朱江江，林亞秋，王永,，林森

山羊Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子家族在前體脂肪細(xì)胞分化中的表達(dá)模式及相關(guān)性分析

朱江江1，林亞秋1，王永1,2，林森2

（1青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；2青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041）

【】?jī)?yōu)化山羊前體脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，揭示Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子家族（KLFs）成員在前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)模式。于四川省簡(jiǎn)陽(yáng)大哥大牧業(yè)有限公司隨機(jī)選取3只7日齡簡(jiǎn)州大耳羊?yàn)檠芯繉?duì)象。放血致死并清洗后，在無(wú)菌環(huán)境中取其皮下脂肪組織。利用Ⅰ型膠原酶消化法獲得其皮下前體脂肪細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至細(xì)胞密度為80%時(shí)傳代至6孔培養(yǎng)板中（F3代），以“150 μmol·L-1油酸+10 mg·L-1胰島素”前體脂肪細(xì)胞進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，并在誘導(dǎo)分化后0 d、3 d、5 d、7 d收集細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)KLF2-10, KLF 12和KLF15共11個(gè)KLF轉(zhuǎn)錄因子家族成員在不同分化階段細(xì)胞中的表達(dá)水平，并利用皮爾遜系數(shù)分析各個(gè)成員mRNA總體表達(dá)水平之間的相關(guān)性。150 μmol·L-1油酸+10 mg·L-1胰島素處理前體脂肪細(xì)胞24 h后細(xì)胞中開(kāi)始出現(xiàn)小脂滴，48 h后脂滴數(shù)量增多、體積增大，誘導(dǎo)120 h后脂肪細(xì)胞分化程度顯著增加。RT-qPCR結(jié)果顯示，脂肪分化標(biāo)志基因過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體γ（PPARγ）基因隨著誘導(dǎo)分化的進(jìn)行其表達(dá)水平持續(xù)上升，其中在第7天時(shí)其表達(dá)水平極顯著高于其他各組（＜0.01）。、、、、和在脂肪細(xì)胞中表達(dá)水平顯著（＜0.05）或極顯著（＜0.01）高于前體脂肪細(xì)胞中表達(dá)水平，其中和在分化5 d時(shí)表達(dá)水平最高，和表達(dá)水平在7 d時(shí)最高，而則在3 d時(shí)表達(dá)水平最高；和在前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平極顯著高于分化后脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平（＜0.01），其中、和的表達(dá)水平均在5 d時(shí)達(dá)到最低，而和則在7 d時(shí)表達(dá)水平最低；相關(guān)性分析結(jié)果顯示KLF家族各成員mRNA在山羊前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中總體表達(dá)水平存在相關(guān)性，與6個(gè)基因具有較強(qiáng)的相關(guān)性，其次為和，分別與5個(gè)成員具有較強(qiáng)的相關(guān)性，而與其他基因均沒(méi)有較強(qiáng)的相關(guān)性。明確了KLF家族在山羊前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)模式，解析了各個(gè)成員mRNA表達(dá)之間的相關(guān)性，為闡明山羊前體脂肪細(xì)胞分化的分子機(jī)制提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

