彭 林，金建順，傅祖康，唐雅鳳，毛 健

（1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工程與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.會稽山紹興酒股份有限公司，浙江紹興312000）

黃酒是我國傳統(tǒng)釀造酒之一，具有口感醇厚、香氣濃郁、營養(yǎng)豐富的特點(diǎn)，由于其悠久的歷史文化積淀，已成為我國消費(fèi)酒類的重要組成部分。黃酒的釀造是以谷物為原料，利用發(fā)酵原料和環(huán)境中的微生物資源進(jìn)行的半固態(tài)雙邊發(fā)酵，發(fā)酵過程中酵母產(chǎn)酒和多種產(chǎn)酶微生物進(jìn)行的淀粉糖化共同進(jìn)行，從而賦予黃酒獨(dú)特的風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值。近年來，隨著國內(nèi)消費(fèi)水平的不斷提高，市場銷售的酒類逐年遞增，消費(fèi)者飲用酒類的選擇也逐漸豐富。隨著消費(fèi)人群健康意識的增強(qiáng)，消費(fèi)者選擇消費(fèi)酒類時(shí)除考慮品牌因素外，飲用過程中和飲用后的舒適度成為衡量和評價(jià)酒類的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。在國內(nèi)主要的消費(fèi)酒類中，黃酒在近年來的銷售額雖然有所提高，但所占市場份額卻逐年降低，其中一個(gè)重要的因素就是黃酒飲用后的上頭問題。所謂上頭，是指飲酒后出現(xiàn)頭部神經(jīng)痛，或面紅耳赤、頭暈心跳、惡心嘔吐等現(xiàn)象。由于黃酒釀造微生物和生產(chǎn)工藝的復(fù)雜性，目前黃酒的生產(chǎn)過程主要依賴于操作工人的豐富經(jīng)驗(yàn)，而缺少導(dǎo)致黃酒上頭問題的物質(zhì)基礎(chǔ)和相關(guān)機(jī)理的科學(xué)認(rèn)識，也為從工藝調(diào)控角度控制黃酒上頭形成了障礙。這些問題的存在直接影響了黃酒產(chǎn)業(yè)提高市場份額和進(jìn)一步發(fā)展。

在黃酒的釀造工藝中，經(jīng)酵母和多種微生物發(fā)酵后的半固態(tài)原料經(jīng)壓榨、過濾、煎酒最終得到黃酒。黃酒的釀造特點(diǎn)一方面使較多原料來源和微生物發(fā)酵來源的營養(yǎng)和功能物質(zhì)保留在黃酒中，賦予了黃酒營養(yǎng)功能豐富的優(yōu)點(diǎn)，但另一方面也使較多的上頭物質(zhì)保留于酒中。倪莉[1]在總結(jié)黃酒飲后上頭的原因時(shí)認(rèn)為，導(dǎo)致黃酒飲后上頭的物質(zhì)主要包括幾大類：酒精、雜醇油（高級醇）、醛類物質(zhì)和酸酯不平衡。此外，黃酒中存在的生物胺類物質(zhì)具有一定的生理副作用，其中部分不適癥狀如偏頭疼，與飲后上頭也有直接的聯(lián)系。生物胺中組胺與飲酒上頭密切相關(guān)的是引發(fā)的頭痛，組胺攝入引起的頭痛癥狀屬于血管收縮性頭痛，主要是由于攝入組胺刺激內(nèi)皮細(xì)胞過量釋放信號分子NO，導(dǎo)致顱內(nèi)動(dòng)脈的血管收縮，最終造成頭痛[2-3]。酪胺的攝入會引起血管收縮，從而導(dǎo)致飲食誘導(dǎo)的偏頭痛、嘔吐、呼吸困難并提高血壓血糖[4-5]，其中酪胺導(dǎo)致的血壓增高會進(jìn)一步誘發(fā)心力衰竭和腦出血[6]。相比其他生物胺，尸胺和腐胺具有較低的毒副作用[7]，但其存在主要通過抑制組胺和酪胺的代謝酶，如抑制單氨基氧化酶MAO和二胺氧化酶DAO的活性，從而增強(qiáng)組胺和酪胺的毒副作用[8-9]。醛類物質(zhì)中，由于乙醛的強(qiáng)致癌性使其被美國環(huán)境保護(hù)署（U.S.EPA）列為B2級致癌物[10]。同時(shí)，飲酒后人體會將乙醇代謝為乙醛，并且酒中會有不同含量的乙醛隨酒一同進(jìn)入人體，人體內(nèi)升高的乙醛含量會導(dǎo)致多種不良癥狀，包括降低血壓、心跳和呼吸急促、口和喉部干渴、頭疼等[11]，同時(shí)在人體內(nèi)乙醛含量的提高與宿醉后的頭疼、嘔吐反應(yīng)有直接聯(lián)系，這些癥狀可能與乙醛濃度的提高導(dǎo)致提高了組胺的釋放[12]有關(guān)，從而加強(qiáng)了組胺攝入的相關(guān)不良癥狀及過敏反應(yīng)。

