劉 翠 逄曉陽 張 維 劉 鷺 張書文 安 穎* 呂加平*

（1 黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司 北京100015 2 中國農業(yè)科學院農產品加工研究所 北京100193）

中醫(yī)普遍認為羊乳有益腸道健康， 例如，《本草綱目》記載羊乳“和小腸”、“利大腸”等，而對牛乳則無相關記載?，F(xiàn)代科學證明，羊乳中低聚半乳糖（GOS）的含量約是牛乳的10 倍[1]。 由于GOS 是一種益生元，所以羊乳中GOS 含量較高可能是其有益腸道健康的原因之一。

低聚半乳糖是一種水溶性膳食纖維， 能夠被雙歧桿菌等腸道益生菌利用， 從而促進腸道益生菌的生長。 GOS 被腸道益生菌發(fā)酵后產生的短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）， 包括乙酸、丙酸、丁酸等[2]，能夠降低直腸內容物的pH，從而抑制有害菌的生長。此外，SCFAs 還被證明能夠直接被腸道上皮細胞利用， 促進腸道上皮細胞的生長，并且能維持腸道屏障的完整性，降低病原體穿過腸道屏障進入人體[3-4]。 GOS 不僅能夠促進腸道益生菌的生長，還能維持腸道結構的完整。事實上，這一觀點被諸多臨床試驗結果所證實。 例如，服用GOS 后，腸道菌群中雙歧桿菌、乳桿菌等益生菌的豐度增高[5-6]，腸易激綜合征、炎癥性腸炎等腸道疾病癥狀被緩解或者改善[7]。雖然羊乳中GOS含量約為牛乳的10 倍， 并且GOS 能夠促進腸道益生菌的生長， 但是目前服用羊乳對腸道菌群的影響，尚缺乏直接的證據。由于腸道菌群失調與多種代謝綜合征及慢性病有關，如肥胖[8-9]、糖尿病[10-12]、炎癥性腸?。↖BD）[13-14]等，所以維持正常的腸道菌群正越來越受重視。研究羊乳對腸道菌群的影響，有助于將羊乳開發(fā)成促進腸道健康的營養(yǎng)產品。

本研究選取腸道菌群剛建立階段的4 周齡BAL B/c 小鼠作為研究載體， 通過為期30d 的羊全脂粉、牛全脂粉飲食干預，采取Illumina 高通量測序法分析小鼠盲腸內容物中的菌群， 觀察飼喂不同乳粉的小鼠腸道細菌豐度的差異， 并研究羊全脂乳粉和牛全脂乳粉對小鼠血液生理生化指標的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

4 周齡BAL B/c 小鼠30 只（雄性），初始平均體重為23 g±1.28 g（北京維通利華實驗動物技術有限公司， 小鼠合格證書編號：SCXK 京2014-0001）， 飼養(yǎng)于SPF 級動物房 （許可證號：SYXK（京）2013-0023）， 室溫22 ℃± 2 ℃， 相對濕度60%，飼喂實驗動物大（?。┦笊L飼料（A 級）（北京華阜康生物科技股份有限公司， 飼料許可證編號：SCXK（京）2014-0008），光照12 h/12 h 晝夜循環(huán)。

羊全脂乳粉來自陜西關山隴州乳業(yè)有限責任公司，牛全脂乳粉來自黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司。

1.2 試驗方法

選取腸道菌群剛建立階段的4 周齡BAL B/c小鼠， 預飼喂一周后將小鼠隨機分成3 組， 每組10 只。 試驗組包括羊全脂乳粉組（A）、牛全脂乳粉組（B）和對照組（C），分別采取如下試驗處理：

A 羊全脂乳粉組：普通飼料自由采食、飲水+羊全脂乳粉沖調乳灌胃；

B 牛全脂乳粉組：普通飼料自由采食、飲水+牛全脂乳粉沖調乳灌胃；

C 對照組：普通飼料自由采食、飲水。

灌胃劑量： 每次0.2 g 乳粉溶于0.5 mL 蒸餾水后灌胃，每天灌胃1 次。

每周監(jiān)測采食量、 飲水量和體重， 試驗周期30 d。 試驗最后一天小鼠眼底采血，分析血液指標（血紅蛋白、紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)、中性粒細胞（%）、淋巴細胞L（%）、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、尿素氮、肌酐、膽固醇、血糖、總蛋白、白蛋白、甘油三酯），最后解剖小鼠，收集盲腸內容物進行菌群分析。