山羊；前體脂肪細(xì)胞；分化；KLF

0 引言

【研究意義】脂肪組織在動(dòng)物體內(nèi)的分布及沉積是影響動(dòng)物肉質(zhì)性狀的關(guān)鍵因素，其中前體脂肪細(xì)胞分化造成細(xì)胞體積增大, 是影響動(dòng)物脂肪沉積的主要方式。前體脂肪細(xì)胞分化是一個(gè)伴隨著細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能變化的復(fù)雜生物過(guò)程，是諸多轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用的結(jié)果[1]。近年越來(lái)越多的研究表明Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子家族(KLFs)可獨(dú)立或者協(xié)同其他轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控脂肪細(xì)胞分化[2-3]。探討KLF家族基因?qū)τ谥炯?xì)胞分化的調(diào)控作用和理清脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】KLF家族是一類具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和疾病中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[4]。截止目前KLF家族共有18個(gè)成員（即）被發(fā)現(xiàn)[5]，其中有10個(gè)成員（—）可能參與脂肪細(xì)胞分化[6]，但該結(jié)論以小鼠前脂肪細(xì)胞系研究結(jié)果為主，而且關(guān)于同一成員的調(diào)控作用存在分歧。BIRSOY等指出是3T3-L1前體脂肪細(xì)胞早期分化所必需的轉(zhuǎn)錄因子，然而PARK等在2017年卻提出了相反的觀點(diǎn)，即對(duì)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化無(wú)影響[7-8]。JIANG等[9]指出可通過(guò)調(diào)控過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體γ基因（）的表達(dá)從而促進(jìn)豬前體脂肪細(xì)胞分化，但對(duì)小鼠3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化卻沒(méi)有影響，表明該基因作用存在種屬特異性。GUO等[10]發(fā)現(xiàn)可通過(guò)結(jié)合的啟動(dòng)子從而促進(jìn)的轉(zhuǎn)錄。青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期分別克隆了藏山羊[11]及簡(jiǎn)州大耳羊[12]、和[13]序列，并進(jìn)行了組織表達(dá)分析。而對(duì)于其他成員而言，是機(jī)體紅細(xì)胞生成的主要調(diào)控因子[6]，在細(xì)胞增殖等方面具有重要的調(diào)控作用[14]，可調(diào)控機(jī)體糖酵解過(guò)程[15]，在神經(jīng)細(xì)胞突出生長(zhǎng)具有重要調(diào)控作用[16]，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和惡化[17]，而則是剛發(fā)現(xiàn)的家族新成員[5]。目前還沒(méi)有關(guān)于在山羊前體脂肪細(xì)胞分化中的研究。因此，在已有研究的基礎(chǔ)上，在山羊前體脂肪細(xì)胞中驗(yàn)證KLFs家族特別是等脂肪分化相關(guān)基因的功能對(duì)揭示山羊肌內(nèi)脂肪沉積的分子調(diào)控機(jī)制具有重要意義?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期RNA-Seq測(cè)序發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子家族基因可能參與山羊脂肪沉積過(guò)程，然而其功能研究并不能完全參照鼠源細(xì)胞系中的研究結(jié)果，必須以體外培養(yǎng)的山羊前體脂肪為研究對(duì)象來(lái)進(jìn)行。KLFs家族各個(gè)成員的生物學(xué)功能不同，有的激活靶基因表達(dá)，有的抑制靶基因表達(dá)[18]。并且各個(gè)成員之間存在相互調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系[19-20]。然而，KLFs家族各成員在脂肪細(xì)胞分化中的表達(dá)情況及相關(guān)性究竟如何還不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為了探究KLFs家族基因在山羊肌內(nèi)脂肪沉積中的作用，本研究以山羊前體脂肪細(xì)胞分化調(diào)控為切入點(diǎn)，在優(yōu)化山羊前體脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，選擇目前已經(jīng)報(bào)道的對(duì)細(xì)胞分化可能具有調(diào)控作用的和（除已有報(bào)道外）[13]11個(gè)KLFs家族成員為研究對(duì)象，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)它們?cè)诓煌芍T導(dǎo)分化階段細(xì)胞中的表達(dá)水平，明確在分化過(guò)程中的表達(dá)模式，分析各個(gè)成員之間基因表達(dá)的相關(guān)性，為進(jìn)一步闡明KLF轉(zhuǎn)錄因子家族網(wǎng)絡(luò)調(diào)控山羊脂肪沉積的作用及分子機(jī)制提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集

試驗(yàn)于2017年在西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院完成。于四川省簡(jiǎn)陽(yáng)大哥大牧業(yè)有限公司隨機(jī)選擇3只7日齡的簡(jiǎn)州大耳羊羔羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物。羔羊帶回實(shí)驗(yàn)室后放血致死，消毒后解剖取其皮下脂肪組織用于細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

I型膠原酶、油酸、牛血清白蛋白和胰島素購(gòu)自Sigma公司產(chǎn)品，胰蛋白酶和DMEM/ F12培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司產(chǎn)品，胎牛血清購(gòu)自Gemini公司產(chǎn)品。SYBR?Premix ExTM (2×)購(gòu)自大連TaKaRa公司，2×PCR Master Mix和Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自Thermo公司?？俁NA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 山羊前體脂肪細(xì)胞的分離培養(yǎng)

將3只7日齡的簡(jiǎn)州大耳羊頸動(dòng)脈放血后用新潔而滅清洗2—3次，再用75%酒精擦拭消毒，在無(wú)菌環(huán)境中取其皮下脂肪組織，用含3倍雙抗的PBS清洗3次后將其剪碎，等量混合3只羔羊組織樣品后加入2倍體積的I型膠原酶消化1 h（每5 min震蕩一次），并加入等體積的10%胎牛血清培養(yǎng)液終止消化。濾液分別過(guò)200目和400目后分裝到離心管中，2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液靜置5 min，2 000 r/min離心5 min，棄上清，用PBS洗3遍后，取適量的重懸液分別接種到25 cm2的培養(yǎng)瓶中，加入適量完全培養(yǎng)基混勻后，于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔2 d更換新鮮培養(yǎng)基。

1.4 山羊前體脂肪細(xì)胞的傳代培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化

當(dāng)原代細(xì)胞長(zhǎng)至80%細(xì)胞密度時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化2 min，棄掉胰蛋白酶，加入適量完全培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心3 min，加入適量完全培養(yǎng)基混勻后，按照1﹕3傳代接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中在37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔2 d換液。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%細(xì)胞密度時(shí)再傳代2次最后至6孔培養(yǎng)板中（即F3代），然后用含150 μmol·L-1油酸+10 mg·L-1胰島素的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至不同時(shí)間收集用于基因表達(dá)模式的檢測(cè)。

1.5 基因表達(dá)檢測(cè)

分別取誘導(dǎo)0、3、5和7 d的F3代細(xì)胞（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)重復(fù)），利用RNA提取試劑盒提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)以 Oligo (dT) 為引物合成cDNA第一鏈。利用 Primer Premier5.0 軟件，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的山羊（、和）序列設(shè)計(jì)特異引物（表1），利用RT-qPCR檢測(cè)它們?cè)诓煌芍T導(dǎo)分化時(shí)間段中的表達(dá)水平。RT-qPCR反應(yīng)體系如下：SYBR?Premix ExTM (2×) PCR 10 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。二步法PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 1 min；PCR過(guò)程95℃ 30 s，60℃/62℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；添加溶解曲線95℃15 s，60℃30 s，95℃15 s；保存4℃forever。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