目前，針對黃酒飲后上頭問題的認(rèn)識，參考借鑒白酒和啤酒的相關(guān)研究和成果，已經(jīng)在可能導(dǎo)致上頭的物質(zhì)方面具有了一定的認(rèn)知。但是，黃酒發(fā)酵技術(shù)和工藝的特點(diǎn)與白酒和啤酒差異較大，不具備直接借鑒的實(shí)際價(jià)值，同時(shí)其他酒類的相關(guān)調(diào)控策略和技術(shù)也無法直接應(yīng)用于黃酒。因此，本文基于之前工作中對黃酒中不同物質(zhì)含量范圍檢測后，通過在SD大鼠模型中考察生物胺、高級醇和醛類物質(zhì)代謝情況，了解黃酒所含物質(zhì)中的代謝速度情況，通過比較代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)確定黃酒中代謝較慢的物質(zhì)，為進(jìn)一步明確影響黃酒舒適度及其作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

實(shí)驗(yàn)用鼠：藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究選擇成年健康的SD大鼠，雌雄各半，體重為200 g左右，年齡6～8周，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號SCXK（滬）2007-0005。

試劑：藥代動(dòng)力學(xué)研究中所用組胺、酪胺、尸胺、腐胺、苯乙醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇、乙醛和5-羥甲基糠醛（5-HMF）和乙醇均為色譜級試劑，購自Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)中的給藥量按成人體重60 kg飲用2瓶黃酒，根據(jù)黃酒中各物質(zhì)濃度，計(jì)算成人每kg體重?cái)z入物質(zhì)的含量，計(jì)算后各物質(zhì)的給藥量見表1。所有研究物質(zhì)均用15%vol乙醇溶液溶解配制。除所有10種物質(zhì)單獨(dú)給藥外，本項(xiàng)目為模擬黃酒中各物質(zhì)的代謝速度和對乙醇代謝的影響，設(shè)置混合組進(jìn)行給藥，即將4種生物胺、4種高級醇和2種醛類物質(zhì)同時(shí)溶解于15%vol溶液中，采用單次口服灌胃的給藥方法進(jìn)行給藥。

1.2.2 SD大鼠單次口服灌胃給藥、取血和血樣處理

表1 SD大鼠模型中生物胺、高級醇和醛類物質(zhì)的給藥量

根據(jù)給藥物質(zhì)不同，分別將SD大鼠分為空白組、乙醇組和加藥組，其中加藥組為分別含有10種藥物的15%vol乙醇溶液，配制濃度見表1。將7 d適應(yīng)性培養(yǎng)的SD大鼠隨機(jī)分組，每組5只大鼠，對所有大鼠進(jìn)行頸動(dòng)脈插管手術(shù)，以便于同一只大鼠連續(xù)取血。將配制試劑按大鼠體重10 mL/kg口服灌胃給藥，給藥前SD大鼠禁食12 h。

