王 戎，廖勤儉，安明哲，李楊華，周韓玲，王小琴

(宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓644007)

酚酸是一類含有酚環(huán)的有機酸，其苯環(huán)上帶有多個-OH以及-COOH，表現(xiàn)出廣泛的生理活性，如抗氧化、清除自由基、抗紫外線輻射、抑菌效應(yīng)，在醫(yī)藥、化妝品原料和食品添加劑等方面有著廣泛用途[1]。酚酸酯，是酚酸的-COOH親水端消失，與醇的-OH端脫水酯化而成的一類化合物，極性變?nèi)?，親酯性變強，更容易深入生物膜脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)中發(fā)揮抗氧化作用，在食品加工、化妝品行業(yè)具有更廣泛的應(yīng)用[1]。

白酒釀造的原輔材料本身存在一些酚酸類物質(zhì)，釀酒過程中，原輔材料在各酶系、微生物的作用下也會生成一些酚酸及酚酸酯，這些具有生物活性的物質(zhì)經(jīng)長時間的釀造過程、獨特的蒸餾過程進入酒體，使得白酒產(chǎn)品中也具有一定濃度的該類活性物質(zhì)。分析白酒中所含有的酚酸及酚酸酯類活性物質(zhì)，明確其種類和含量，有利于提升白酒的品質(zhì)，并有助于對白酒的質(zhì)量進行有效監(jiān)控。

目前，文獻報道對于酚酸的分析檢測方法主要有薄層色譜法[2]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）[3]、反向液相色譜法[4]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LCMS/MS）[5-7]等。由于白酒成分極其復雜，酚酸及酚酸酯類化合物在白酒中的含量低，檢測難度較大。而且，酚酸本身含有較多-OH和-COOH，使得它們具有極性強、柱保留弱的特點，而酚酸酯的極性相對較弱，柱保留較強，所以，要同時分離并檢測這兩類化合物的難度就更大。HLB小柱對這兩類親水疏水性質(zhì)不同的化合物均具有一定的柱保留；相反，如果采用其他類型的固相萃取小柱（如C18小柱）進行預處理，樣品中部分酚酸無法保留在小柱上，難以實現(xiàn)準確檢測。由此，筆者采用固相萃取小柱（HLB小柱），結(jié)合高分辨的液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜（LC-QTOF），能準確定量分析白酒中的10種酚酸及酚酸酯類化合物，同時利用酚酸及酚酸酯類化合物的質(zhì)譜特征離子，可以為定性研究白酒中存在的更多改性酚酸類化合物提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

耗材及試劑：沒食子酸（J&K,99%）、阿魏酸（J&K,99%）、香草酸（J&K,99%）、丁香酸（TGI,純度≥97%）、芥子酸（J&K,98%）、咖啡酸（J&K,99%）、原兒茶酸（J&K,99%）、沒食子酸乙酯（J&K,98%）、香草酸乙酯（J&K,98%）、阿魏酸乙酯（J&K,97%），甲醇（MERCK,LC-MS級），超純水，白酒樣品（實驗室自備）。

儀器設(shè)備：美國Agilent公司1290系列高效液相色譜儀(HPLC)-6520B系列質(zhì)譜檢測器（QTOF），Agilent MassHunter數(shù)據(jù)采集工作軟件、定性定量分析軟件，Reeko公司高通量全自動固相萃取儀（Fotector Plus），Reeko公司全自動氮吹儀（Atuo EVA），Milli-Q超純水機（美國Mimpore公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18(2.1×100 mm 1.8-micron)；柱溫，30 ℃；流速，0.2 mL/min；進樣量，2 μL；流動相為甲醇B（液質(zhì)級）和超純水A（含0.1 g/L甲酸）。梯度洗脫條件：0～15 min，5%～100%B；15.1 min～17 min，100%B；17.1～19 min，5%B；20 min，stop。

1.2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧電離源(DESI)，負離子模式掃描，離子源溫度為325℃，干燥氣流量為10 L/min，霧化器壓力為40 psig，碰撞電壓為110 V。

1.2.3 酚酸及酚酸酯標準溶液配制

分別準確稱取10種酚酸及酚酸酯標準品各10mg，用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成100 mg/L的各酚酸及酚酸酯標準儲備液，在-20℃保存。酚酸混合標準工作液采用梯度稀釋法，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.4 樣品前處理

白酒樣品10 mL，于80℃蒸發(fā)濃縮至2 mL，用超純水稀釋至10 mL，上樣經(jīng)甲醇活化的HLB小柱，0.1 g/L甲酸水淋洗，90%甲醇水溶液洗脫，甲醇水洗脫液經(jīng)氮氣吹干，1 mL甲醇溶解，作為待測樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

由于酚酸類物質(zhì)本身含有-OH、-COOH基團，使得它們具有極性強、柱保留弱的特點。方法考察了流動相水相中加甲酸與不加甲酸，以及添加甲酸量對分析結(jié)果的影響。流動水相中不添加甲酸，出峰時間靠前的幾個化合物，出現(xiàn)峰寬，峰拖尾，且難于分離的情況，詳見圖1；流動相水相中甲酸含量為1.5 g/L時，目標化合物響應(yīng)明顯降低，特別是極性較弱的酚酸酯，如阿魏酸乙酯無響應(yīng)，詳見圖2。經(jīng)過反復考察，確定采用甲醇-水作為流動相，且水相中添加0.1 g/L甲酸為最佳，不僅可以延長酚酸類物質(zhì)的柱保留，實現(xiàn)幾種化合物的良好分離，又不至于造成質(zhì)譜負模式檢測條件下儀器噪音基線過高，檢測靈敏度降低等問題，詳見圖3。各目標物的出峰時間及M/Z見表1。

