杜 毅，丁德英，呂 磊，李 玲

(1．上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院藥學部，上海 200092 ；2．海軍軍醫(yī)大學藥學院分析測試中心，上海 200433；3 ．上海東方肝膽外科醫(yī)院藥材科，上海 200438)

慢性腎功能衰竭(chronic renal failure,CRF)是指在各種慢性腎實質(zhì)疾病的基礎(chǔ)上緩慢地出現(xiàn)腎功能減退而至衰竭的一種慢性惡性疾病，其臨床綜合征包括腎功能減退，代謝產(chǎn)物潴留，水、電解質(zhì)、酸堿平衡失調(diào)等全身各系統(tǒng)癥狀[1]。各種原發(fā)性和繼發(fā)性的泌尿系統(tǒng)病變導致腎臟結(jié)構(gòu)和功能破壞的疾病都會引起腎衰，其中泌尿系統(tǒng)結(jié)石已經(jīng)同高血壓、糖尿病一起被公認為慢性腎病的危險因素[2]。腎結(jié)石主要成分為草酸鈣和磷酸鈣，主要的治療手段是外科手術(shù)，其發(fā)病率高，治療花費大，易誘發(fā)尿毒癥。結(jié)晶是結(jié)石的早期表現(xiàn)，對于其成核、生長以及對小管上皮細胞損傷作用的機制仍缺乏深入了解。由此，對腎臟結(jié)晶所造成損傷的早期診斷與針對性治療具有顯著的臨床價值。

金錢草為報春花科植物過路黃LysimachiachristinaeHance的新鮮或干燥全草，主要含黃酮類，苷類，鞣質(zhì)，揮發(fā)油等成分，味甘、微苦、性涼，具有利水通淋、清熱利濕、散瘀消腫之功效[3]。大量的臨床經(jīng)驗表明，金錢草具有利尿通淋，排除結(jié)石之功效，可用于結(jié)石的預防和治療[4-5]，然而其作用機制尚不明確。代謝組學是對生物體內(nèi)盡可能多的代謝物進行定量分析，并尋找代謝物與機體生理病理變化的相互關(guān)系的一種研究方式[6]。它能夠闡明機體的整體代謝狀態(tài)，與中醫(yī)藥治療的整體觀念相符。本研究利用代謝組學方法探索與結(jié)晶腎損傷密切相關(guān)的潛在生物標志物，并以金錢草作為干預藥物，探討其對結(jié)晶腎損傷的預防治療作用機制，為腎結(jié)石的早期診斷治療及金錢草的進一步合理用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Thermo Trace GCUltra氣相色譜儀、DSQII質(zhì)譜儀、FRESCO17臺式冷凍離心機(Thermo Fisher Scientific)， METTLER AE240 型電子天平(瑞士梅特勒公司)，DZG-6020真空干燥箱 (上海益恒實驗儀器公司)。

1.2 試藥

丙二醛(MDA)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、谷胱甘肽還原酶(GSH)檢測試劑盒、過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒(南京建成生物工程公司)，甲氧胺鹽酸鹽、吡啶、N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)、三甲基氯硅烷(TMCS)、核糖醇(Sigma Aldrich公司)，甲醇為色譜純(德國默克公司)，氯仿為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)，金錢草(產(chǎn)地：廣西,批號：20171201)購于上海雷允上大藥房。

1.3 實驗動物

SPF級野生型C57BL/6小鼠21只，體重25～30 g，雄性，7～8周齡，海軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。小鼠飼養(yǎng)于保持12 h/12 h晝夜的房間中，給予標準飼料，恒溫(21～23)℃，相對濕度為40%左右，12 h交替照明，21只小鼠在上述條件下適應環(huán)境24 h。