大鼠取血時(shí)間為給藥前0 h和給藥后2 h、4 h、6 h、12 h、24 h，每只大鼠連續(xù)取血樣200 μL，分別進(jìn)行標(biāo)號后于4℃、3000 r/min離心10 min，置于-20℃冰箱中保存血清樣品待測。

1.2.3 HPLC法檢測血清中生物胺的含量

樣品衍生化：血清中的生物胺首先利用丹磺酰氯進(jìn)行衍生化，條件為：0.1 mL血清分別加入1 mL飽和碳酸氫鈉、100 μL氫氧化鈉和1 mL的10 mg/mL丹磺酰氯溶液，漩渦振蕩混勻1 min后60℃衍生15 min，加入100 μL谷氨酸鈉以60℃反應(yīng)15 min，加入1 mL水渦旋1 min、40℃水浴除去丙酮，加入0.5 g氯化鈉和5 mL乙醚，取有機(jī)相在40℃氮?dú)獯蹈?。加? mL乙腈，過0.45 μm有機(jī)濾膜，用于液相檢測。

色譜條件：HPLC為安捷倫1100高效液相色譜，所用色譜柱為C18反向色譜柱。樣品檢測中，上樣量為10 μL，流動(dòng)相A：90%乙腈（含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸銨）；流動(dòng)相B：10%乙腈（含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸銨），流速1.0 mL/min，檢測柱溫度35℃，檢測波長254 nm。樣品中組胺、酪胺、尸胺、腐胺含量利用標(biāo)品峰面積繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4 HPLC法檢測血清中高級醇含量

樣品處理：取血清樣品50 μL，置于1.5 mL離心管中，加50 μL內(nèi)標(biāo) 0.1 mg/mL甘油，5 μL衍生化試劑對甲苯磺酰異氰酸酯TSIC 2 g/mL，室溫下衍生化2 min。加5 μL水，加140 μL乙腈，離心取上清液，過0.45 μm有機(jī)濾膜，用于液相檢測。

色譜條件：HPLC為安捷倫1100高效液相色譜，所用色譜柱為C18反向色譜柱。樣品檢測中，上樣量為10 μL，流動(dòng)相：35%乙腈+65%磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L磷酸二氫鉀，磷酸調(diào)pH值到2.5），流速1.0 mL/min，檢測柱溫度25℃，檢測波長為227 nm。樣品中苯乙醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇和乙醇含量利用標(biāo)品峰面積繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。

1.2.5 HPLC法檢測血清中醛類物質(zhì)的含量

樣品處理：（1）乙醛：取樣50 μL，置于1.5 mL離心管中，補(bǔ)加緩沖液至250 μL，再用2,4-二硝基苯肼定容到0.5 mL，蓋緊蓋子混勻，60℃水浴加熱1 h，冷卻至室溫取出。提取液以4600 r/min離心10 min取上清液，過0.45 μm有機(jī)濾膜，用于液相檢測；（2）5-HMF：50 μL樣品加50 μL草酸溶液混合均勻，沸水浴中加熱25 min，冷卻至室溫。將試管中溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL試管瓶中，用0.1 mL甲醇分3次洗滌。加入0.03 mL亞鐵氰化鉀溶液（92 g/L）和0.3 mL乙酸鋅（183 g/L）溶液，搖勻后靜置15 min，加甲醇補(bǔ)足0.5 mL。過0.45 μm濾膜上樣測定。

色譜條件：HPLC為安捷倫1100高效液相色譜，所用色譜柱為C18反向色譜柱。樣品檢測中，上樣量為10 μL，流動(dòng)相：90%水+10%甲醇，流速1.0 mL/min，其中乙醛檢測柱溫度40℃、檢測波長360 nm，5-HMF檢測柱溫度25℃、檢測波長280 nm。樣品中乙醛和5-HMF含量利用標(biāo)品峰面積繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

藥代動(dòng)力學(xué)中的血藥濃度-時(shí)間曲線，結(jié)果表現(xiàn)為每組5個(gè)平行樣品的平均值±方差，利用GraphPrism 7.0繪制。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算利用DAS 2.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