1.2.1 基因組DNA 的提取 采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）方法對腸道內容物樣本的基因組DNA 進行提取，具體步驟如下[15-16]：

1）取盲腸內容物0.5 g 加入無菌生理鹽水2 mL，勻漿后12 000 r/min 高速離心5 min，徹底去除上清液；

2）加入50 μL TE 緩沖液，充分懸浮細菌；

3）加入60 μL 10% SDS 溶液，10 μL 20 mg/mL 蛋白酶K，溫和混勻，37 ℃溫育1 h；

4）加入100 μL 5 mol/L 的NaCl 溶液， 上下顛倒離心管十多次，充分混勻；

5）加入80 μL CTAB/NaCl 溶液， 溫和混勻，65 ℃下溫育10 min；

6）加入700 μL 氯仿/異戊醇，溫和混勻，12 000 r/min 高速離心2 min；

7）吸取上清至另一干凈離心管，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，上下顛倒混勻，12 000 r/min 高速離心2 min；

8）吸取上清至另一干凈離心管，加入2 倍體積冰冷的無水乙醇沉淀DNA，溫和混勻；

表1 PCR 反應體系及反應條件Table 1 The reaction system and conditions of PCR

9）離心（12 000 r/min，30 min，4 ℃），徹底去除上清；

10）用300 μL 70%預冷的乙醇洗滌沉淀，離心（12 000 r/min，15 min，4 ℃），棄上清，再離心幾秒，用移液器徹底除去酒精，風干；

11）沉淀溶于100 μL TE 溶液中，-20 ℃保存；

12）以紫外分光光度法檢測DNA 濃度， 并使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。

1.2.2 PCR 擴增 稀釋后的基因組DNA 為模板；根據測序區(qū)域的選擇， 使用帶Barcode 的特異引物；使用PhusionRHigh-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer（New England Biolabs）。 使用高效和高保真的酶進行PCR，確保擴增效率和準確性。16S rDNA，V4 區(qū)，大概長度200 bp（包括引物序列）， 正向引物 F （5’ -GATCCTACGGGAGGCAGCA-3’）， 反向引物R （5’-GCTTACCGCGGCTGCTGGC-3’），引物濃度0.5 μmol/L。 PCR 反應體系及反應條件[17-18]見表1。

1.2.3 PCR 產物的混樣和純化 PCR 產物使用2%質量分數(shù)瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；根據PCR產物濃度進行等濃度混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物，使用GeneJET 膠回收試劑盒（Thermo Scientific）回收產物。

1.2.4 文庫構建和上機測序 使用NEB NextRUltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina 建庫試劑盒（New England Biolabs）進行文庫的構建，構建好的文庫經過Qubit 定量和文庫檢測， 合格后，使用Hiseq2500，每個樣品單獨建庫測序。

1.2.5 血液指標檢測 血液生理生化指標主要分兩類：一類是用全自動血細胞分析儀（日本SYSMEX 希森美康2100）測定的，包括血紅蛋白、紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)、中性粒細胞、淋巴細胞；其余血清指標用全自動生化儀 （德國BECKMAN AU480）分析檢測。

血液學參數(shù)能反應飼喂乳粉后的小鼠各組織器官的功能狀態(tài)， 血液生理生化指標可反映出受試小鼠的營養(yǎng)滿足程度和新陳代謝狀況， 對監(jiān)測受試小鼠的健康狀況具有參考價值。 血紅蛋白對各種貧血的鑒別具有重要意義， 是分析貧血不可缺少的指標； 紅細胞總數(shù)的增減輔助監(jiān)測受試小鼠脫水或貧血癥狀；通過白細胞總數(shù)的測定，可判斷機體抵抗疾病的能力。 中性粒細胞具有吞噬外源入侵細菌的作用， 和淋巴細胞一樣參與機體的免疫反應，是評估機體免疫力的指標。