2 方法

2.1 動物模型的構(gòu)建和治療

將21只野生型C57BL/6小鼠隨機分為3組：空白對照組、結(jié)晶腎損傷模型組和金錢草干預組，每組7只，24 h適應性飼養(yǎng)后，對模型組和金錢草干預組分別每天腹腔注射乙醛酸鹽100 mg/kg，對照組給予相同體積的生理鹽水，連續(xù)注射6 d。同時金錢草干預組每天灌胃給予相當于原藥材1 g/kg劑量的金錢草提取物，連續(xù)給藥6 d，對照組和結(jié)晶模型組每天給予同體積的生理鹽水，連續(xù)6 d。

2.2 樣品收集

按上述方法給藥飼養(yǎng)后6 d后，小鼠眼眶取血，血樣在室溫下靜置45 min，1 500 ×g離心15 min，分離得到上層血清，置于-80℃冷凍保存。處死全部小鼠，行心臟灌流，切取左側(cè)腎臟取皮髓質(zhì)交界處組織，檢測鈣含量、MDA、SOD、GSH、CAT活力水平。

2.3 樣品制備

將凍存的血清樣品置于室溫自然解凍，取血清100 μl，加入400 μl 甲醇(含10 μg/ml的核糖醇內(nèi)標)，渦旋1 min，4℃靜置10 min，13 800 ×g離心15 min，取上清液200 μl，置于1.5 ml的離心管中，氮氣吹干。

2.4 樣品衍生化

在上述氮氣吹干的樣品殘渣中加入15 mg/ml的甲氧胺吡啶溶液50 μl，渦旋30 s，置于70℃的烘箱中反應60 min，再加入MSTFA (含1%的TMCS) 50 μl，渦旋1 min，室溫反應30 min，再加入100 μl正庚烷，渦旋30 s，1 500 ×g離心5 min，取上清液100 μl至進樣小瓶。

2.5 GC-MS分析

色譜條件：色譜分離采用 Agilen DB-5MS氣相色譜柱 (30 m×0.25 mm，0.25 μm)，程序升溫：起始溫度70 ℃，保持3 min，以4 ℃/min 的速率升溫至220 ℃，然后以10 ℃/min升至300 ℃并保持6 min，進樣口溫度250 ℃，分流比10:1，傳輸線溫度260 ℃，載氣為高純氦氣，流速1 ml/min，進樣量1 μl。質(zhì)譜條件：采用EI離子源，電子能量70 ev，離子源溫度200 ℃；質(zhì)量范圍(m/z)：50～650 amu；溶劑延遲時間6 min，質(zhì)譜采集時間50 min。

2.6 數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)Xcalibur File converter工具轉(zhuǎn)換為通用的CDF格式。轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進一步通過R軟件XCMS程序包進行峰校正和峰積分，最終得到一個保留時間、質(zhì)荷比和峰強度的三維數(shù)據(jù)矩陣。由于GC-MS本身具有明顯復雜性，同一保留時間下存在多個離子碎片，因此，采用了無靶標過濾的方式，即只保留同一保留時間下峰度最強的離子(保留時間窗為0.01 min)。采用80%規(guī)則來去除缺失值，即去除在某一組中出現(xiàn)頻率(非零值)低于80%的質(zhì)譜離子[7]。為減小樣品制備及儀器不穩(wěn)定帶來的誤差，在進行模式識別前將數(shù)據(jù)用內(nèi)標進行校正，并進行分面積歸一化，將所得的各離子積分數(shù)據(jù)以Excel格式存儲。將歸一化后的數(shù)據(jù)導入SIMCA-P V11.0 (Umetrics，Sweden)軟件進行偏最小二乘法-判別式分析(PLS-DA)，根據(jù)相關(guān)R2，Q2值對模型進行評價。對差異代謝物進一步進行雙側(cè)t檢驗分析(模型組與對照組)，當P<0.05時，認為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果與討論

3.1 生物化學指標的測定

生化學指標測定結(jié)果見表1。與對照組相比，模型組中鈣含量與MDA含量明顯升高；CuZn-SOD活力，GSH含量及CAT活力顯著下降，而金錢草干預組與模型組相比各指標均發(fā)生明顯的回調(diào)，表明金錢草提取物對結(jié)晶腎損傷具有一定的預防治療作用。