為研究生物胺、高級醇和醛類物質(zhì)在SD大鼠體內(nèi)的吸收、分布和消除特性，找出黃酒中代謝速度較慢的物質(zhì)，從而確定影響黃酒飲后舒適度的可能物質(zhì)，本項(xiàng)目在SD大鼠模型中通過單次口服給藥的方式，將組胺、酪胺、尸胺、腐胺、苯乙醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇、乙醛和5-羥甲基糠醛（5-HMF）分別給藥后，檢測給藥后SD大鼠血液中各物質(zhì)濃度的變化，并通過分析處理得到藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，通過參數(shù)的比較分析各物質(zhì)間的代謝差異。藥物進(jìn)入體內(nèi)后，主要經(jīng)過吸收、分布和消除3個(gè)過程。在口服給藥模式下，藥物首先經(jīng)過胃后由小腸吸收，經(jīng)血液轉(zhuǎn)運(yùn)入肝臟并進(jìn)行初步代謝后進(jìn)入全身血液。血液將轉(zhuǎn)運(yùn)的藥物運(yùn)至全身各組織器官中，相應(yīng)藥物在特定組織器官中結(jié)合并開始消除過程，最終使血液中藥物濃度逐漸降低并最終清除。

2.1 SD大鼠口服生物胺的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

為模擬黃酒中多種物質(zhì)同時(shí)攝入后對單一物質(zhì)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響，本研究在試驗(yàn)中設(shè)立混合組作為黃酒模擬組，考察同時(shí)攝入10種物質(zhì)后對物質(zhì)代謝的影響。數(shù)據(jù)經(jīng)處理后，計(jì)算得出的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)列于表2。結(jié)果表明，與單一生物胺口服給藥相比，混合組中多種物質(zhì)對物質(zhì)的吸收造成較為明顯的影響。在混合組中，4種生物胺中組胺、酪胺和尸胺的達(dá)峰時(shí)間Tmax和峰濃度Cmax相比單一生物胺給藥都有明顯的延后，表明組胺、酪胺和尸胺與組織器官的結(jié)合能力變強(qiáng)而導(dǎo)致吸收速度減慢。在物質(zhì)消除過程中，通過比較半衰期t1/2和清除速率CL可以發(fā)現(xiàn)，消除速度最快的為腐胺，其次為酪胺和尸胺，消除最慢的生物胺為組胺。此外，通過與混合組結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，多種物質(zhì)共同攝入時(shí)會加快組胺的消除速率，并減慢尸胺的消除速度。

2.2 SD大鼠口服高級醇的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

將苯乙醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇單次口服給藥SD大鼠后，血液藥物濃度-時(shí)間曲線數(shù)據(jù)經(jīng)軟件分析后計(jì)算得出4種高級醇在SD大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，與單一藥物給藥相比，混合組給藥后苯乙醇、正丙醇和異戊醇的消除半衰期t1/2明顯提高，同時(shí)清除率CL明顯降低，這些結(jié)果表明，多種物質(zhì)共同攝入減慢了苯乙醇、正丙醇和異戊醇的消除速率。與此相比，異丁醇的消除速度并沒有明顯的變化。此外，在4種高級醇中，苯乙醇的消除速率最慢，其清除半衰期t1/2為4.142 h，其次為異丁醇和異戊醇，消除速度最快的高級醇是正丙醇。

2.3 SD大鼠口服乙醛和5-HMF的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

SD大鼠口服給藥乙醛和5-HMF后計(jì)算得出的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表4。結(jié)果顯示，與單一給藥相比，混合組多種物質(zhì)共同攝入后直接影響了乙醛和5-HMF的吸收。藥物峰濃度在混合組中明顯降低，其中乙醛由0.424 mg/L降低至0.076 mg/L，而5-HMF由0.079 mg/L降低至0.035 mg/L，同時(shí)進(jìn)入血液的藥物相對數(shù)量指標(biāo)AUC也都有明顯的降低。此結(jié)果表明，混合組給藥后使乙醛和5-HMF與體內(nèi)組織器官的結(jié)合作用增強(qiáng)，從而導(dǎo)致吸收進(jìn)入血液的藥物含量明顯降低。但增強(qiáng)的組織器官結(jié)合能力提高了乙醛和5-HMF的消除速率，藥代參數(shù)中清除半衰期t1/2和清除率CL的降低表明，混合組給藥提高了乙醛和5-HMF的消除速率。

