陳 靜，嚴(yán) 佳，鐘桂香，宋洪濤

(中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院，福建 福州 350025)

復(fù)方特比萘芬軟膏是福州總醫(yī)院自主研發(fā)制劑，適用于真菌性皮膚病。復(fù)方特比萘芬軟膏的主藥為特比萘芬和莫匹羅星。特比萘芬是一種廣譜的烯丙胺類(lèi)抗真菌藥，對(duì)一些常見(jiàn)球形孢子絲菌、皮膚癬菌、裴氏著色真菌及某些酵母菌有抑制作用[1]。莫匹羅星是廣譜類(lèi)的抗菌藥物，對(duì)各種革蘭陽(yáng)性球菌和某些革蘭陰性菌有良好的抗菌作用[2]。特比萘芬和莫匹羅星聯(lián)用有助于治療合并細(xì)菌感染的淺部真菌感染。本文根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版四部規(guī)定，參照菌數(shù)報(bào)告規(guī)則和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)摸索中和劑含量、薄膜過(guò)濾沖洗液體積、供試液稀釋級(jí)及培養(yǎng)基稀釋體積等方法對(duì)復(fù)方特比萘芬軟膏進(jìn)行處理以消除其抗菌性[4],建立復(fù)方特比萘芬軟膏的微生物限度檢查方法。結(jié)果表明，該方法科學(xué)、有效、可行。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

AE240精密電子天平(瑞士METTLER公司)；HWS24型電熱恒溫水浴鍋、DHG-9145A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)；YP3001ND電子天平(上海精科有限公司)；MJPS-150型霉菌培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)； WJ-6無(wú)菌檢查儀(天津市羅根科技有限公司)；SW-CJ-1B凈化工作臺(tái)(蘇州太倉(cāng)凈化設(shè)備廠(chǎng))；LDZX-40KBS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng))。

1.2 試藥

復(fù)方特比萘芬軟膏(批號(hào)：170913、171012、171114，規(guī)格：20g，聯(lián)勤保障部隊(duì)第900醫(yī)院自制)。

1.3 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(批號(hào)：1612071)、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：1610252)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：1609214)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(批號(hào)：1511162)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：1703202)、溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：160309)均購(gòu)自北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司。

1.4 稀釋液及沖洗液

pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號(hào)：1709062，北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司)；0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液(批號(hào)：170331，西隴科學(xué)股份有限公司)。均依照中國(guó)藥典非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查1106項(xiàng)下稀釋液配制方法配制。

1.5 試劑

聚山梨酯80(批號(hào)：20170925，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.6 菌株

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]、白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillusniger[CMCC(F)98003]，以上菌株均為第3代，均購(gòu)自福建省藥檢所。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液制備

取經(jīng)(30～35)℃培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物各1ml和經(jīng)(20～25)℃培養(yǎng)24～48 h的白色念珠菌的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)物1ml，加9ml 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，10倍遞增稀釋?zhuān)瞥蛇m宜濃度的菌懸液[3]。

取經(jīng)(20～25)℃培養(yǎng)7 d的黑曲霉沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)物，加5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，將孢子洗脫，并將孢子過(guò)濾至無(wú)菌試管內(nèi)，取孢子液 1ml，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋?zhuān)瞥蛇m宜濃度的菌懸液[3]。

2.2 供試液制備

從2兩支供試品中各取5 g，共10 g，置于含熔化的8 g聚山梨酯80和玻璃珠的無(wú)菌錐形瓶中(溫度≤45℃)，用無(wú)菌玻璃棒攪拌，加預(yù)先在40℃水浴保溫的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，攪拌混勻，作為1∶10供試液。從1∶10供試液中取50 ml、20 ml、10 ml，分別加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，充分混勻，作為1∶20，1∶50，1∶100供試液。

2.3 回收比值的計(jì)算

試驗(yàn)組的回收比值=(試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)[4]

稀釋劑對(duì)照組的回收比值=稀釋劑對(duì)照組平均菌落數(shù)/菌液組平均菌落數(shù)