表1 生化指標檢測結(jié)果

*P<0.05，與對照組比較；#P<0.05，與模型組比較

3.2 基于GC-MS的血清代謝輪廓分析

獲取穩(wěn)定重現(xiàn)的代謝組學數(shù)據(jù)是代謝組學研究成功的關(guān)鍵。為了評價分析系統(tǒng)的穩(wěn)定性，本研究用等體積混合來自每只小鼠血清作為質(zhì)控樣品，采用與實際樣品同樣的前處理方法，在樣品序列之前連續(xù)進樣6針，并平均分布在實測樣品序列中，一共分析9次。隨機選擇了8個色譜峰(圖1)，考察了其在9次重復分析中保留時間和峰面積的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示色譜峰保留時間RSD<0.11%，峰面積RSD<2.82%，表明該分析系統(tǒng)穩(wěn)定可靠。

3.3 多變量統(tǒng)計分析和潛在生物標志物的鑒定

經(jīng)過數(shù)據(jù)處理后，GC-MS數(shù)據(jù)集得到了141個離子。采用了有監(jiān)督的PLS-DA方法對兩組數(shù)據(jù)進行分析，如圖2A 所示，結(jié)果顯示對照組和模型組在所建立的數(shù)據(jù)模型中表現(xiàn)出良好的擬合度和預測能力(R2X=0.85，R2Y=0.96，Q2=0.93)。采用置換檢驗來進行模型驗證，經(jīng)200次置換檢驗后產(chǎn)生的截距R2=0.256，Q2=-0.289(圖2B)，表明模型具有良好的預測能力和可靠性。VIP值反映了各變量在模型建立中的重要性，本研究以VIP≥1和雙側(cè)t檢驗(P<0.05)分析，篩選鑒定了14個與結(jié)晶腎損傷相關(guān)的代謝產(chǎn)物，結(jié)果如表2所示。

3.4 潛在標志物生物學意義的解釋

泌尿系結(jié)石是全球性常見病，其發(fā)病率約10%～15%，并有逐年增高的趨勢[8]。結(jié)晶是結(jié)石的早期表現(xiàn)，對結(jié)晶腎損傷的研究有助于泌尿系結(jié)石的早期診斷。本研究利用代謝組學方法鑒別了與結(jié)晶腎損傷密切相關(guān)的14種代謝物。查詢KEGG數(shù)據(jù)庫，我們發(fā)現(xiàn)這些代謝物主要涉及嘌呤代謝、氨基酸代謝、糖代謝等途徑。血清中尿素濃度主要受腎功能、蛋白質(zhì)攝入量和分解代謝情況的影響，血清尿素含量升高通常意味著腎臟疾病的發(fā)生，如急性腎衰、慢性腎炎、腎動脈硬化、腎結(jié)石等[9]。與對照組相比，模型組中的尿素含量顯著升高，這也與臨床上用血清中的尿素水平來診斷腎損傷程度的方法一致。

與正常組比較，模型組中的多種氨基酸如異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸，脯氨酸含量明顯降低，表明結(jié)晶腎損傷小鼠體內(nèi)存在氨基酸代謝異常。甘氨酸作為抗氧化劑，可以延緩氧自由基對腎臟的損害，通過調(diào)節(jié)腎臟抗氧化酶、Na+K+-三磷酸腺苷酶、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛和一氧化氮等物質(zhì)的水平來保護腎臟[10]。模型組中甘氨酸的含量顯著降低，表明小鼠腎臟受損嚴重。支鏈氨基酸在蛋白合成、能量代謝、脂類代謝等方面中起著重要的作用。模型組中纈氨酸和異亮氨酸的含量明顯降低，可能是由于嚴重的腎臟損傷導致機體能量供應不足，從而代償性的利用支鏈氨基酸作為能量的供給。另外，慢性腎臟病晚期患者，因代謝性酸中毒而導致支鏈氨基酸分解[11]，也可能是結(jié)晶腎損傷小鼠體內(nèi)支鏈氨基酸含量下降的原因之一。

