張 強(qiáng),袁旭東,卞文治,霍 昱,吳麗莎,張旭鵬,周維婧
(長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春130022)
隨著環(huán)境污染和能源危機(jī)的日益加劇,燃料酒精的生產(chǎn)引起了人們極大的興趣[1-2]。世界各國(guó)都在努力發(fā)展燃料酒精項(xiàng)目,但目前燃料酒精生產(chǎn)成本較高,缺乏有效的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力,因此降低生產(chǎn)成本對(duì)于燃料酒精工業(yè)發(fā)展具有重要的意義[3]。
提高發(fā)酵液中的酒精濃度是目前酒精行業(yè)主要的創(chuàng)新方法。濃醪酒精發(fā)酵技術(shù)具有提高發(fā)酵終點(diǎn)酒精濃度,降低能耗,節(jié)約工藝用水及蒸汽用量,縮短發(fā)酵周期等優(yōu)勢(shì),可實(shí)現(xiàn)高細(xì)胞密度、高產(chǎn)物濃度和高速率發(fā)酵,從而有效降低酒精生產(chǎn)中的各項(xiàng)費(fèi)用,因此濃醪酒精發(fā)酵技術(shù)一直是酒精行業(yè)重要的研究方向[4]。目前濃醪酒精發(fā)酵中對(duì)高耐性釀酒酵母研究較多,而對(duì)發(fā)酵工藝研究相對(duì)較少。研究表明,濃醪酒精發(fā)酵過(guò)程中主要由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏,而不是酒精的積累導(dǎo)致酵母發(fā)酵活性的降低。另外,高底物濃度會(huì)導(dǎo)致高滲透壓和低水活性,而高滲透壓則會(huì)抑制酵母生產(chǎn)的酒精向培養(yǎng)基中擴(kuò)散,從而造成對(duì)酵母細(xì)胞的毒害作用。因此在濃醪酒精發(fā)酵條件下,加入適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì),有助于增強(qiáng)酵母的活性,提高發(fā)酵液中酒精濃度[5-6]。
本試驗(yàn)采用釀酒酵母對(duì)玉米濃醪酒精發(fā)酵工藝進(jìn)行研究。通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)確定適宜的料水比、糖化酶以及蛋白酶添加量,同時(shí)研究了營(yíng)養(yǎng)物甘氨酸、脯氨酸以及肌醇對(duì)酒精發(fā)酵的影響。
菌種:活性釀酒干酵母(ADY),酒用耐高溫型,湖北安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)。
酶制劑:糖化酶(100000U/g),蛋白酶(100000U/g),北京奧博星生物技術(shù)有限公司提供。
1.2.1 酒精發(fā)酵試驗(yàn)
稱取100 g玉米粉,加入適量的糖化酶、蛋白酶和酵母,按比例與自來(lái)水均勻混合于500 mL的三角瓶中,塞上發(fā)酵栓,放入振蕩培養(yǎng)箱內(nèi),30℃進(jìn)行發(fā)酵。
1.2.2 還原糖含量測(cè)定
還原糖采用DNS法測(cè)定。
1.2.3 酒精濃度測(cè)定
準(zhǔn)確量取紗布過(guò)濾或離心(300 r/min)的清液樣品100 mL于500 mL蒸餾瓶中,加入100 mL蒸餾水,緩慢加熱蒸餾(沸騰后蒸餾時(shí)間應(yīng)控制在30~40 min內(nèi)),收集100 mL餾出液于100 mL容量瓶中,采用酒精計(jì)測(cè)定酒精濃度。
水是重要的反應(yīng)物,沒(méi)有足夠的水參與反應(yīng),會(huì)使發(fā)酵反應(yīng)不徹底。另外醪液濃度大小直接影響到基質(zhì)中酶及酵母的代謝活性,最終影響酒精的濃度[7]。將玉米粉按料水比1∶1.6、1∶1.8、1∶2.0、1∶2.2、1∶2.4進(jìn)行充分混合,加入活化后的酵母,測(cè)定醪液中的酒精濃度和殘?zhí)?,結(jié)果如圖1所示。