2.4 微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.4.1試驗(yàn)組

需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)：取供試液10ml(每膜)，經(jīng)薄膜過(guò)濾后，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次沖洗100 ml，沖洗次數(shù)不大于10次，在最后一次沖洗液中分別加入銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌懸液1 ml，每1ml的菌懸液含菌數(shù)不大于100cfu(菌落形成單位)，混勻，過(guò)濾。將濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，35℃倒置培養(yǎng)3 d，計(jì)數(shù)。每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基平行制備兩張濾膜。

霉菌、酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)：取供試液10 ml(每膜)，經(jīng)薄膜過(guò)濾后，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次沖洗100 ml，沖洗次數(shù)不大于10次，在最后一次沖洗液中分別加入白色念珠菌、黑曲霉的菌懸液1 ml(含菌不大于100 cfu/ml)，混勻，過(guò)濾。將濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，25℃倒置培養(yǎng)5 d，計(jì)數(shù)。每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基平行制備兩張濾膜。

2.4.2菌液組

取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液，按“2.4.1”項(xiàng)試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。

2.4.3供試品對(duì)照組

取制備好的供試液，用pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液，其他操作同“2.4.1”項(xiàng)試驗(yàn)組。所用培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件與試驗(yàn)組一致。

2.4.4稀釋劑對(duì)照組

取含8%聚山梨酯80的pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液，按“2.4.1”項(xiàng)試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。所用培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件與試驗(yàn)組一致。

2.4.5驗(yàn)證結(jié)果

首先選擇1:10供試液采用薄膜過(guò)濾法(沖洗量1 000 ml)對(duì)需氧菌進(jìn)行回收比值的測(cè)定，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉的回收比值低于0.5。接著，選擇1∶50供試液對(duì)需氧菌檢查計(jì)數(shù)方法重新驗(yàn)證。1∶50供試液采用薄膜過(guò)濾法(沖洗量1 000 ml)對(duì)需氧菌進(jìn)行回收比值的測(cè)定，金黃色葡萄球菌的回收比值低于0.5，仍不符合要求。再后，進(jìn)一步選擇1∶100供試液，采用薄膜過(guò)濾法(沖洗量300 ml)對(duì)需氧菌進(jìn)行回收比值的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1，5種試驗(yàn)菌種的回收比值均在0.5～2范圍內(nèi)，符合中國(guó)藥典2015版四部通則1105微生物計(jì)數(shù)法的要求。取1∶100供試液10 ml，采用薄膜過(guò)濾法(沖洗量300 ml)可作為復(fù)方特比萘芬軟膏需氧菌的計(jì)數(shù)方法。

霉菌、酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表2。1∶20供試液采用薄膜過(guò)濾法(沖洗量500 ml)對(duì)霉菌、酵母菌進(jìn)行回收比值的測(cè)定，黑曲霉的回收比值低于0.5。因此，我們?cè)龃鬀_洗量，分別采用800 ml和1 000 ml進(jìn)行沖洗，由表2可見(jiàn)，白色念珠菌和黑曲霉的回收比值均在0.5～2范圍內(nèi)，符合中國(guó)藥典2015版四部通則1105微生物計(jì)數(shù)法的要求。從時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本考慮，取1∶20供試液10 ml，采用薄膜過(guò)濾法(沖洗量800 ml)作為復(fù)方特比萘芬軟膏霉菌、酵母菌的計(jì)數(shù)方法。

表1 需氧菌總數(shù)驗(yàn)證結(jié)果與回收比值(1∶100供試液，300 ml沖洗，n=3)

表2 霉菌、酵母菌總數(shù)驗(yàn)證結(jié)果與回收比值(1∶20供試液，n=3)

2.4.6聚山梨酯80的含量考察

在微生物計(jì)數(shù)適用性試驗(yàn)中，以敏感菌金黃色葡萄球菌和黑曲霉作為試驗(yàn)菌考察不同濃度聚山梨酯80對(duì)抗菌活性的影響。按“2.2”項(xiàng)下要求制備供試液，分別加入4%、6%、8%和10%聚山梨酯80作為中和劑，需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)采用薄膜過(guò)濾法，取1∶100稀釋級(jí)供試液10 ml進(jìn)行沖洗，沖洗量為300 ml；霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)采用薄膜過(guò)濾法，取1∶20稀釋級(jí)供試液10 ml進(jìn)行沖洗，沖洗量為800 ml。結(jié)果見(jiàn)表3，4%和6%聚山梨酯80未能達(dá)到藥典規(guī)定(回收比值0.5～2)，而8%和10%聚山梨酯80均能達(dá)到藥典規(guī)定，因此選擇8%聚山梨酯80作為中和劑。

