陶智怡 王金平 陸燁 姜洪心

[摘要] 目的 探討益氣溫陽方聯(lián)合化療對晚期（ⅢⅣ期）結直腸癌患者外周血Treg細胞比率的影響及益氣溫陽方的抗癌機制。方法 方便收集2017年01月—2018年06月收治的56例晚期結直腸癌患者，分為研究組及照組。對照組患者進行化療，研究組患者在化療基礎上口服益氣溫陽方，兩組患者均以21 d為一周期。利用流式細胞技術檢測治療前及治療2周期后外周血CD4+ CD25+ CD127low/-Treg細胞表達水平。結果 對照組治療后的外周血CD4+ CD25+ CD127low/-Treg細胞比率較治療前下降不明顯[（5.51±0.87）%vs（5.03±1.21%]，治療前后差異無統(tǒng)計學意義（t=1.76，P>0.05），研究組治療后的外周血CD4+ CD25+ CD127low/-Treg細胞比率較治療前下降明顯[（5.59±1.45）%vs（4.28±1.23）%]，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.51，P<0.01），且研究組治療后CD4+ CD25+ CD127low/-Treg細胞比率明顯低于對照組[（4.28±1.23）vs（5.03±1.21）]，兩組治療后的組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.29，P=0.02）。另研究組Treg細胞的抑制率明顯高于對照組[（0.22±0.17）vs（0.09±0.13）]，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.18，P<0.01）。 結論 益氣溫陽方聯(lián)合化療能明顯降低ⅢⅣ期結直腸癌患者外周血Treg細胞比率。通過降低Treg細胞水平，調節(jié)腫瘤免疫逃逸微環(huán)境來抑制腫瘤生長轉移可能是益氣溫陽方扶正以抗癌的機制之一。

[關鍵詞] 益氣溫陽;結直腸癌;免疫逃逸;CD4+ CD25+ CD127low/-Treg

[中圖分類號] R276.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-0742（2019）04（c）-0001-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of Yiqi Wenyang Decoction combined with chemotherapy on the peripheral blood Treg cells of patients with late stage （III IV） colorectal cancer. To investigate the anticancer mechanism of Yiqi Wenyang Decoction. Methods Convenient select a total of 56 patients with advanced colorectal cancer from January 2017 to June 2018 were collected. They were divided into control group and study group. The control group was given chemotherapy. The study group was given both Yiqi Wenyang Decoction and chemotherapy. The two groups were treated with 21 days as a treatment cycle. The expression level of CD4++ CD25+ CD127low/-Treg cells in peripheral blood was detected by flow cytometry before treatment and after 2 treatment cycles. Results The ratio of CD4++ CD25+ CD127low/-Treg cells in the peripheral blood of the control group was not significantly lower than that before treatment [（5.51±0.87）% vs （5.03±1.21%]， which did not make significant difference between the ratio before treatment and the ratio after treatment （t=1.76， P>0.05）. The ratio of CD4+ CD25+ CD127low/-Treg cells in the peripheral blood of the study group was significantly lower than that before treatment [（5.59±1.45）% vs （4.28±1.23）%]， which was statistically significant （t=3.51， P<0.01）. And the ratio of CD4+ CD25++ CD127low/-Treg cells in the study group was significantly lower than that in the control group [（4.28±1.23） vs （5.03±1.21）]， and the difference between the two groups after treatment was statistically significant （t=2.29， P=0.02）. The inhibition rate of Treg cells in the study group was significantly higher than that in the control group [（0.22±0.17） vs （0.09±0.13）]， which was statistically significant （t=3.18， P<0.01）. Conclusion Yiqi Wenyang Decoction combined with chemotherapy could significantly decrease the peripheral blood Treg cells of patients with late stage （III IV） colorectal cancer. Through decreasing the level of Treg cells and regulating tumor immune escape microenvironment to inhibit tumor growth may be one of the Yiqi Wenyang Decoctions mechanisms of strengthening the body resistance to fight cancer.

[Key words] Yiqi Wenyang; Colorectal cancer; Immune escape， CD4+ CD25+ CD127low/-Treg

結直腸癌是全球最常見腫瘤之一，中晚期結直腸癌患者化療后多因藥毒攻伐導致臟腑虛損，處于“脾腎陽虛”狀態(tài)，治療以健脾溫腎，扶正抗癌為主。本研究以結直腸癌ⅢⅣ期患者作為研究對象，觀察益氣溫陽方聯(lián)合化療對結直腸癌患者外周血調節(jié)性T細胞（Treg）的影響，討論益氣溫陽方對腫瘤免疫逃逸的作用。

在腫瘤發(fā)展過程中[1]免疫逃逸是腫瘤形成的關鍵。調節(jié)性T細胞是具有免疫抑制功能的T細胞亞群，它參與腫瘤免疫逃逸過程，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，大多數腫瘤患者Foxp3+Treg細胞升高往往提示預后不良[1-3]。聯(lián)合使用CD4+，CD25+和CD127可表達高純度的Foxp3+Treg細胞，腫瘤患者外周血CD4+CD25+ CD127low/-Treg水平與腫瘤預后成負相關[4]，能在一定程度上反映腫瘤治療療效[5-6]。該研究截止至2018年6月，共方便選取研究對象56例，現報道如下。