時(shí)序表達(dá)數(shù)據(jù)定量分析以誘導(dǎo)分化0 d的細(xì)胞Ct值為對(duì)照來(lái)計(jì)算，結(jié)果用2?△△Ct法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。最終結(jié)果以SPSS 18.0軟件中的One-way ANOVA進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析，采用Duncan法對(duì)各階段mRNA表達(dá)進(jìn)行多重比較。并利用SPSS對(duì)各時(shí)期基因表達(dá)水平總體數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，利用r值代表基因表達(dá)水平相關(guān)性。利用Cytoscape3.2.0對(duì)得到的相關(guān)性結(jié)果進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，設(shè)置閾值位r＞0.7。

2 結(jié)果

2.1 山羊前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的形態(tài)學(xué)變化

當(dāng)細(xì)胞傳至F3代長(zhǎng)至80%細(xì)胞密度后，加入誘導(dǎo)分化液培養(yǎng)24 h后細(xì)胞中開(kāi)始出現(xiàn)小脂滴（圖1-A），48 h后脂滴數(shù)量增多、體積增大（圖1-B、C），誘導(dǎo)120 h后脂肪細(xì)胞分化程度顯著增加（圖1-D），脂滴經(jīng)油紅O染色后可被染成橘紅色。

表1 引物信息

S:正義鏈引物; A:反義鏈引物; GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶

S: Sense primer; A: Antisense primer; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

2.2 轉(zhuǎn)錄因子KLF家族成員的表達(dá)模式

RT-qPCR結(jié)果顯示，PPARγ基因隨著誘導(dǎo)分化的進(jìn)行其表達(dá)水平持續(xù)上升，其中在第7天時(shí)其表達(dá)水平極顯著高于其他各組（＜0.01）（圖2）。家族11個(gè)成員在山羊前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中均被檢測(cè)到，其表達(dá)模式可大概分為兩種，一種是在脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著或極顯著高于前體脂肪細(xì)胞中表達(dá)水平（、、、、和）；另外一種是在前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平極顯著高于脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平（、、、和）（圖3、4）。

其中在第一種表達(dá)模式中和的表達(dá)趨勢(shì)相似，均是隨著分化的進(jìn)行其表達(dá)水平逐漸升高，且第7天表達(dá)水平最高，極顯著高于在前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平（＜0.01）；和表達(dá)趨勢(shì)相似，均是誘導(dǎo)分化第5天的表達(dá)水平顯著高于在前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平（＜0.05）；同時(shí)結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)分化第3天的表達(dá)極顯著高于其在前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平（＜0.01），在誘導(dǎo)分化的第3天和第5天的表達(dá)水平極顯著高于其在前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平（＜0.01）。

另外一種表達(dá)模式比較單一，均是在前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平極顯著高于誘導(dǎo)分化后各個(gè)時(shí)間段的表達(dá)水平（＜0.01）。

A. 誘導(dǎo)培養(yǎng)第24小時(shí)；B. 誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h；C. 誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h；D. 誘導(dǎo)培養(yǎng)120 h

不同大寫(xiě)字母表示P＜0.01，不同小寫(xiě)字母表示P＜0.05。下同

2.3 轉(zhuǎn)錄因子KLF家族各成員間表達(dá)相關(guān)性分析

本試驗(yàn)分析了家族各成員在山羊前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中基因表達(dá)水平之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示家族這11個(gè)成員的mRNA表達(dá)水平均存在正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，且與之間存在極顯著正相關(guān)（＜0.01），與存在顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05）；與、、、和之間存在極顯著的負(fù)相關(guān)（＜0.01）；和、存在顯著的正相關(guān)（＜0.05），與和存在極顯著的正相關(guān)（＜0.01），與存在顯著的負(fù)相關(guān)（＜0.05）；與存在顯著的正相關(guān)（＜0.05），與存在極顯著的負(fù)相關(guān)（＜0.01）；與、、存在顯著或極顯著的正相關(guān)（＜0.05或＜0.01），與和存在極顯著的負(fù)相關(guān)（＜0.01）。相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，與6個(gè)基因具有較強(qiáng)的相關(guān)性，其次為和，分別與5個(gè)成員具有較強(qiáng)的相關(guān)性，而與其他基因均沒(méi)有較強(qiáng)的相關(guān)性（表2，圖5）。