乳酸是機體內(nèi)重要的酸性物質(zhì)，其代謝與機體內(nèi)的氧化還原反應和能量代謝密切相關(guān)[12]。模型組中的乳酸含量明顯升高，一方面可能是由于乙醛酸鹽誘導的結(jié)晶腎損傷導致糖酵解加強，使得以乳酸為底物的糖異生途徑產(chǎn)生阻礙，從而導致乳酸含量的升高；另一方面可能是由于腎臟受損產(chǎn)生大量的自由基，造成組織細胞受損，導致內(nèi)酶外泄入血，使得各組織細胞中的乳酸脫氫酶含量增加，造成機體乳酸的蓄積。

圖1 小鼠血清典型的GC-MS總離子流圖 A.對照組；B.結(jié)晶腎損傷模型組；C.金錢草干預組；1.乳酸；2.β-羥基丁酸；3.甘氨酸；4.脯氨酸；5.D-來蘇糖；6.葡萄糖；7.肌醇；8.硬脂酸

圖2 基于GC-MS數(shù)據(jù)的正常組和模型組PLS-DA分析的得分圖(A)和置換驗證結(jié)果圖(B)

序號保留時間(t/min)分子式代謝物趨勢a代謝通路18.76C3H6O3乳酸↑***糖酵解211.44H2C2O4草酸↑***乙醛酸代謝312.15C4H8O3β-羥基丁酸↑***脂肪酸代謝414.02C5H11NO2纈氨酸↓**支鏈氨基酸代謝515.13CH4N2O尿素↑**嘌呤代謝616.04C3H8O3丙三醇↑*甘油磷脂代謝717.03C2H5NO2甘氨酸↓**谷胱甘肽代謝823.83C5H9NO2脯氨酸↓***精氨酸輔氨酸代謝933.14C5H12N2O2鳥氨酸↓**精氨酸輔氨酸代謝1034.37C6H12O6葡萄糖↓***糖代謝1134.80C6H12O6果糖↓***糖代謝1238.03C16H32O2軟脂酸↑***脂肪酸代謝1338.92C6H12O6肌醇↑***磷脂代謝1441.19C18H36O2硬脂酸↑***脂肪酸代謝

a模型組與對照組比較，*P<0.05；**P<0.01；***P< 0.001

3.5 金錢草的干預治療

金錢草作為排石之要藥，其臨床作用已得到驗證，但其作用機制尚不明確。以結(jié)晶腎損傷相關(guān)的標志物為監(jiān)測指標可以評價金錢草的治療作用。將正常對照組，結(jié)晶腎損傷模型組以及金錢草干預組采用無監(jiān)督的PCA分析，其得分如圖3所示，各組在第一主成分上得到了良好的區(qū)分，而金錢草干預組介于模型組和對照組之間，比較潛在標志物的相對含量發(fā)現(xiàn)，9種代謝物的含量發(fā)生明顯逆轉(zhuǎn)(圖4)，結(jié)合血清生化分析，我們推斷金錢草能夠功能性的調(diào)節(jié)糖代謝，脂類代謝和氨基酸代謝途徑發(fā)揮抗結(jié)晶腎損傷作用。

圖3 正常組、結(jié)晶腎損傷模型組、金錢草干預組的主成分分析得分圖

圖4 14種潛在標志物在對照組、模型組和給藥組中的相對含量變化 *P<0.05,與模型組比較

4 結(jié)論

本研究建立了GC-MS代謝組學分析的方法，通過PLS-DA篩選出與結(jié)晶腎損傷密切相關(guān)的14種潛在生物標志物，主要涉及了嘌呤代謝、氨基酸代謝、糖代謝等途徑?；谶@14種標志物，對金錢草提取物的預防治療結(jié)晶腎損傷模型進行了評價，結(jié)果表明金錢草提取物能夠回調(diào)部分潛在標志物的相對含量，恢復失衡的代謝通路，發(fā)揮預防治療作用。本研究為腎結(jié)石的早期診斷治療及金錢草的進一步開發(fā)應用提供實驗依據(jù)。