1? 資料與方法

1.1? 一般資料

方便收集蘇州市立醫(yī)院（東區(qū)）收治的結直腸癌晚期（ⅢⅣ期）患者56例作為研究對象，其中男37例，女19例，年齡35～81歲，平均（61.98±10.74）歲。對照組30例，研究組26例。所有入選患者均符合《結直腸癌診療規(guī)范》中的結直腸癌診斷標準，并經活檢或手術病理確診為結直腸癌。根據《AJCC癌癥分期手冊》第7版結直腸癌TNM分期標準，Ⅲ期18例，Ⅳ期38例。兩組間性別構成和年齡差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

納入標準：①經末次化療后1個月，未行放療、生物治療、中藥及其他抗癌治療;②無嚴重心、肝、腦、腎等器質性損害和骨髓造血功能障礙者;③卡氏評分（Kamofsky）≥60分;④預計生存期>4個月;⑤簽署知情同意書，自愿接受治療，依從性好，可隨訪;本試驗得到醫(yī)院倫理委員會批準。

排除標準：①不符合上述納入標準;②合并其他嚴重疾?、勰X轉移引起精神意識障礙及精神病不能合作者;④過敏體質及對藥物過敏者;⑤患者嘔吐頻繁，或厭服中藥。

1.2? 主要試劑和儀器

中藥藥材：益氣溫陽方：黃芪30 g（批號：1703120 09），黨參10 g（批號：170201005），茯苓10 g（批號：170418014），炙甘草10 g（批號：161129006），炒白術10 g（批號：170308002），薏苡仁30 g（批號：170115010），制附子10 g（批號：170415001），干姜6 g（批號：1612140 03），仙靈脾10 g（批號：170215010）（生產廠家：蘇州天靈中藥飲片廠）。煎煮工藝：蘇州天靈中藥飲片廠自動化煎煮設備標準煎煮工藝。檢測試劑：Fluorescein isothiocyanate （FITC）-CD4 +（BD Biosciences， Franklin Lakes， NJ， USA）;antigen-presenting cells （APC）-CD25 +（BD Biosciences）;PE-CD127（BD Biosciences）;溶血素（BD Biosciences）;檢測儀器：流式細胞儀（BD FACS Diva軟件）;分析流式數據軟件：BD FACS Diva軟件。

1.3? 方法

1.3.1? 治療方法? 對照組結合患者既往治療方案，參照《NCCN結腸癌臨床實踐指南》，選擇FOLFOX或FOLFIRI方案的化療，并根據患者一般情況調整化療劑量。研究組在對照組基礎上予以中藥益氣溫陽方（藥物組成：黃芪30 g，黨參10 g，茯苓10 g，炙甘草10 g，炒白術10 g，薏苡仁30 g，制附子10 g，干姜6 g，仙靈脾10 g），并根據患者證型進行適當劑量調整;水煎服，分早晚2次服。21 d為1個治療周期，每周期第8天開始服用中藥，持續(xù)服用14 d，2組患者進行治療2周期。

1.3.2? 標本采集? 第一周期治療前以及第二周期21 d治療后，清晨空腹使用肝素抗凝真空采血管采集外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝充分混勻確認無凝血，20℃～25℃室溫保存，6 h內進行流式抗體染色。

1.3.3? 指標檢測? 流式細胞術檢測CD4+ CD25+CD127low/-細胞：使用直接免疫熒光標記法標記細胞并進行流式細胞儀分析。取100 uL全血，分別加入抗人 （FITC）-CD4+、 （APC）-CD25+、PE-CD127各5 uL，另設同型對照管，補償管，渦旋震蕩后，4℃避光孵育15 min，加入紅細胞裂解液2 mL，渦旋后室溫孵育15 min。以2 mL PBS1800 r/min離心洗滌5 min，棄上清，將細胞懸浮于0.5 mL PBS洗滌液中，振蕩混勻后上機檢測。設定淋巴細胞為Rl門內細胞，CD4+細胞為R2門內細胞，測定CD25+CDl27low/-細胞占CD4+細胞的百分比。

1.4? 統(tǒng)計方法

應用SPSS 17.0 統(tǒng)計學軟件，實驗數據以均值x，標準差（x±s）表示，符合正態(tài)分布的數據兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，非正態(tài)分布數據兩組間比較采用兩獨立樣本χ2檢驗，相關性分析采用Spearman 等級相關系數，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結果

①對該研究中56例結直腸癌患者數據的統(tǒng)計分析顯示，治療后兩組患者外周血CD4+ CD25+CD127low/-Treg細胞占CD4+細胞比率都存在部分患者上升、部分患者下降（上升9例，下降47例），總體Treg細胞比率較治療前下降（P<0.05），圖1。