3 討論

3.1 山羊前體脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的優(yōu)化

建立動(dòng)物前體脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)模型是闡明動(dòng)物脂肪沉積分子機(jī)理的重要手段，本實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的簡(jiǎn)州大耳羊前體脂肪細(xì)胞傳至第3代后，其自發(fā)分化能力則顯著下降。因此確定適合山羊前體脂肪細(xì)胞的有效誘導(dǎo)劑對(duì)闡明脂肪細(xì)胞分化機(jī)制具有非常重要的理論與實(shí)際意義。綜合目前國(guó)內(nèi)外不同動(dòng)物前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的方法，發(fā)現(xiàn)不同動(dòng)物（如豬、牛、雞、草魚(yú)和綿羊等）所用的誘導(dǎo)劑存在差別[21-24]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)“油酸+胰島素”可有效誘導(dǎo)簡(jiǎn)州大耳羊前體脂肪細(xì)胞分化，且在誘導(dǎo)分化的第5天分化率達(dá)到90%以上。這與曲貞曉和杜琛等[25-26]在嶗山奶山羊和內(nèi)蒙古絨山羊所用的方法相比縮短了前體脂肪細(xì)胞完全分化的時(shí)間，為進(jìn)一步研究山羊脂肪細(xì)胞分化、脂代謝的分子機(jī)制提供更好的模型。CHEGURU等[27]也指出油酸+胰島素可有效促進(jìn)3T3- L1前體脂肪細(xì)胞中脂滴的積聚并伴隨著、aP2轉(zhuǎn)錄因子（）和硬脂酰輔酶A去飽和酶1（）基因表達(dá)的升高。SHANG等[21]指出160 μmol·L-1油酸可誘導(dǎo)雞前體脂肪細(xì)胞分化，DING等[28]指出50—300 μmol·L-1油酸可通過(guò)促進(jìn)aP2基因的表達(dá)（但、轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（）和脂蛋白脂酶（）基因表達(dá)未發(fā)生變化）進(jìn)而促進(jìn)豬前體脂肪細(xì)胞分化。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的油酸（0、50、100、150、300 μmol·L-1）對(duì)山羊前體脂肪細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)效果并不相同，使用150 μmol·L-1具有最好的成脂誘導(dǎo)效果。此外，ADINA等[29]發(fā)現(xiàn)使用10 mg·L-1的胰島素具有較好的誘導(dǎo)成脂分化的效果。因此本研究在前期試驗(yàn)和前人研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇150 μmol·L-1油酸+10 mg·L-1胰島素處理山羊前體脂肪細(xì)胞，結(jié)果顯示成脂誘導(dǎo)效果良好。綜上所述，不同動(dòng)物前體脂肪細(xì)胞具有最適合的獨(dú)特誘導(dǎo)劑，即使同一誘導(dǎo)劑其最佳濃度也可能存在差異。

不同大寫(xiě)字母表示P＜0.01，不同小寫(xiě)字母表示P＜0.05

不同大寫(xiě)字母表示＜0.01，不同小寫(xiě)字母表示＜0.05

Different capital letters represents＜0.01, different lower-case letters represents＜0.05

圖4 山羊脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中、、、和的表達(dá)情況

Fig. 4 The expression of,,,andduring preadipocyte differentiation

表2 KLF家族各成員間表達(dá)水平的相關(guān)性

*表示差異顯著（＜0.05），**表示差異極顯著（＜0.01）；#表示進(jìn)行相關(guān)分析的誘導(dǎo)分化時(shí)間為0—5 d，其余的為0—7 d

*represents＜0.05, ** represents＜0.01, #represents the analyses based on 0-5 days after cell differentiation inducing, the rest data based on 0-7 days after cell differentiation inducing

圖5 山羊KLF家族基因相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

3.2 KLFs在山羊前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)模式

基于轉(zhuǎn)錄因子在前體脂肪細(xì)胞分化中所占的重要地位，檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子在山羊前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)模式是闡明山羊前體脂肪細(xì)胞分化分子機(jī)理的基礎(chǔ)。本研究檢測(cè)了脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因、脂肪細(xì)胞確定分化依賴因子1（）和在山羊成脂分化過(guò)程中的表達(dá)譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)和（數(shù)據(jù)未顯示）的表達(dá)水平隨著分化的進(jìn)行而持續(xù)增高，從而進(jìn)一步證明了本文所選誘導(dǎo)劑的可行性。家族成員在山羊成脂分化過(guò)程中的表達(dá)模式可大概分為兩類，一類是分化的脂肪細(xì)胞中表達(dá)水平顯著或極顯著高于前體脂肪細(xì)胞中表達(dá)水平（、、、、和），推測(cè)這些成員可能在山羊前體脂肪細(xì)胞分化中發(fā)揮正調(diào)控作用；另一類是前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平極顯著高于分化的脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平（、、、和），推測(cè)這些成員可能在山羊前體脂肪細(xì)胞分化中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。這些結(jié)果與其他學(xué)者在人、小鼠和雞上的研究結(jié)果存在著一些相似及不同之處，下面分別就相似及不同之處進(jìn)行對(duì)比分析。