2.2 前處理條件優(yōu)化

圖1 不添加甲酸的對照品色譜圖

圖2 添加1.5 g/L甲酸的對照品色譜圖

圖3 添加0.1 g/L甲酸的對照品色譜圖

白酒產(chǎn)品中，強極性有機酸和糖與酚酸出峰時間比較靠近，如果將樣品濃縮后直接進樣檢測，對樣品中酚酸的檢測干擾非常大，所以必須除去樣品中的強極性有機酸和糖類物質(zhì)。經(jīng)過考察，選擇HLB固相萃取小柱對白酒產(chǎn)品進行預處理。上樣HLB小柱后，強極性酸、糖類物質(zhì)經(jīng)由甲酸水淋洗除去，此時所要檢測的目標化合物酚酸及酚酸酯仍保留在小柱上，再經(jīng)由甲醇洗脫下來，實現(xiàn)樣品中目標化合物與雜質(zhì)的分離，避免檢測過程中雜質(zhì)的干擾，詳見圖4。未經(jīng)HLB處理的白酒10倍濃縮樣品，2～5 min之間均被不可分離的乳酸等覆蓋，嚴重影響目標物的檢測結(jié)果，詳見圖5。

圖4 樣品HLB前處理總離子流圖

圖5 樣品未經(jīng)HLB前處理總離子流圖

2.3 方法學考察

2.3.1 線性方程、檢測限和精密度

精密吸取1.2.3的標準儲備液，用70%甲醇稀釋標準儲備液，分別配制成濃度為20 μg/L、80 μg/L、400 μg/L、800 μg/L、1500 μg/L、2000 μg/L 的標準溶液，并進樣LC-QTOF聯(lián)用儀。以標準對照品的峰面積（Y）對相應(yīng)濃度（X）進行線性回歸，得到回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)。各化合物信噪比S/N=10時對應(yīng)的濃度為定量檢測限（LOD）。結(jié)果列于表1。

2.3.2 加標回收率

白酒樣品3份，各10 mL，其中的2份分別加入酚酸標準溶液 100 μg/L和800 μg/L，按照1.2.4方法處理后作為加標回收率待測樣品，考察方法的加標回收率。取加標100 μg/L的加標回收率待測樣品，在1 d內(nèi)連續(xù)進樣6次，計算10種目標化合物峰面積的RSD，考察方法的重復性、穩(wěn)定性。結(jié)果表明，儀器精密度良好，詳見表2。

表1 目標化合物的出峰時間、質(zhì)荷比、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限

表2 目標化合物的回收率和精密度

3 結(jié)論

本研究通過固相萃取小柱(HLB小柱)技術(shù)進行白酒樣品前處理，能有效地除去白酒中強極性的酸類、糖類物質(zhì)，實現(xiàn)樣品中目標化合物與雜質(zhì)的分離，避免檢測過程中雜質(zhì)的干擾。結(jié)合液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用(LC-QTOF)方法，在水相流動相中適當?shù)奶砑?.1 g/L的甲酸，能有效地分離10種酚酸及酚酸酯類化合物，以目標化合物的質(zhì)荷比、結(jié)合出峰時間進行定性定量分析，方法靈敏度顯著提高，同時可以降低基質(zhì)干擾和信噪比，測定結(jié)果更加準確可靠。本研究建立的白酒中酚酸及酚酸酯類化合物的檢測方法，10種化合物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均不低于0.994，回收率在88.7%～99.7%之間，RSD均小于1.3%。該方法穩(wěn)定性好、靈敏度高，可以為白酒中其他生物活性成分的開發(fā)提供技術(shù)支持。

喻麗紅等[8]研究阿魏酸乙酯對胃癌SGC-7901細胞增殖及凋亡的影響結(jié)果表明，阿魏酸乙酯能有效抑制SGC-7901細胞增殖，并能誘導SGC-7901細胞凋亡，兩種作用均呈現(xiàn)對濃度和時間有依賴性。王汝濤等[9]對阿魏酸乙酯的藥理活性及其機制研究中發(fā)現(xiàn)，阿魏酸乙酯抑制由ADP誘導的血小板聚集作用比阿魏酸強；阿魏酸乙酯對CCb引起的小鼠急性肝損傷有明顯的保護作用，其作用強于阿魏酸；阿魏酸乙酯具有保護血管內(nèi)皮細胞，減輕過氧化氫損傷的作用。閆軍等[10]通過研究咖啡酸、阿魏酸和香草酸對酪氨酸酶活性的影響，尋找酪氨酸酶抑制劑，從而為治療色素增加性皮膚病篩選藥物，試驗結(jié)果表明，香草酸為良好的混合型酪氨酸酶抑制劑。從表2可看出，所檢測白酒樣品中香草酸和阿魏酸乙酯的含量相對較高，在80～100 μg/L之間，原兒茶酸、阿魏酸、丁香酸和香草酸乙酯的含量在10～30 μg/L之間。由此可見，所檢測白酒樣品中存在具有藥理活性的香草酸、阿魏酸等酚酸類化合物，且這些酚酸類化合物在白酒的酸性環(huán)境下易與乙醇自然酯化而成藥理活性更高的阿魏酸乙酯等酯類化合物。