6313位點(diǎn)基因型分布比較[例（%%）]Tab 4 Comparison of rs6313 locus genotype in patients with different pain levels[cases（%%）]

2.5 基因型與肺癌疼痛組患者阿片類藥物需求量的相關(guān)性

Kruskal-Wallis檢驗(yàn)結(jié)果顯示，3個(gè)亞組不同基因型患者M(jìn)EDD比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表5。

表5 不同基因型肺癌疼痛患者M(jìn)EDD比較[M（P25，P75）]Tab 5 Comparison of MEDD among lung cancer pain patients with different genotypes[M（P25，P75）]

3 討論

疼痛嚴(yán)重影響惡性腫瘤患者的生存質(zhì)量[14]。基因組學(xué)的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，基因的遺傳學(xué)變異可以有助于預(yù)測和指導(dǎo)癌癥患者的疼痛反應(yīng)及個(gè)體化鎮(zhèn)痛治療[15]。隨著對疼痛遺傳學(xué)研究的不斷深入，學(xué)者發(fā)現(xiàn)與疼痛有關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)主要是通過造成神經(jīng)系統(tǒng)電活動(dòng)異常、神經(jīng)肽及神經(jīng)遞質(zhì)釋放的改變以及藥物代謝酶與藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體功能異常等途徑來參與疼痛調(diào)節(jié)[16]。研究表明，基因編碼區(qū)多態(tài)性雖不導(dǎo)致氨基酸的改變，但仍可通過改變mRNA的穩(wěn)定性、剪接或定位來影響基因的整體功能[17]。因此，如何解釋這些靜息型多態(tài)性對個(gè)體疼痛差異的影響也是未來疼痛遺傳學(xué)研究關(guān)注的熱點(diǎn)之一。

5-HT2AR是與磷脂酶相關(guān)的G蛋白偶聯(lián)受體，是由1 413個(gè)核苷酸開放閱讀框架編碼的471個(gè)氨基酸組成，其本質(zhì)是糖蛋白。目前發(fā)現(xiàn)的5-HT2AR基因有6種多態(tài)性，其中rs6313為靜息型，突變率為60%，是該基因多態(tài)性位點(diǎn)中突變率最高的一種[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，與其他基因型患者比較，TT型患者對疼痛的敏感性更高；其機(jī)制可能是TT型可表達(dá)更高水平的mRNA及編碼蛋白，可激活更多的5-HT2AR，而活化后的5-HT2AR可進(jìn)一步激活磷脂酶C，并將其降解為三磷酸肌醇（IP3）和二?；视停―AG），以促進(jìn)更多的鈣離子（Ca2+）流入細(xì)胞內(nèi)，提高細(xì)胞的興奮性，加快疼痛信號的傳遞[6，19]。此外Ozdemir E等[20]研究發(fā)現(xiàn)，5-HT2AR拮抗劑可抑制嗎啡耐受現(xiàn)象的發(fā)生，并可提高嗎啡等阿片類藥物的鎮(zhèn)痛效果，但這種作用的確切生理機(jī)制尚未完全闡明。為此，本研究初步探討5-HT2AR基因rs6313位點(diǎn)多態(tài)性與疼痛發(fā)生及阿片類藥物需求量的相關(guān)性。

本研究選取了發(fā)病率和病死率均較高的肺癌，以減少腫瘤類型對個(gè)體疼痛差異的影響；以MEDD作為考察指標(biāo)，以保證使用不同鎮(zhèn)痛方案患者間的可比性[21]；同時(shí)，本研究采用經(jīng)典的PCR-RFLP技術(shù)，并借助Sanger測序法予以驗(yàn)證，以確保分型檢測結(jié)果更為可靠。本研究結(jié)果顯示，各組受試者5-HT2AR基因rs6313位點(diǎn)CC、CT、TT型頻率分別為20.7%、47.4%、31.9%（對照組），20.6%、50.3%、29.0%（無痛組），16.4%、50.8%、32.8%（疼痛組），C、T等位基因頻率分別為44.4%、55.6%（對照組），45.8%、54.2%（無痛組），41.8%、58.2%（疼痛組），與Aoki J等[6]的研究結(jié)果基本一致。肺癌組與對照組受試者基因型頻率和等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示該基因位點(diǎn)多態(tài)性在肺癌患者及健康人群中的分布并無明顯差異。