3.2.1、、、、和表達(dá)模式分析 本研究發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)分化第7天的山羊脂肪細(xì)胞中表達(dá)極顯著高于其在前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平，這與其他學(xué)者提出的在人和小鼠的前體脂肪細(xì)胞中存在高水平表達(dá)的結(jié)果不同[30-31]。SUE等[32]指出隨3T3-L1前體脂肪分化，表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，且可能依賴于C-末端結(jié)合蛋白（）蛋白來(lái)抑制在3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化。但本文卻發(fā)現(xiàn)其在誘導(dǎo)分化第5天的山羊脂肪細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于在前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)。隨山羊前體脂肪細(xì)胞分化的進(jìn)行其表達(dá)水平逐漸升高，這與Birsoy等[7]在3T3-L1中的報(bào)道相似，但與EISENSTEIN等[33]在小鼠中的報(bào)道不同。在誘導(dǎo)分化第3天的山羊脂肪細(xì)胞中表達(dá)極顯著高于其在前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平，這與其在雞前體脂肪細(xì)胞中高表達(dá)的報(bào)道不同[34]。和在山羊前體脂肪細(xì)胞成脂分化過(guò)程中的表達(dá)模式與它們?cè)?T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化中的表達(dá)模式相似，并且研究指出可能通過(guò)抑制前脂肪細(xì)胞因子1（PREF1）來(lái)促進(jìn)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化[35]。在雞前體脂肪細(xì)胞分化中表達(dá)量顯著增加，但在不同發(fā)育階段皮下脂肪組織中表達(dá)水平卻無(wú)變化[36]，推測(cè)其可能在動(dòng)物組織與細(xì)胞中存在不同的調(diào)控途徑。此外，研究發(fā)現(xiàn)除了自身可調(diào)控脂肪細(xì)胞分化外，還可作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)其他調(diào)控因子對(duì)脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控[3,37]，進(jìn)一步證明了該基因的重要作用。

3.2.2、、、和表達(dá)模式分析、、、和在山羊前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平均極顯著高于在誘導(dǎo)分化細(xì)胞中的表達(dá)水平。OISHI 等[38]指出在3T3-L1前體脂肪細(xì)胞被誘導(dǎo)1 h后就檢測(cè)到表達(dá)，誘導(dǎo)3 h檢測(cè)到表達(dá)峰值，且可協(xié)同C/EBPβ和C/EBPδ激活PPARγ來(lái)促進(jìn)3T3-L1脂肪細(xì)胞分化。本研究結(jié)果與之不同的原因可能是檢測(cè)的誘導(dǎo)分化時(shí)間點(diǎn)跨度較大，推測(cè)可能在前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)早期發(fā)揮作用[39]。和在山羊和3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化中的表達(dá)模式不同。Lee等[40]指出在3T3-L1前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)36 h后檢測(cè)到表達(dá)，并且熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明超表達(dá)可促進(jìn)和啟動(dòng)子的活性，提示可能通過(guò)促進(jìn)和的表達(dá)來(lái)促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化。Pei等[41]指出可能是調(diào)控3T3-L1前體脂肪細(xì)胞中期分化階段的重要轉(zhuǎn)錄因子，且這種調(diào)控作用主要通過(guò)影響和的表達(dá)水平來(lái)進(jìn)行的。目前尚未見(jiàn)和在脂肪細(xì)胞分化、脂代謝和脂肪沉積中的相關(guān)報(bào)道。

3.3 KLF家族各成員在山羊前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中相關(guān)性

研究表明，KLFs家族有些成員的表達(dá)可以調(diào)控同一家族其他成員的表達(dá)，即等級(jí)調(diào)控，在功能上體現(xiàn)為協(xié)同或者拮抗作用[19-20]。但目前關(guān)于KLFs各個(gè)成員之間的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系報(bào)道在脂肪細(xì)胞分化中研究較少，無(wú)法精確構(gòu)建其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此本研究系統(tǒng)分析了家族11個(gè)成員在山羊前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的相關(guān)性，結(jié)果指出這11個(gè)成員均存在正相關(guān)或負(fù)相關(guān)即可能發(fā)揮協(xié)同或者拮抗作用，并且與、和這三個(gè)成員存在顯著相關(guān)的成員較多，推測(cè)它們可能在網(wǎng)絡(luò)級(jí)聯(lián)中處于重要位置。與在紅細(xì)胞生成中具有相互調(diào)控作用[19,42]。Eaton等[21]在小鼠胎兒肝臟細(xì)胞系中研究表明可以激活和的表達(dá)，而則可以抑制介導(dǎo)的的活化，三者之間形成了交互調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)。FUNNELL等[43]發(fā)現(xiàn)和在胚胎發(fā)育過(guò)程中具有重疊作用。本研究也發(fā)現(xiàn)與在山羊前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中也存在顯著相關(guān)，推測(cè)在這個(gè)過(guò)程中可能具有相互調(diào)控作用。本文還發(fā)現(xiàn)、和處于相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)的中心位置，分別與6個(gè)、5個(gè)、5個(gè)基因具有較強(qiáng)的相關(guān)性，推測(cè)這些基因可能在山羊前體脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中具有重要作用。

4 結(jié)論

油酸+胰島素可有效誘導(dǎo)山羊前體脂肪細(xì)胞分化；、、、、和在分化的脂肪細(xì)胞中表達(dá)水平顯著或極顯著高于前體脂肪細(xì)胞中表達(dá)水平；、、、和在前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著或極顯著高于分化的脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平。、和在山羊前體脂肪細(xì)胞分化調(diào)控過(guò)程中可能具有重要的調(diào)控作用。這些結(jié)果為進(jìn)一步闡明轉(zhuǎn)錄因子家族在山羊前體脂肪細(xì)胞分化中的調(diào)控作用提供重要的數(shù)據(jù)支撐。

[1] STEPHENS J M. The fat controller: adipocyte development., 2012, 10(11): e1001436.

[2] KACZYNSKI J, COOK T, URRUTIA R. Sp1 and Kruppel-like transcription factors., 2003, 4(2): 206.