總蛋白是評估受試小鼠營養(yǎng)吸收、 判定營養(yǎng)不良的指標， 跟白蛋白指標共同指征肝臟功能狀況；血糖指標可以評估受試小鼠腸道對糖、碳水化合物的吸收利用程度。谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶是評估受試小鼠肝臟功能的指標，尿素氮、肌酐是評估受試小鼠腎臟功能的指標，膽固醇、甘油三酯是評估受試小鼠心血管健康程度的指標。

2 結果與分析

2.1 飼喂不同乳粉對小鼠采食、飲水以及增重的影響

灌胃乳粉的兩組小鼠采食量較正常對照組稍低（圖1a），可能是由于灌胃乳粉的小鼠其機體中一部分能量需求由乳粉提供， 從而減少了對小鼠飼料的攝入。 灌胃乳粉的兩組小鼠飲水量較正常對照組稍低（圖1b），可能是由于灌胃乳粉的過程中，已經給小鼠機體補充了部分水，從而減少了小鼠對飲用水的攝入。

圖1 采食量和飲水量監(jiān)測結果Fig.1 The result of feed intake and water drinking amount

對不同組小鼠的體重變動情況進行了統(tǒng)計監(jiān)測分析（表2）發(fā)現(xiàn)，飼喂羊全脂乳粉小鼠體重顯著低于對照組（P＜0.05）。 有研究通過動物模型研究指出， 乳中的乳清蛋白和鈣的攝入可以有效控制體重。 Belobrajdic D P 等[19]通過向大鼠膳食中添加乳清蛋白考察其對大鼠體重的影響， 研究發(fā)現(xiàn)，32%乳清蛋白攝入量可以減少10%的體重；Zemel M B 等[20]則指出，鈣的攝入可能抑制脂肪的生成、促進脂肪分解和氧化以及熱量的生成，從而抑制由飲食引起的體重增加。 羊乳中乳清蛋白和鈣的含量均高于牛乳，因此，可能導致攝入羊全脂乳粉的小鼠體重較牛全脂乳粉組低， 并顯著低于對照組。

表2 小鼠體重差異的比較Table 2 The comparison of weight difference in mice

2.2 飼喂不同乳粉對小鼠腸道菌群的影響結果

2.2.1 各組樣品中微生物種類和豐度比較（Heatmap 圖）為了直觀展示不同處理組間OTUs 情況， 對各處理組和OTUs 進行雙向二維聚類，繪制Heatmap（圖2），即可反映不同處理組小鼠腸道中各種菌群的整體情況， 顯示樣品菌群多樣性。由圖2 可以看出，羊全脂乳粉組較牛全脂乳粉組的梭狀菌屬和擬桿菌屬的數(shù)量低。

圖2 菌群分布熱圖Fig.2 The heatmap of the flora distribution

2.2.2 4 種菌群的豐度分析 對3 組小鼠腸道中乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、擬桿菌屬、梭菌屬4 種菌群進行了相對豐度分析，結果見圖3。

雖然羊乳GOS 的含量約為牛乳的10 倍，而且GOS 能夠促進雙歧桿菌和乳桿菌的生長，但本研究并沒有發(fā)現(xiàn)羊全脂乳粉組與牛全脂乳粉組腸道雙歧桿菌和乳桿菌豐度的顯著性差異， 甚至羊全脂乳粉組和牛全脂乳粉組小鼠腸道雙歧桿菌屬的豐度顯著性低于對照組（表3）。 其原因可能有多種：（1）本研究中羊乳的灌喂量不足以改變小鼠腸道菌群；（2）研究的對象為4 周齡非無菌小鼠，可能不是研究羊乳對小鼠腸道菌群影響的合適模型；（3）雖然高通量測序法能夠同時分析大量腸道菌群的豐度， 但其準確性很大程度上依賴提取后腸道菌群總DNA 的完整性，本研究中也確實存在部分小鼠腸道總DNA 提取后完整性較差，無法進行PCR 擴增的現(xiàn)象。

圖3 各組優(yōu)勢菌群的相對豐度分布圖Fig.3 The relative abundance of the dominant microflora

表3 不同組間菌群差異的比較（P 值）Table 3 The comparison of flora differences among different treatments （P value）

