王玉鵬，鮑 婕

(武警安徽省總隊醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥 230041)

結(jié)核病是由結(jié)核桿菌導(dǎo)致的、經(jīng)呼吸道傳染的威脅人類健康的一種重要傳染病。盡管近年來已經(jīng)有較為有效的治療方法及藥物，但結(jié)核病的發(fā)病率依然呈逐年升高的趨勢。我國是僅次于印度的第二大結(jié)核病發(fā)病國，并且是耐藥性結(jié)核病流行最嚴重的國家之一[1-2]。

抗結(jié)核病治療的一線用藥為異煙肼、利福平、鏈霉素、吡嗪酰胺和乙胺丁醇。其中，異煙肼(isoniazid,INH)通過抑制結(jié)核桿菌細胞所特有的分枝菌酸合成，使得結(jié)核桿菌失去疏水性、耐酸性和增殖能力而導(dǎo)致死亡，是一線抗結(jié)核藥物中不可替代的首選藥物。但抗結(jié)核病藥物治療中，最常見的不良反應(yīng)是肝損傷[3-5]，一系列文獻報道異煙肼具有肝臟毒性[6]，臨床資料提示異煙肼的應(yīng)用可以引起20%左右的患者出現(xiàn)肝功能改變，約1.6%的患者可發(fā)展為癥狀性肝炎使抗結(jié)核病的治療中斷，更有較少數(shù)患者可引起肝功能衰竭甚至出現(xiàn)嚴重的肝損傷而導(dǎo)致死亡，但異煙肼的肝毒性機制至今仍未闡明。筆者對現(xiàn)階段潛在的異煙肼肝毒性機制研究進行綜述，為防治抗結(jié)核藥物誘導(dǎo)的肝損傷提供新思路。

1 異煙肼代謝物與肝毒性

異煙肼是一種容易被氧化的酰肼類化合物，其代謝產(chǎn)物乙酰肼(acetylhydrazine)和肼(hydrazine)被普遍認為與異煙肼肝毒性有關(guān)[7]，這些毒性代謝產(chǎn)物可在大鼠肝細胞中誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)的過度產(chǎn)生。其中N-乙酰轉(zhuǎn)移酶2(N-acetyltransferase 2 ,NAT2)和CYP2E1是異煙肼代謝為乙酰肼和肼的代謝關(guān)鍵酶。

1.1 乙酰肼

早期有文獻[8]表明，大鼠異煙肼單純治療組未表現(xiàn)出肝毒性，乙酰肼與苯巴比妥合用則可造成急性肝損傷。從代謝層面上看，異煙肼可被NAT2代謝為乙酰異煙肼后水解成乙酰肼，乙酰肼經(jīng)由CYP2E1的催化，氧化形成N-羥基乙酰肼，其可進一步脫水形成乙酰二嗪，乙酰二嗪作為一種毒性代謝產(chǎn)物，可裂解為活性離子，共價結(jié)合肝臟中的大分子，從而造成肝損傷[9-10]。

1.2 肼

肼具有肝、腎、中樞神經(jīng)等多器官毒性，是致癌、致突變的肝毒性物質(zhì)[11]。肼可產(chǎn)生氧自由基和超氧化物，破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)而造成多肽鏈降解[12]，有研究發(fā)現(xiàn)異煙肼治療中超氧化物含量增加[13]。Garrod等[14]對SD大鼠給予肼，采用NMR技術(shù)評估了肼對肝臟的生化影響。通過組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)肝細胞產(chǎn)生低毒至中毒的改變。肝臟中的三酰甘油和β-丙氨酸含量升高，而肝糖原、膽堿、葡萄糖、牛黃酸和三甲胺-N-氧化物含量降低，牛黃酸和β-丙氨酸相協(xié)同的變化被視為肝毒性的標志。Bando等[15]運用基于 GC-MS的代謝組學(xué)方法開展肼誘導(dǎo)肝損傷的毒性評估，結(jié)果顯示肼誘導(dǎo)肝損傷大鼠的血液、尿液中谷胱甘肽前體和代謝產(chǎn)物的含量均呈現(xiàn)升高趨勢。谷胱甘肽的耗竭已被證實可以誘發(fā)肝細胞的凋亡[16]。