[3] LEE D S, CHOI H, HAN B S, Kim W K, Lee S C, Oh K J, Bae K H. c-Jun regulates adipocyte differentiation via the KLF15-mediated mode., 2016, 469(3): 552-558.

[4] WU Z N, WANG S Q. Role of kruppel-like transcription factors in adipogenesis., 2013, 373(2): 235-243.

[5] PEI J, GRISHIN N V. A new family of predicted Krüppel-like factor genes and pseudogenes in placental mammals., 2013, 8(11): e81109.

[6] WEI S J, ZHANG L F, ZHOU X, DU M, JIANG Z H, HAUSMAN G J, BERGEN W G, ZAN L S, DODSON M V. Emerging roles of zinc finger proteins in regulating adipogenesis., 2013, 70(23): 4569-4584.

[7] BIRSOY K, CHEN Z, FRIEDMAN J. Transcriptional regulation of adipogenesis by KLF4., 2008, 7(4): 339-347.

[8] PARK Y K, WANG L M, GIAMPIETRO A, LAI B B, LEE J E, GE K. Distinct roles of transcription factors KLF4, Krox20 and PPARγ in adipogenesis., 2017, 37(2): e00554-16.

[9] JIANG S Z, WEI H K, SONG T X, YANG Y, ZHAGN F, ZHOU Y F, PENG J, JIANG S W. KLF13 promotes porcine adipocyte differentiation through PPARγ activation., 2015, 5: 28.

[10] GUO H F, KHAN R, RAZA S H A, NING Y, WEI, D W, HOSSEINI S M, ULLA I, GARCIA M D, ZAN L S. KLF15 promotes transcription of KLF3 gene in bovine adipocytes., 2018, 659(15): 77-83.

[11] 池永東, 王永, 朱江江, 林森, 趙越, 林亞秋. 藏山羊KLF8基因克隆及組織表達(dá)分析. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2019, 38(2): 478-502.

CHI Y D, WANG Y, ZHU J J, LIN S, ZHAO Y, LIN Y Q. Cloning and tissue expression analysis of klf8 gene in Tibetan goat., 2019, 38(2): 478-502. (in Chinese)

[12] 田苗, 左璐璐, 張小玉, 柏雪, 江明鋒, 林亞秋. 牦牛基因克隆及組織表達(dá)分析. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2017, 17(09/1): 234-236.

TIAN M, ZUO L L, ZHANG X Y, BAI X, JIANG M F, LIN Y Q. Cloning and tissue expression analysis ofgene in Yak., 2017, 17(09/1): 234-236. (in Chinese)

[13] 朱江江, 林亞秋, 王永, 李倩, 林森, 熊朝瑞, 俄木曲者. 山羊KLF13 基因的克隆及表達(dá)分析. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2017, 25(1): 102-109.

ZHU J J, LIN Y Q, WANG Y, LI Q, LIN S, XIONG C R, EMU Q Z. Cloning and expression analysis of goat ()gene., 2017, 25(1): 102-109. (in Chinese)

[14] NEVE B, FERNANDEZ-ZAPICO M E, ASHKENAZI-KATALAN V, DINA C, HAMID Y H, JOLY E, VAILLANT E, BENMEZROUA Y, DURAND E, BAKAHER N, DELANNOY V, VAXILLAIRE M, COOK T, DALLINGA-THIE G M, JANSEN H, CHARLES M A, CLEMENT K, GALAN P, HERCBERG S, HELBECQUE N, CHARPENTIER G, PRENTKI M, HANSEN T, PEDERSEN O, URRUTIA R, MELLOUL D, FROGUEL P. Role of transcription factor KLF11 and its diabetes-associated gene variants in pancreatic beta cell function.2005, 102(13): 4807-4812.

[15] Wu G, YUAN S, CHEN Z, CHEN G, FAN Q, DONG H, YE F, LI J, ZHU X. The KLF14 transcription factor regulates glycolysis by downregulating LDHB in colorectal cancer., 2019, 15(3): 628-635.

[16] WANG J, GALVAO J, BEACH K M, LUO W, URRUTIA R A, GOLDBERG J L, OTTESON D C. Novel roles and mechanism for Kruppel-like Factor 16 (KLF16) regulation of neurite outgrowth and ephrin receptor A5 (EphA5) expression in retinal ganglion cells., 2016, 291(35): 18084-18095.

[17] ALI A, ZHANG P, LIANGFANG Y, WENSHE S, WANG H, LIN X, DAI Y, FENG X H, MOSES R, WANG D, LI X, XIAO J. KLF17 empowers TGF-β/Smad signaling by targeting Smad3-dependent pathway to suppress tumor growth and metastasis during cancer progression., 2015, 6(3): e1681.

[18] PEARSON R, FLEETWOOD J, EATON S, CROSSLEY M, BAO S. Krüppel-like transcription factors: a functional family., 2008, 40(10): 1996-2001.

[19] FUNNELL A P W, MALONEY C A, THOMPSON L J, KEYS J, TALLACK M, PERKINS A C, CROSSLEY M. Erythroid Kruppel- like factor directly activates the basic Kruppel-like factor gene in erythroid cells., 2007, 27(7): 2777-2790.

[20] EATON S A, FUNNELL A P W, SUE N, NICHOLAS H, RICHARD C M, CROSSLEY M. A network of Krüppel-like factors (Klfs)., 2008, 283(40): 26937-26947.