②研究組與對照組患者在治療前外周血CD4+ CD25+ CD127low/-Treg細胞比率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。對照組患者治療后與治療前Treg細胞比率未顯示差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），研究組治療后與治療前Treg細胞比率差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。研究組治療后外周血CD4+ CD25+ CD127low/-Treg細胞比率低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.29，P=0.02）。

③研究組治療后的Treg細胞比率較對照組下降明顯，研究組Treg細胞的抑制率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。說明益氣溫陽方聯(lián)合化療對于結直腸癌患者Treg細胞的抑制程度高于單純化療。

3? 討論

腫瘤免疫治療（cancer immunotherapy）是腫瘤學近年來最重要的研究方向[7]。針對腫瘤免疫逃逸機制的治療在部分類型的腫瘤患者取得了長期緩解的療效[8]。在免疫編輯的過程中，免疫逃逸是腫瘤形成的關鍵。免疫逃逸的機制包括腫瘤細胞的自身修飾、代謝和腫瘤微環(huán)境的兩方面改變[9]。腫瘤微環(huán)境中存在大量包括調節(jié)性T細胞（Treg）在內的抑制性免疫細胞。Treg細胞能夠分泌IL-10，TGF-β等因子抑制效應性T細胞及NKT等的增殖和功能，對于效應性T細胞抗腫瘤有抑制作用，在多種實體腫瘤的免疫逃逸中起重要的作用[10]。

中醫(yī)認為結直腸癌病位在大腸，脾腎虧虛為本，邪毒瘀滯為標，二者互為因果，互相影響?；熓菑V泛性細胞殺傷性的抗癌方法，結直腸癌化療后患者表現出納差消瘦、神疲乏力、畏寒腹瀉、面色晦暗、舌淡暗苔白、脈沉遲無力等癥狀，處于“脾腎陽虛”的免疫抑制狀態(tài)。

在“人是一個有機整體”的理論指導下，中醫(yī)學認為分析病理機制時應首先著眼局部病變引起的整體反應。在結直腸癌化療后，“脾腎陽虛”的機體整體狀態(tài)為腫瘤提供了有利的生長、逃逸環(huán)境，循環(huán)腫瘤細胞、休眠細胞和微轉移灶則成為腫瘤復發(fā)的種子。腫瘤微環(huán)境中發(fā)生的免疫逃逸正是腫瘤作用于機體、機體免疫對腫瘤的整體反應。因此，治療時宜扶正培本，減輕化療毒副反應，改善機體腫瘤內環(huán)境、及糾正機體腫瘤免疫功能抑制狀態(tài)?；熀舐?lián)合益氣溫陽方治療體現了中醫(yī)扶正以抗癌的思想。

益氣溫陽方以黃芪四君子湯加四逆湯為主方。黃芪四君子湯益氣健脾，四逆湯扶正溫陽，聯(lián)合薏苡仁健脾勝濕，仙靈脾溫煦腎陽，共奏益氣溫陽之功?；A與臨床研究[11-13]證實益氣溫陽類中藥對于腫瘤免疫逃逸有調節(jié)作用。譚佳妮等[11]通過荷瘤小鼠試驗，證實含有益氣中藥的消癌解毒方具有顯著抑制結腸癌增殖的作用，其機制可能與減少外周血內Treg細胞的分布及腫瘤組織中 Foxp3 的表達進而影響其下游信號通路傳導相關。周波等[12]通過對胃癌 IV期患者的臨床研究發(fā)現參苓白術散能降低胃癌IV期患者外周血 CD4+CD25+Tregs[（28.87±8.54）%vs（10.12±4.32）%]。在該次研究中，兩組結直腸癌患者外周血CD4+ CD25+ CD127low/-Treg細胞占CD4+細胞比率在治療前后都存在部分患者上升、部分患者下降，總體Treg細胞比率較治療前下降（P<0.05）。這說明Treg細胞檢測在一定程度上能反應治療效果。研究中選取研究組與對照組患者在治療前外周血CD4+ CD25+ CD127low/-Treg細胞比率無明顯統(tǒng)計學差異，而研究組治療后的Treg細胞比率（4.28±1.23）%較對照組（5.03±1.21）%下降明顯（P<0.05）;研究組Treg細胞的抑制率（0.22±0.17）顯著高于對照組（0.09±0.13），有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。說明益氣溫陽方聯(lián)合化療對于結直腸癌患者外周血CD4+ CD25+ CD127low/-Treg細胞的抑制程度高于單純化療。通過降低結直腸癌患者外周血Treg細胞水平，調節(jié)腫瘤免疫逃逸微環(huán)境來抑制腫瘤生長轉移可能是益氣溫陽方扶正以抗癌的機制之一。臨床運用益氣溫陽法聯(lián)合化療能夠更好的提高患者的腫瘤免疫功能，提高其生存質量。因益氣溫陽法對腫瘤免疫逃逸的調節(jié)作用，將其與靶向治療相結合以提高靶向藥物療效并作用于臨床可能是未來的研究方向。

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（收稿日期：2019-01-21）