2.3 飼喂不同乳粉對小鼠常規(guī)血液指標的影響

本研究中各組小鼠血液常規(guī)指標除中性粒細胞數(shù)之外沒有顯著差異（表4），這表明各組小鼠營養(yǎng)狀況、免疫力基本沒有明顯差異。飼喂牛全脂乳粉的小鼠血液中中性粒細胞數(shù)顯著高于飼喂羊全脂乳粉組小鼠，與對照組相似，其原因還待深入研究。

表4 飼喂不同乳粉小鼠血液常規(guī)指標分析結果Table 4 The results of blood routine indexes of mice fed with different milk powder

本試驗對不同乳粉組小鼠血清指標進行了統(tǒng)計分析（表5），不同組小鼠血清中總蛋白、白蛋白、肌酐、尿素氮指標均沒有顯著性差異，但飼喂羊全脂乳粉的小鼠血糖水平顯著低于其他組。 明代的《本草綱目》即指出羊乳具有“治消渴（糖尿?。钡墓π?，現(xiàn)代科學研究對羊乳降血糖功效的直接研究較少，但是，有學者研究指出牛乳中的鈣可以調節(jié)胰島β 細胞內外鈣池中鈣離子的平衡，乳清蛋白富含亮氨酸可以直接調節(jié)胰島素的釋放， 共軛亞油酸通過增加骨骼肌的葡萄糖轉運蛋白活力等作用預防2 型糖尿病的發(fā)生[21]，羊乳中的鈣和乳清蛋白含量均高于牛乳。因此，羊全脂乳粉組小鼠血糖顯著低于其他組， 可能是由于羊乳對血糖有一定的影響。

通過血清膽固醇指標的分析（表5），發(fā)現(xiàn)所有飼喂乳粉的小鼠， 血清中膽固醇的水平均顯著低于對照組， 說明乳粉可能具有輔助降機體膽固醇的作用。 有報道稱[22]，乳中的乳清酸可以制止膽臟制造膽固醇， 從而降低血液中的總膽固醇量。Alférez M J 等[23]和López-Aliaga I 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，與牛乳相比， 羊乳可以降低小鼠血漿中的膽固醇水平。 Díaz-Castro J 等[25]研究表明飼喂羊乳的小鼠血漿中膽固醇和甘油三酯水平較飼喂牛乳的低。 這可能是由于羊乳中鏈甘油三酯（MCT）含量高于牛乳，MCT 可以減少內源性膽固醇的合成，并促進其在腸道內的吸收； 羊乳中單不飽和脂肪酸含量高于牛乳， 單不飽和脂肪酸可以使膳食中膽固醇通過膽汁更快的排除， 從而產生降膽固醇效果。

表5 飼喂不同乳粉小鼠血清指標統(tǒng)計分析結果Table 5 The statistical analysis results of serum indexes in mice fed with different milk powder

3 結論

在小鼠飼喂過程中發(fā)現(xiàn)， 兩全脂乳粉組小鼠的采食量和飲水量較對照組均稍有下降， 可能是由于乳粉灌胃時帶入了部分能量和水分。此外，羊全脂乳粉組體重稍低于牛全脂乳粉組小鼠， 并顯著低于對照組。

腸道菌群方面，飼喂牛全脂乳粉的小鼠，腸道中擬桿菌的豐度顯著高于飼喂羊全脂乳粉的小鼠； 飼喂羊全脂乳粉和牛全脂乳粉的小鼠腸道中乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的相對豐度沒有顯著差異；飼喂羊全脂乳粉的小鼠，腸道中梭狀菌屬的相對豐度顯著低于飼喂牛全脂乳粉的小鼠。

血液生理生化指標方面， 各試驗組僅在血糖和血清膽固醇方面存在差異，其中，飼喂羊全脂乳粉的小鼠， 血清中血糖含量顯著低于飼喂牛全脂乳粉組。兩組試驗組與對照組相比，血清中膽固醇的水平均顯著低于對照組， 說明乳粉可能具有輔助降機體膽固醇的作用。 羊乳降血糖和降膽固醇的作用機制尚需要進一步試驗證實。