[21] 郭紅芳, 昝林森, 孫永剛. 牛前體脂肪細(xì)胞的分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2012, 42(2): 1-6.

GUO H F, ZAN L S, SUN Y G. Primary culture and differentiation of bovine preadipocytes., 2012, 42(2): 1-6. (in Chinese)

[22] SHANG Z C, GUO L, WANG N, SHI H, WANG Y X, LI H. Oleate promotes differentiation of chicken primary preadipocytes., 2014, 34(1): e00093.

[23] 吉紅, 曹艷姿, 林亞秋, 劉品, 盧榮華, 蘇尚順, 楊公社, 奧宏海. 草魚(yú)前體脂肪細(xì)胞的原代培養(yǎng). 水生生物學(xué)報(bào), 2009, 33(6): 1226-1230.

JI H, CAO Y Z, LIN Y Q, LIU P, LU R H, SU S S, YANG G S, AO H H. Primary culture of grass carp preadipocyte in vitro., 2009, 33(6): 1226-1230. (in Chinese)

[24] 蔡勇, 阿依木古麗, 楊具田, 馬忠仁, 盧建雄, 臧榮鑫, 吳建平. 綿羊前體脂肪細(xì)胞的原代培養(yǎng)及分化. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2010, 22(6): 1768-1774.

CAI Y, AYIMUGULI, YANG J T, MA Z R, LU J X, ZANG R X, WU J P. Primary culture and differentiation of Ovine preadipocytes., 2010, 22(6): 1768-1774. (in Chinese)

[25] 曲貞曉, 劉金鳳, 姜穎, 潘慶杰. 山羊前體脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)試驗(yàn). 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2013, 30(1): 1-5.

QU Z X, LIU J F, JIANG Y, PAN Q J. The culture experiment of goats preadipocytes in vitro., 2013, 30(1): 1-5. (in Chinese)

[26] 杜琛, 付紹印, 韓志玲, 孟麗云, 愛(ài)倫高娃, 高麗霞, 成立新, 張文廣, 李金泉. 絨山羊肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的基因表達(dá)分析. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2013, 44(10): 1532-1538.

DU C, FU S Y, HAN Z L, MENG L Y, AILUN G W, GAO L X, CHENG L X, ZHANG W G, LI J Q. Gene expression analysis on intramuscular preadipocytes in the cashmere goats., 2013, 44(10): 1532-1538. (in Chinese)

[27] CHEGURU P, CHAPALAMADUGU K C, DOUMIT M E, MURDOCH G K, HILL R A. Adipocyte differentiation-specific gene transcriptional response to C18 unsaturated fatty acids plus insulin., 2012, 463(3): 429-447.

[28] DING S T, WANG J C, MERSMANN H J. Effect of unsaturated fatty acids on porcine adipocyte differentiation., 2003, 23(8): 1059-1069.

[29] ADINA K S, ROBERT Y H, M. DANIEL L. Induction of fatty acid synthetase synthesis in differentiai 3T3-Ll preadipocytes., 1980, 255(25): 4745-4750.

[30] BANERJEE S S, FEINBERG M W, WATANABE M, GRAY S, HASPEL R L, DENKINGER D J, KAWAHARA R, HAUNER H, JAIN M K. The Kruppel-like factor KLF2 inhibits peroxisome proliferator-activated receptor-gamma expression and adipogenesis., 2003, 278(4): 2581-2584 .

[31] LEE H, KANG R, KIM Y S, CHUANG S I, YOON Y. Platycodin D inhibits adipogenesis of3T3-L 1 cells by modulating kruppel-like factor 2 and peroxisome proliferator-activated receptor γ., 2010, 24(S2): S161-S167.

[32] SUE N，JACK B H A，EATON S A，PEARSON R C M, FUNNELL A P W, TURNER J, CZOLIJ R, DENYER G, BAO S S, MOLERO-NAVAJAS J C, PERKINS A, FUJIWARA Y, ORKIN S H, BELL-ANDERSON K, CROSSLEY M. Targeted disruption ofthe basic Kriippel-like factor gene (Klf3) reveals a role in adipogenesis., 2008, 28(12): 3967-3978.

[33] EISENSTEIN A, CARROLL S H, JOHNSTON-COX H, FARB M, GOKCE N, RAVID K. An adenosine receptor-Krüppel-like factor 4 protein axis inhibits adipogenesis., 2014, 289(30): 21071-21081.

[34] ZHANG Z W, WANG H X, SUN Y N, LI H, WANG N. Klf7 modulates the differentiation and proliferation of chicken preadipocyte., 2013, 45(4): 280-288.

[35] LI D, YEA S, LI S, CHEN Z, NORLA G, BANCK M, LABORDA J, TAN S, FRIEDMAN J M, FRIEDMAN S L, WALSH M J. Kruppel- like factor-6 promotes preadipocyte differentiation through histone deacetylase 3-dependent repression of DLK1., 2005, 280(29): 26941-26952.

[36] MATSUBARA Y, AOKI M, ENDO T, SATO K. Characterization of the expression profiles of adipogenesis-related factors, ZNF423, KLFs and FGF10, during preadipocyte differentiation and abdominal adipose tissue development in chickens., 2013, 165(3): 189-195.