一項(xiàng)多中心觀察性研究發(fā)現(xiàn)，患者肺癌疼痛的發(fā)生可能與其疾病發(fā)展程度等臨床特征相關(guān)[22]，故本研究對與之可能相關(guān)的因素（如性別、年齡、病理類型、TNM分期及基因型等）進(jìn)行了二元Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，患者的性別、年齡、身高、體質(zhì)量、病理類型、rs6313位點(diǎn)基因型等因素均與肺癌患者疼痛的發(fā)生無關(guān)；而TNM分期是肺癌患者疼痛發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與上述研究[22]結(jié)果基本一致。本研究并未發(fā)現(xiàn)5-HT2AR基因rs6313位點(diǎn)多態(tài)性與肺癌患者疼痛發(fā)生的相關(guān)性，筆者認(rèn)為這可能與該位點(diǎn)多態(tài)性增加了外周5-HT2AR的含量、降低了中樞5-HT2AR的含量以及下調(diào)受體敏感性有關(guān)，但其分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步確證。此外，本研究考察了患者基因型與其疼痛程度的相關(guān)性，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)5-HT2AR基因rs6313位點(diǎn)多態(tài)性與患者癌痛程度相關(guān)。Aoki J等[6]發(fā)現(xiàn)，5-HT2AR基因rs6313位點(diǎn)多態(tài)性與個(gè)體疼痛差異顯著相關(guān)；Pata C等[23]比較不同rs6313基因型腸易激綜合征（IBS）患者的臨床資料發(fā)現(xiàn)，TT型患者疼痛閾值較其他基因型患者更低；Gürsoy S等[7]比較發(fā)現(xiàn)，TT型纖維肌痛患者的VAS評分較其他基因型患者更高，TT型患者的個(gè)體疼痛閾值低于CT和CC基因型；然而，Tander B等[24]發(fā)現(xiàn)，5-HT2AR基因rs6313位點(diǎn)多態(tài)性與纖維肌痛無關(guān)，并不會(huì)影響患者疼痛感知。由此可見，該位點(diǎn)多態(tài)性與疼痛程度的相關(guān)性研究結(jié)論尚不一致，這可能與受試人群種族及疾病類型差異有關(guān)。Aoki J等[6]指出，與5-HT2AR基因rs6313位點(diǎn)CT、CC型攜帶者比較，TT型攜帶者對芬太尼、嗎啡等阿片類藥物的需求量更大。但本研究并未發(fā)現(xiàn)該多態(tài)性與肺癌疼痛患者阿片類藥物MEDD的相關(guān)性，這可能與本研究納入的樣本量有限有關(guān)；此外，由于疼痛基因遺傳學(xué)作用機(jī)制復(fù)雜，不排除多種因素（如不同地域、基因相互作用等）的共同作用[25]，故本研究結(jié)果尚有待進(jìn)一步確證。

綜上所述，5-HT2AR基因rs6313位點(diǎn)多態(tài)性與肺癌患者疼痛的發(fā)生及阿片類藥物的需求量無關(guān)，其多態(tài)性可能不是導(dǎo)致肺癌患者疼痛個(gè)體差異的主要原因。但本研究為單中心研究，僅初步探討了對5-HT2AR功能有影響的單個(gè)基因多態(tài)性，且樣本量不大，同時(shí)并未考慮該基因的其他位點(diǎn)或其他疼痛相關(guān)基因遺傳變異的影響，故本課題組下一步將研究基因之間的交互作用，聯(lián)合多個(gè)基因進(jìn)行篩選，并結(jié)合疾病狀態(tài)從相關(guān)基因mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)一步深入探討。