表3 聚山梨酯80的含量對(duì)金黃色葡萄球菌和黑曲霉回收比值的影響(n=3)

2.5 控制菌檢查方法的驗(yàn)證

2.5.1銅綠假單胞菌檢查方法的驗(yàn)證

試驗(yàn)組：取1∶10供試液10 ml，經(jīng)薄膜過(guò)濾后，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次100 ml，沖洗3次，在最后一次沖洗液中加入銅綠假單胞菌的菌懸液1 ml(含菌≤100 cfu/ml)，混勻，過(guò)濾。取出濾膜，加至100 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，(30～35)℃培養(yǎng)24 h；取上述培養(yǎng)物劃線(xiàn)接種于溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基中，(30～35)℃培養(yǎng)72 h。

陰性對(duì)照組：用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 ml代替供試液，不加菌液，其他操作同試驗(yàn)組，按規(guī)定的培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

菌液組：用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 ml代替供試液，其他操作同試驗(yàn)組，按規(guī)定的培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

供試品組：取pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液1 ml代替菌液，其他操作同試驗(yàn)組，按規(guī)定的培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

2.5.2驗(yàn)證結(jié)果

由表4可知，試驗(yàn)組和菌液組正常檢出，陰性對(duì)照組和供試品組未檢出，符合中國(guó)藥典2015版四部通則1106控制菌檢查的要求。取1∶10供試液10 ml，采用薄膜過(guò)濾法(沖洗量300 ml)，100 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基進(jìn)行增菌培養(yǎng)，可作為復(fù)方特比萘芬軟膏銅綠假單胞菌的控制菌檢查。

表4 控制菌銅綠假單胞菌檢查適用方法驗(yàn)證結(jié)果

注：“—”代表無(wú)菌落生長(zhǎng)；“+”表示有典型菌落生長(zhǎng)

2.5.3金黃色葡萄球菌檢查方法的驗(yàn)證

試驗(yàn)組：取1:10供試液10ml，經(jīng)薄膜過(guò)濾后，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，每次100 ml，沖洗10次，在最后一次沖洗液中加入金黃色葡萄球菌的菌懸液1 ml(含菌≤100 cfu/ml)，混勻，過(guò)濾。取出濾膜，加至不同體積的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，(30～35)℃培養(yǎng)24 h；取上述培養(yǎng)物劃線(xiàn)接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基中，(30～35)℃培養(yǎng)72 h。

陰性對(duì)照組：取pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 ml代替供試液，不加菌液，其他操作同試驗(yàn)組，按規(guī)定的培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

菌液組：取pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 ml代替供試液，其他操作同試驗(yàn)組，按規(guī)定的培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

供試品組：取pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液1 ml代替菌液，其他操作同試驗(yàn)組，按規(guī)定的培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

2.5.4驗(yàn)證結(jié)果

由表5可知，培養(yǎng)基稀釋體積為600 ml或以上時(shí)，試驗(yàn)組和菌液組正常檢出，陰性對(duì)照和供試品組未檢出，符合中國(guó)藥典2015版四部通則1106控制菌檢查的要求。取1∶10供試液10 ml，采用薄膜過(guò)濾法(沖洗1 000 ml)，600 ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基進(jìn)行增菌培養(yǎng)，可作為復(fù)方特比萘芬軟膏金黃色葡萄球菌的控制菌檢查。

表5 控制菌金黃色葡萄球菌檢查適用方法驗(yàn)證結(jié)果(n=3)

注：“—”代表無(wú)菌落生長(zhǎng)；“+”表示典型菌落生長(zhǎng)