2 線粒體功能障礙

近年來國內(nèi)外研究表明，線粒體損傷是各類肝損傷，諸如肝功能衰竭、脂肪肝、肝硬化等病癥的重要發(fā)病機制之一。線粒體是真核細胞能量供應(yīng)和新陳代謝的主要場所，線粒體損傷會誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞能量耗竭，誘發(fā)凋亡和壞死[17-18]。使用動物細胞系進行體外實驗，異煙肼的肝毒性伴隨著線粒體膜電位變化和DNA鏈斷裂[19]。張煒等[20]體內(nèi)實驗顯示異煙肼給藥降低小鼠肝細胞線粒體中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶的活性，增加丙二醛(malondialdehyde，MDA)及mtDNA中8-OH脫氧鳥苷的含量，出現(xiàn)線粒體腫脹、基質(zhì)疏松、嵴斷裂、膜不完整甚至完全消失，空泡或內(nèi)容物生成，表現(xiàn)出線粒體損傷。Bhadauria S等[21-22]證實異煙肼可在人肝癌細胞株HepG2中誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，造成線粒體損傷，進而誘導(dǎo)凋亡。異煙肼及其毒性代謝產(chǎn)物肼通過產(chǎn)生氧化應(yīng)激，抑制線粒體呼吸鏈中間酶活性，干擾細胞能量代謝，對線粒體膜發(fā)起攻擊導(dǎo)致其功能異常，最終引起線粒體損傷，啟動細胞凋亡程序[23]。

3 氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激是指細胞內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，被認為是肝臟毒性最主要的機制之一[24]。臨床數(shù)據(jù)顯示，接受異煙肼治療的患者血漿中谷胱甘肽水平增加，MDA含量減少，說明異煙肼可造成氧化應(yīng)激[25]。異煙肼引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)與ROS和RNS的產(chǎn)生有關(guān)，ROS可以造成細胞內(nèi)的基本復(fù)合體分子(如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA)發(fā)生退化，引起線粒體損傷，致DNA變異，脂質(zhì)過氧化，細胞因子生成增加，甚至細胞凋亡[26]。

CYP2E1是細胞內(nèi)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的關(guān)鍵酶，CYP2E1的誘導(dǎo)是發(fā)生氧化應(yīng)激、產(chǎn)生ROS、造成肝損傷的中心環(huán)節(jié)[27]。異煙肼可在小鼠[28]、大鼠[29]體內(nèi)誘導(dǎo)CYP2E1的蛋白表達。有研究表明[30]，慢乙酰化者和攜帶CYP2E1 c1/c1基因型的患者較其他患者在抗結(jié)核藥物誘導(dǎo)的肝損傷中具有更高的患病風(fēng)險。

核因子E2相關(guān)因子2-抗氧化反應(yīng)元件信號通路(nuclear factor-E2-related factor 2-antioxi-dant response elements,Nrf2-ARE)是細胞內(nèi)主要的氧化應(yīng)激防御機制。Chen等[31]證實異煙肼是有效的抗氧化反應(yīng)元件活性抑制劑，在3T3-L1細胞,HepG2細胞株中，它可以有效抑制許多抗氧化反應(yīng)元件依賴性抗氧化劑和Ⅱ相解毒酶的活性，此研究表明異煙肼造成的肝損傷的機制有可能是由于抑制抗氧化反應(yīng)元件依賴性抗氧化劑的表達而導(dǎo)致的氧化應(yīng)激。

4 脂質(zhì)過氧化

內(nèi)源性的脂質(zhì)過氧化(lipid peroxidation)被認為是異煙肼產(chǎn)生細胞毒性的主要原因之一。異煙肼及其代謝產(chǎn)物生成高濃度的ROS，ROS是脂質(zhì)過氧化的刺激物，造成細胞膜損傷，所以異煙肼作為脂質(zhì)過氧化的刺激物造成細胞凋亡和肝臟壞死。同時脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生具有毒性的醛副產(chǎn)物，引起一系列下游效應(yīng)，如破壞細胞膜完整性、線粒體和肌質(zhì)網(wǎng)功能異常、鈣穩(wěn)態(tài)失衡等。