圖1 不同料水比對(duì)酒精發(fā)酵的影響
從圖1可以看出,料水比對(duì)酒精發(fā)酵的影響非常明顯。外加的水較多,則底物的濃度相對(duì)較低,產(chǎn)生的酒精濃度也較低,同時(shí)對(duì)后期酒精蒸餾產(chǎn)生影響,增加能耗以及產(chǎn)生大量的酒精廢液。外加水較少,則反應(yīng)很難進(jìn)行或者產(chǎn)生的酒精濃度較高,高濃度酒精會(huì)對(duì)酵母菌產(chǎn)生毒害作用。從圖1可知,當(dāng)料水比為1∶1.6時(shí),不但酒精濃度較低,而且殘?zhí)菨舛纫草^高。而料水比為1∶2.4時(shí),酒精濃度較低,不經(jīng)濟(jì)。因此當(dāng)料水比在1∶1.8至1∶2.2時(shí),酒精濃度較高,殘?zhí)禽^低,適合酒精發(fā)酵。
發(fā)酵過(guò)程中糖化酶添加量的多少直接影響到發(fā)酵的結(jié)果,通過(guò)添加適量的糖化酶,可使糖化和發(fā)酵同步,使發(fā)酵液中還原糖始終處于較低水平,從而有利于提高發(fā)酵液中的酒精濃度[8]。以糖化酶添加量分別為0 U/g、50 U/g、100 U/g、150 U/g、200 U/g、250 U/g,活性干酵母接種量為0.2%,料水比1∶2的發(fā)酵工藝,考察了糖化酶添加量對(duì)酒精得率的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2。
圖2 糖化酶添加量對(duì)酒精發(fā)酵的影響
由圖2可知,由于采用同步糖化發(fā)酵模式,在糖化酶作用下,生成的還原糖不斷被菌體利用,酒精生成量不斷增多。但隨著糖化酶添加量增大,酒精產(chǎn)量反而有所降低,可能由于糖化產(chǎn)生的葡萄糖速度較快,沒(méi)有完全被菌體利用產(chǎn)生酒精,而生成了一些其他副產(chǎn)物。另外高糖濃度具有高滲作用,也會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)代謝,影響酒精產(chǎn)量[9]。當(dāng)糖化酶添加量為50~150 U/g(原料)時(shí),酒精濃度較高,發(fā)酵結(jié)束時(shí)還原糖濃度也處于較低水平,表明糖化作用與菌體代謝作用相協(xié)調(diào),從而獲得了較高的酒精濃度。
在酒精發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中,大多數(shù)糖化醪中氮源含量低,酵母菌無(wú)法較好的生長(zhǎng),所以必須額外添加氮源。添加蛋白酶可以釋放出容易被酵母利用的氨基酸,提高酵母的發(fā)酵活力。另外可降低發(fā)酵液的黏度,有利于發(fā)酵順利進(jìn)行[10]。選用蛋白酶添加量分別為0 U/g、50 U/g、100 U/g、150 U/g、200 U/g、250 U/g,活性干酵母接種量為0.2%,料水比1∶2,糖化酶添加量100 U/g的發(fā)酵工藝,考察了蛋白酶添加量對(duì)酒精得率的影響,結(jié)果見(jiàn)圖3。
圖3 蛋白酶添加量對(duì)酒精發(fā)酵的影響
由圖3可知,過(guò)高的蛋白酶添加量,往往不利于酒精發(fā)酵,反而導(dǎo)致酒精濃度有所降低,可能由于豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)引起菌體過(guò)快生長(zhǎng),從而不利于酒精形成。當(dāng)?shù)鞍酌柑砑恿繛?00~200 U/g(原料)時(shí),獲得了較高的酒精濃度。
在糖化酶、料水比以及蛋白酶單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取糖化酶添加量、料水比以及蛋白酶添加量3個(gè)因素,每個(gè)因素選擇3個(gè)水平(見(jiàn)表1),以發(fā)酵液中酒精濃度作為考察指標(biāo),正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。