3 討論

復(fù)方特比萘芬軟膏為半固體外用制劑，在緩沖液中的分散性較差，呈乳白色渾濁狀，若直接進(jìn)行薄膜過(guò)濾，易堵塞濾膜。適量濃度的聚山梨酯80具有中和、乳化、增溶的作用[5]。但濃度過(guò)高時(shí)，易堵塞濾膜，因此在稀釋供試液時(shí)可將稀釋液的溫度升高至40 ℃，分次加入稀釋液攪拌，可提高其溶解性，增加供試液的濾過(guò)性。通過(guò)本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)8%的聚山梨酯80不影響微生物生長(zhǎng)繁殖，有助于提高供試液分散性，利于供試液的濾過(guò)。

復(fù)方特比萘芬軟膏處方中含有特比萘芬、莫匹羅星等抑菌成分，因此該藥抗菌譜廣，對(duì)真菌和細(xì)菌都有很強(qiáng)的抑制作用[6-7]。通過(guò)試驗(yàn)可知，該藥對(duì)5種試驗(yàn)菌株均有不同程度的抑制作用，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，對(duì)枯草芽孢桿菌和黑曲霉的抑制作用較強(qiáng)，對(duì)白色念珠菌和銅綠假單胞菌的抑制作用較弱。經(jīng)過(guò)前期方法驗(yàn)證，單獨(dú)使用平皿傾注法和薄膜過(guò)濾法均不能達(dá)到要求。通過(guò)試驗(yàn)證明，8%(g/ml)聚山梨酯80有效消除供試品的抑菌活性。聚山梨酯80可同時(shí)作為本供試品的乳

化劑和中和劑，簡(jiǎn)化檢查方法，提高效率[8]。加入中和劑后，對(duì)沖洗液沖洗量和供試品稀釋級(jí)進(jìn)行進(jìn)一步考察，以消除其抗菌活性為目的，最終篩選出最適合的方法[9]。

復(fù)方特比萘芬軟膏對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用強(qiáng)，因此在控制菌金黃色葡萄球菌檢查中除了加入中和劑，還使用薄膜過(guò)濾法合并培養(yǎng)基稀釋法以達(dá)到抗菌的作用。培養(yǎng)基稀釋法利用減少單位體積內(nèi)的供試品濃度以消除供試品抑菌作用，操作簡(jiǎn)便且不減少供試品檢驗(yàn)量。培養(yǎng)基體積為600 ml或以上時(shí)，試驗(yàn)組顯示金黃色葡萄球菌相應(yīng)的反應(yīng)特征。

《中國(guó)藥典》2015版四部將加菌提前至供試液制備環(huán)節(jié)，更貼近藥品在生產(chǎn)、貯存和運(yùn)輸過(guò)程中微生物污染的實(shí)際情況，提高試驗(yàn)的科學(xué)性[10]。但是莫匹羅星和特比萘芬的抗菌活性強(qiáng)，在供試液制備環(huán)節(jié)加菌無(wú)法達(dá)到規(guī)定的回收比值，所以選擇在薄膜過(guò)濾沖洗后加菌。因此結(jié)合實(shí)際情況，對(duì)于抗菌活性強(qiáng)的藥物，可以考慮經(jīng)過(guò)中和、稀釋或薄膜過(guò)濾處理后再加入菌懸液。

4 結(jié)論

復(fù)方特比萘芬軟膏的微生物限度檢查方法為：需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)采用薄膜過(guò)濾法，取1∶100稀釋級(jí)供試液10 ml進(jìn)行沖洗，沖洗量為300 ml。霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)采用薄膜過(guò)濾法，取1∶20稀釋級(jí)供試液10 ml進(jìn)行沖洗，沖洗量為800 ml。控制菌檢查：采用薄膜過(guò)濾法，取1∶10稀釋級(jí)供試液10 ml進(jìn)行沖洗，沖洗量為300 ml，接種至100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，按照銅綠假單胞菌檢查法檢查；采用薄膜過(guò)濾法，取1∶10稀釋級(jí)供試液10 ml進(jìn)行沖洗，沖洗量為1 000 ml，接種至600 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，按照金黃色葡萄球菌檢查法檢查。本方法科學(xué)準(zhǔn)確，可為類(lèi)似抗菌活性強(qiáng)的品種的微生物限度檢查方法的設(shè)計(jì)提供參考。