梁鵬志 吳佳遙 李留安 焦小麗

天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院/天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300384

黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT）是一類主要由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的真菌次級代謝產(chǎn)物，是二氫呋喃香豆素的衍生物。具有極強(qiáng)致畸、致癌性，其中玉米黃曲霉毒素B1（AFB1）是最廣泛也是毒性最強(qiáng)的一種[1]。當(dāng)動(dòng)物食用被黃曲霉毒素污染的飼料后，會(huì)引起消化系統(tǒng)紊亂、全身出血、腹腔積液等癥狀，并導(dǎo)致肝臟變性壞死以及肝細(xì)胞增生等[2]，亦可引起懷孕動(dòng)物流產(chǎn)[3]。玉米黃曲霉毒素B1 對人或動(dòng)物均具有肝毒性及生長抑制作用，且在24～35 ℃、相對濕度高出7%時(shí)最容易產(chǎn)生[4]。

酵母是一類單細(xì)胞真菌的總稱，隸屬于真菌界的子囊菌門。在無氧環(huán)境下則將葡萄糖分解為二氧化碳和乙醇。利用該特性，酵母菌被廣泛用于食品工業(yè)和釀造產(chǎn)業(yè)。此外已有利用酵母細(xì)胞壁加水合硅酸鈉鹽制成的AFB1 吸附劑的研究[5]。亦有研究使用產(chǎn)朊假絲酵母進(jìn)行AFB1 發(fā)酵脫毒[6]，都取得了良好的效果，但釀酒酵母對AFB1 的脫毒作用目前鮮見研究。本研究采用3 種不同來源的釀酒酵母，對霉變玉米進(jìn)行發(fā)酵處理，研究3 種不同釀酒酵母不同濃度對玉米AFB1 的脫毒效果，以期為AFB1 脫毒提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1）霉變玉米。由天津郊區(qū)某農(nóng)戶提供，粉碎霉變玉米并混合均勻，使95%以上的玉米粉過孔徑830 μm 篩，ELISA 試劑盒測定其AFB1 含量為(40.65±2.89) μg/kg。

2）主要試劑。面包酵母為圣家食品產(chǎn)品；果酒酵母為安琪酵母股份有限公司產(chǎn)品；啤酒酵母為SAFALE（法國）公司產(chǎn)品；AgraQuant R AFB1 檢測試劑盒為Romer Labs 產(chǎn)品；分析純級甲醇購自天津永大有限公司。

3）儀器和設(shè)備。CMax Plus 酶標(biāo)儀, 型號為SpectraMax R Absorbance Reader，Molecular Devices 公司；Eppendorf 移液槍, 型號為20～200 μL，電磁攪拌器，EMS-18C；生化培養(yǎng)箱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Whatman#1 濾紙、紗布、封口膜等購自天津晟佰昊生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素設(shè)計(jì)，設(shè)3 個(gè)試驗(yàn)組、1 個(gè)空白組，3個(gè)試驗(yàn)組分別為面包酵母、啤酒酵母、葡萄酵母組，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)3 個(gè)用量處理組，分別為每10.0 g 玉米中添加0.5、1.5、2.5 g，共計(jì)9 個(gè)處理組，每個(gè)處理4 個(gè)重復(fù)。所有處理組均放置于33 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱，發(fā)酵14 d。

1.3 試驗(yàn)方法

采用GB/T 17480—2008《飼料中黃曲霉毒素B1 的測定酶聯(lián)免疫法》測定玉米中AFB1 的含量，參照AgraQuant R AFB1 試劑盒說明書進(jìn)行樣品前處理及AFB1 檢測，最低檢出含量為2 μg/kg。精確稱取10.000 0 g 玉米粉樣品于250 mL 錐形瓶中，做好記號。分別準(zhǔn)確稱量0.5、1.5、2.5 g 酵母于燒杯中，加水配置10∶1 的酵母菌液，按處理分別加入菌液于對應(yīng)樣品中，加水至75 mL，放置于33 ℃恒溫箱中，試驗(yàn)期間每天定時(shí)混合玉米粉，以使玉米粉和酵母充分接觸，確保玉米粉發(fā)酵良好。試驗(yàn)處理結(jié)束后移除上層液體并烘干，再加入50 mL 70%甲醇，振蕩或均質(zhì)3 min 后靜置，用Whatman#1 濾紙過濾獲得上清液，收集濾液待檢。

1.4 脫毒率

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)，試驗(yàn)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用單因素ANOVA 方差分析和Duncan's 檢驗(yàn)各組間差異顯著性，＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種酵母不同添加量對AFB1 的脫毒率

分別使用3 種酵母（葡萄酵母、面包酵母、啤酒酵母）不同處理（0.5、1.5、2.5 g/10.0 g）對發(fā)霉玉米樣品進(jìn)行發(fā)酵處理14 d，其對AFB1的脫毒率如表1所示。由表1可以看出，不同含量的葡萄酵母均對AFB1 有一定的脫毒作用，1.5 g 組脫毒率最高，但組間差異不顯著（P＞0.05）。面包酵母對AFB1 有一定的脫毒作用，并可見隨著濃度遞增脫毒率有上升趨勢，2.5 g 組脫毒率最高，但組間差異不顯著（P＞0. 05）。啤酒酵母均對AFB1 有一定的脫毒作用，但脫毒率均較低，各組間差異不顯著（P＞0.05）。添加1.5 g 葡萄酵母時(shí)脫毒率最高，顯著高于添加0.5 g 面包酵母組（P＜0.05），其余各組間差異不顯著（P＞0.05）。綜合分析3 種不同來源釀酒酵母對AFB1 的脫毒率均較低，啤酒酵母的脫毒率效果較差。

表1 3 種酵母不同添加量對AFB1 的脫毒率 %

3 討 論

本研究主要考察3 種不同來源的釀酒酵母對玉米AFB1 的脫毒效果，結(jié)果顯示，3 種釀酒酵母均對玉米粉AFB1 有一定的脫毒作用，且添加葡萄酵母1.5 g/10 g 時(shí)效果較好，脫毒率為22.25%，啤酒酵母脫毒效果較差。同種酵母不同添加量組間差異不顯著（P＞0.05），這可能是由于發(fā)酵早期由于酵母菌的繁殖，從而使?jié)舛忍荻乳g差異降低。李素琴等[7]對汾酒釀造過程中AFT 的測定得知，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2 均可隨著酵母發(fā)酵而降解，少量殘留于酒糟中，推測其脫毒機(jī)制在于酵母菌自身新陳代謝的酶解反應(yīng)。在酵母菌內(nèi)含有葡萄糖氧化酶，AFT的分子結(jié)構(gòu)中含有能被其破壞的二呋喃環(huán)和香豆素基團(tuán)，該基團(tuán)決定了AFT 的毒性[8]。酵母菌完成發(fā)酵過程氧化葡萄糖時(shí)，可將AFB1 氧化，破壞其二呋喃環(huán)和香豆素基團(tuán)，從而起到脫毒作用[8]。目前已發(fā)現(xiàn)很多可通過類似機(jī)制脫毒的微生物[1]。研究發(fā)現(xiàn)，脫毒物質(zhì)及方法在低水平毒素下能發(fā)揮更好的脫毒效果[9]，本試驗(yàn)酵母發(fā)酵脫毒率為22%左右，本研究中玉米樣品AFB1 質(zhì)量濃度為40.65 μg/L，超過國家標(biāo)準(zhǔn)20 μg/L[10]。因此,釀酒酵母脫毒作用可能僅適合于輕微AFT 污染的飼料原料，從而降低由于AFT 輕微污染造成的浪費(fèi)。