MDA是脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物，是評價脂質(zhì)過氧化的主要參數(shù)，SOD是體內(nèi)唯一一個可以清除超氧陰離子的酶，對機體氧化與抗氧化作用平衡起到不可忽視的重要作用。谷胱甘肽的體內(nèi)含量是衡量機體抗氧化能力的重要因素。文獻報道[24,34-36]，異煙肼治療組MDA含量升高、SOD活性降低，谷胱甘肽含量下降較對照組差異明顯，大鼠肝臟損傷嚴重程度與脂質(zhì)過氧化程度呈明顯相關(guān)性。

5 異煙肼肝毒性的新理論

除了上面提及的異煙肼肝毒性機制的幾種常見假說，一些新的機制理論被業(yè)界廣泛認同。

5.1 原卟啉是造成異煙肼肝毒性的關(guān)鍵物質(zhì)

Li等[37]使用孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)-人源性小鼠模型揭示：異煙肼與利福平合用在肝中經(jīng)由PXR介導(dǎo)的亞鐵血紅素生物合成途徑造成原卟啉IX(protoporphyrin IX)積聚，原卟啉IX是血紅素生物合成的中間體，同時原卟啉IX也是一種內(nèi)源性的肝毒性物質(zhì)，大劑量的原卟啉IX具有一定的肝毒性，可以在肝臟中蓄積導(dǎo)致膽汁栓塞型肝損傷[38]。PXR的激活可以上調(diào)氨基乙酰丙酸合成酶(aminolevulinic acid synthase，ALAS1)的表達，在體內(nèi)以甘氨酸和琥珀酰輔酶A為原料，經(jīng)ALAS1催化生成產(chǎn)物氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid ,ALA)。氨基乙酰丙酸是原卟啉IX的前體物質(zhì)，進入線粒體膜生成原卟啉IX[39]。高濃度的原卟啉IX在異煙肼、利福平合用的PXR-人源性小鼠肝臟中被檢測出。PXR-ALAS1是異煙肼、利福平造成肝損傷的一條關(guān)鍵性通路，通過PXR信號通路的激活，造成ALAS1上調(diào)和細胞色素P450酶基因的激活，增加亞鐵血紅素在肝臟中的生物合成和原卟啉IX的積聚，原卟啉IX在肝臟中蓄積導(dǎo)致肝損傷[40]。這一結(jié)果為異煙肼和利福平誘導(dǎo)的肝損傷機制提供了一個新思路。Sachar等[41]進一步研究發(fā)現(xiàn)，異煙肼通過上調(diào)ALAS1水平和下調(diào)亞鐵螯合酶(ferrochelatase，F(xiàn)ECH)水平，通過抑制FECH的活性，使原卟啉 IX轉(zhuǎn)化為血紅素的能力下降，導(dǎo)致原卟啉 IX 在細胞中積聚，誘導(dǎo)形成肝損傷。

5.2 免疫系統(tǒng)的相互作用

有證據(jù)表明，肝損傷是由適應(yīng)性免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的[42-43]。異煙肼可以誘發(fā)一種類似狼瘡的綜合征，表明它可以引起免疫反應(yīng)[44-45]。事實上，異煙肼可以與體外的巨噬細胞結(jié)合，表明藥物可以通過與巨噬細胞上的醛基結(jié)合并刺激白細胞介素-6的產(chǎn)生，從而形成共價加合物并啟動免疫反應(yīng)[46]。