表2 SD大鼠單次口服組胺、酪胺、尸胺、腐胺和混合組的各物質(zhì)藥代參數(shù)(n=5)

表3 SD大鼠單次口服苯乙醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇和混合組的各物質(zhì)藥代參數(shù)(n=5)

表4 SD大鼠單次口服乙醛、5-HMF和混合組的各物質(zhì)藥代參數(shù)(n=5)

2.4 三大類物質(zhì)間的清除速度比較

本試驗(yàn)在考察了生物胺、高級醇和醛類物質(zhì)在單一口服給藥和混合給藥兩種方式后，得出了生物胺、高級醇和醛類自身物質(zhì)間的消除速度差異。在此結(jié)果上，本試驗(yàn)總結(jié)了4種生物胺、4種高級醇和2種醛類的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（表5），將10種物質(zhì)進(jìn)行橫向比較，以得出10種物質(zhì)間的消除速度差異。10種考察的物質(zhì)中，通過綜合比較不同物質(zhì)間的給藥量（表1）、清除半衰期t1/2和清除速率CL，以消除速度快慢計(jì)，10種物質(zhì)的消除速度順序?yàn)椋赫迹井愇齑迹井惗〈迹颈揭掖迹靖罚疽胰?-HMF＞酪胺＞尸胺＞組胺。在此順序中，生物胺中的組胺和酪胺代謝速度最慢，高級醇中的正丙醇和異戊醇代謝速度較慢，乙醛和5-HMF代謝速度較快。

3 結(jié)論

作為中國傳統(tǒng)釀造酒的代表，黃酒未經(jīng)蒸餾的發(fā)酵工藝決定了其中含有遠(yuǎn)高于白酒等蒸餾酒的豐富物質(zhì)，這些物質(zhì)除作為營養(yǎng)物質(zhì)和功能物質(zhì)為黃酒添加了健康保健屬性外，也可能對黃酒飲后舒適度問題帶來困擾。在本團(tuán)隊(duì)之前的研究中發(fā)現(xiàn)，生物胺、高級醇和醛類物質(zhì)的存在減緩了乙醇在SD大鼠體內(nèi)的代謝速度，通過影響大鼠代謝乙醇的方式帶來黃酒飲后舒適度問題。在本文的研究中，比較了10種生物胺、高級醇和醛類物質(zhì)在SD大鼠體內(nèi)的代謝差異，發(fā)現(xiàn)各物質(zhì)在SD大鼠體內(nèi)的代謝具有一定的差異，消除速度由慢到快的順序?yàn)椋?0物質(zhì)的消除速度順序?yàn)楫愇齑迹菊迹井惗〈迹靖罚疽胰?-HMF＞苯乙醇＞酪胺＞組胺＞尸胺。飲用黃酒后，消除速度較慢的物質(zhì)可能更長時(shí)間保留于人體內(nèi)，更持久的減緩乙醇的代謝。同時(shí)，考察的10種物質(zhì)中，部分物質(zhì)自身具有一定的副作用，對造成上頭現(xiàn)象中的頭疼、嘔吐、頭暈、口渴等癥狀具有直接聯(lián)系。因此，通過本文的研究，初步得出影響黃酒飲后上頭作用相關(guān)機(jī)制的物質(zhì)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步分析上頭在人體內(nèi)所涉及的生理機(jī)制奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，也為制備高舒適度黃酒的釀造工藝調(diào)控策略提供了理論依據(jù)。

表5 單一攝入藥物中生物胺、高級醇和醛類物質(zhì)間代謝參數(shù)的比較