表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表
表2 正交試驗(yàn)結(jié)果
由正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析可知,極差越大,表明該因素對(duì)酒精濃度的影響越大,該因素越重要。因此,糖化酶添加量>料水比>蛋白酶添加量。另外從表3的方差結(jié)果分析可知,在所考察的3個(gè)變量中,糖化酶添加量對(duì)酒精發(fā)酵的影響最為顯著,料水比以及蛋白酶添加量次之。
表3 方差分析
綜合以上各因素,玉米濃醪酒精發(fā)酵過(guò)程中,以糖化酶添加量為100 U/g(原料),料水比為1∶2,蛋白酶添加量為150 U/g(原料)為最佳工藝條件。按上述工藝條件,進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn),最終酒精濃度為16.8%vol。
Casey[11]認(rèn)為,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是酵母菌生長(zhǎng)及代謝的重要物質(zhì),如果能夠滿足菌體的營(yíng)養(yǎng)需要,可促進(jìn)酒精發(fā)酵速度和增加酒精濃度。培養(yǎng)基是酵母菌營(yíng)養(yǎng)和能量的來(lái)源,在發(fā)酵過(guò)程中起著非常重要的作用[12-13]。大量研究發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)基中加入適量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),如甘氨酸、脯氨酸和肌醇等,都可以有效提高酵母菌產(chǎn)酒精能力[14-15](圖4、圖5、圖6)。
圖4 甘氨酸濃度對(duì)酒精發(fā)酵的影響
圖5 脯氨酸濃度對(duì)酒精發(fā)酵的影響
圖6 肌醇濃度對(duì)酒精發(fā)酵的影響
由圖4、圖5、圖6可知,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)甘氨酸、脯氨酸和肌醇都能有效提高菌體酒精耐受性能,從而提高酒精產(chǎn)量。當(dāng)甘氨酸添加濃度為2 g/L,脯氨酸添加濃度為3 g/L,肌醇添加濃度為4 g/L時(shí),發(fā)酵終點(diǎn)酒精濃度最高,分別為17.7%vol、17.5%vol和17.4%vol,且均高于空白對(duì)照組。但甘氨酸的促進(jìn)作用強(qiáng)于脯氨酸和肌醇。而當(dāng)甘氨酸、脯氨酸及肌醇添加濃度分別偏離2 g/L、3 g/L和4 g/L最適濃度時(shí),發(fā)酵酒精濃度明顯下降。
經(jīng)過(guò)上述實(shí)驗(yàn),可以初步得到如下結(jié)論:添加適量的糖化酶和蛋白酶以及適宜的料水比可以有效提高發(fā)酵液酒精濃度,實(shí)現(xiàn)濃醪發(fā)酵。當(dāng)糖化酶和蛋白酶添加量分別為100 U/g(原料)和150 U/g(原料),料水比為1∶2時(shí),酒精濃度達(dá)到16.8%vol。
另外,添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)甘氨酸、脯氨酸以及肌醇都能有效提高酒精濃度,但甘氨酸添加效果優(yōu)于脯氨酸和肌醇。當(dāng)甘氨酸添加濃度為2 g/L時(shí),發(fā)酵液酒精濃度達(dá)到17.7%vol。發(fā)酵過(guò)程中,甘氨酸和脯氨酸由于結(jié)構(gòu)的特殊性,通常不是作為酵母生長(zhǎng)的氮源,主要作為酵母的滲透壓保護(hù)劑。肌醇是磷脂的重要組分,而磷脂又是細(xì)胞膜的最重要成分,所以肌醇在提高酵母酒精耐受性方面起著重要的作用。