5.3 細胞色素P450酶作用

細胞色素P450(cytochrome P450 ,CYPs)酶是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的蛋白酶，目前己知的CYPs的種類超過1000多種，人肝臟中CYP 3A4的含量最豐富，約占CYPs總量的40%，并參與50%以上常用藥物種類的代謝。有研究發(fā)現(xiàn)，CYP3A4可能參與異煙肼的代謝、生物活化，同時與異煙肼肝損傷的形成有關(guān)。Vignati等[47]發(fā)現(xiàn)將異煙肼與CYP3A4重組基因酶系共同孵育培養(yǎng)，細胞存活率顯著降低，呈現(xiàn)出細胞毒性，在給予CYP3A4抑制劑后，這一現(xiàn)象出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。在臨床實驗中，在異煙肼誘導(dǎo)的肝損傷患者體內(nèi)檢出抗-CYP3A4抗體[46]，說明異煙肼誘導(dǎo)的肝損傷與CYP3A4有緊密聯(lián)系。張志華[48]應(yīng)用QSG-7701肝細胞株進行研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用異煙肼處理后，細胞CYP3A4活性顯著升高，異煙肼和利福平合用時則使其活性進一步升高，表明異煙肼可作為CYP3A4誘導(dǎo)劑，異煙肼和利福平合用時產(chǎn)生協(xié)同作用，推測這種作用是其合用對肝細胞毒性增加的機制之一。 相反，有報道認為異煙肼抑制CYP3A4的活性[49]。另有報道指出，未發(fā)現(xiàn)CYP3A4在小鼠體內(nèi)參與異煙肼生物活化和造成肝毒性的依據(jù)[50]。說明CYP3A4在異煙肼誘導(dǎo)的肝臟毒性中產(chǎn)生的作用存在爭議，有待進一步的研究論證。

6 結(jié)論與展望

目前的研究中，對異煙肼的肝毒性機制的討論主要集中于：異煙肼代謝產(chǎn)物乙酰肼和肼具有肝毒性；異煙肼可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，致線粒體損傷，進而誘導(dǎo)肝細胞凋亡；異煙肼及其代謝產(chǎn)物作為脂質(zhì)過氧化的刺激物會造成細胞凋亡和肝臟壞死。同時，一些新的機制理論也被研究者發(fā)現(xiàn)。但是，當前異煙肼致肝損傷的發(fā)病機制仍未完全闡明，尚存在爭議?？菇Y(jié)核藥物的肝損傷副作用是患者中斷抗結(jié)核病化療的重要原因之一，所以異煙肼等抗結(jié)核藥物的肝毒性機制亟待研究透徹，需要科研人員進一步的研究發(fā)現(xiàn)，為臨床使用抗結(jié)核藥物減少肝損傷不良反應(yīng)，提供理論基礎(chǔ)。

為預(yù)防和規(guī)避異煙肼等抗結(jié)核病藥物的肝損傷不良反應(yīng)，還需加強以下幾方面的研究：第一，目前，預(yù)測和診斷抗結(jié)核病藥物引起肝損傷的生物標志物仍以傳統(tǒng)肝功能指標為主，如血清丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)[51]，但這些生物標志物存在早期預(yù)測差，特異性較低等不足[52]。因此，應(yīng)加快尋找預(yù)測和診斷抗結(jié)核病藥物誘導(dǎo)的肝損傷的特異性生物標志物，高特異性、高靈敏度的生物標志物有利于早期預(yù)測并規(guī)避抗結(jié)核藥物引發(fā)的肝損傷不良反應(yīng)，推動精準醫(yī)療的發(fā)展。第二，進一步加強藥物濃度、患者基因型與肝損傷發(fā)生程度關(guān)系的相關(guān)研究，在臨床使用中，對易誘發(fā)肝損傷的高?；蛐徒Y(jié)核病患者可考慮抗結(jié)核病化學(xué)治療方案的調(diào)整。第三，早期研究發(fā)現(xiàn)水飛薊素對于抗結(jié)核藥物誘發(fā)的肝損傷有較好的治療效果[53]，現(xiàn)已用于臨床。更多的類似化合物被發(fā)現(xiàn)，文獻報道玉郎傘多糖、咖啡酸多巴胺等化合物可以有效對抗抗結(jié)核病藥物的肝毒性，具有一定的肝臟保護作用[54,36]。這種類似化合物對抗結(jié)核病藥物肝毒性的預(yù)防和保護作用研究，需要進一步深入研究其安全性和有效性。