[37] AHMED M, GAFFEN S L. IL-17 inhibits adipogenesis in part via C/EBPα, PPARγ and Krüppel-like factors., 2013, 61(3): 898-905.

[38] OISHI Y, MANABE I, TOBE K, SHINDO T, FUJIU K, NISHIMURA G, MAEMURA K, YAMAUCHI T, KUBOTA N, SUZUKI R, KITAMURA T, AKIRA S, KADOWAKI T, NAGAI R. Kruppel-like transcription factor KLF5 is a key regulator of adipocyte differentiation., 2005, 1(1): 27-39.

[39] CERVANTES-CAMACHO C, BELTRáN-LANGARICA A, OCHOA- URIBE A K, Marsch-Moreno M, Ayala-Sumuano JT, Velez- delValle C, Kuri-Harcuch W. The transient expression of Klf4 and Klf5 during adipogenesis depends on GSK3β activity., 2015, 4(4): 248-255.

[40] LEE H, KIM H J, LEE Y J, LEE M Y, CHOI H, LEE H, KIM J W. Krüppel-like factor KLF8 plays a critical role in adipocyte differentiation., 2012, 7(12): e52474.

[41] PEI H, YAO Y, YANG Y, LIAO K, WU J R. Krüppel-like factor KLF9 regulates PPARγ transactivation at the middle stage of adipogenesis., 2011, 18(2): 315-327.

[42] ILSLEY M D, GILLINDER K R, MAGOR G W, Huang S, Bailey T L, Crossley M, Perkins A C . Krüppel-like factors compete for promoters and enhancers to fine-tune transcription., 2017, 45(11): 6572-6588.

[43] FUNNELL A P, MAK K S, TWINE N A, PELKA G J, NORTON L J, RADZIEWIC T, POWER M, WIKINS M R, BELL-ANDERSON K S, FRASER S T, PERKINS A C, TAM P P, PEARSON R C M, CROSSLEY M. Generation of mice deficient in both KLF3/BKLF and KLF8 reveals a genetic interaction and a role for these factors in embryonic globin gene silencing., 2013, 33(15): 2976-2987.

Expression Profile and Correlations of Kruppel Like Factors During Caprine () Preadipocyte Differentiation

ZHU JiangJiang1, LIN YaQiu1, WANG Yong1,2, LIN Sen2

(1Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization Key Laboratory of Sichuan Province, Chengdu 610041;2Key Laboratory of Qinghai-Tibetan Plateau Animal Genetic Resource Reservation and Utilization (Southwest Minzu University), Ministry of Education, Chengdu 610041)

【】The aim of this study was to optimize the culture system of goat preadipocytes in vitro and elucidate the expression patterns of Kruppel like factors (KLFs) during preadipocytes differentiation.】Three 7-day-old Jianzhou Big-Eared goats were selected randomly from Sichuan Jianyang DAGEDA Animal Husbandry Co. Ltd. as experimental animal. After bloodletting death of goats, their subcutaneous fat tissues were collected in a sterile room. The goat subcutaneous preadipocytes were collected using collagenase I digestion method. The cells at Generation Three were then passaged to a 6-well plate when the cells were grown to 80% density. The combined use of were used for preadipocytes differentiate inducing. The cells were then collected after cultivation for 0 d, 3 d, 5 d and 7 d. The total RNA was extracted by using Trizol method. Real-time fluorescent quantitative PCR (RT-qPCR) was performed to determine the expression levels of 11 members of KLFs, including KLF2-10, KLF12 and KLF15, during goat preadipocytes differentiation. Pearson correlation coefficient was used for expression correlation analysis between KLF individuals.【】The results showed that the combined use of 150 μmol·L-1oleic acid and 10 mg·L-1insulin promoted the formation of small lipid droplets after 24 h cultivation. After 48 h, the lipid droplets became bigger and much more. The differentiation of the preadipocytes were enhanced significantly after 120 h comparing with preadipocytes at 0 h. The results of RT-qPCR showed that the combined use of oleic acid and insulin stimulated the expression of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma () continuously companying the differentiation of preadipocytes, and toped at 7 d which significantly higher than other groups (＜0.01). The expression levels of,,,,and＜0.05) or extremely significantly (＜0.01) higher than those in preadipocytes. While the expression of,andwere topped at 5 d, theandtoped at 7 d. However, theexpressed most at 3 d. For the other KLF individuals, the expression levels of,,,andextremely significantly higher (＜0.01) than those in adipocytes. The expression of,andbottomed at 5 d, while that of theandbottomed at 7 d. Correlation analysis showed that KLF individual significantly (＜0.05) correlated with each other across cell differentiation.was strongly correlated with 6 individuals, followed byandboth of which were significantly correlated with 5 individuals. However,was not significantly correlated with other individuals. 【】In this study, the expression patterns of KLFs during goat preadipocytes differentiation were clarified, and also the correlations among KLF individuals. These results provided important basic data for elucidating the molecular mechanism of goat preadipocytes differentiation.

goat; preadipocytes; differentiation; Kruppel like factors

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.13.012

2018-01-24；

2019-05-10

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD0502002）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31672395）、四川省“十三五”畜禽育種攻關(guān)項(xiàng)目（2016NYZ0045）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金（2017NGJPY06）、青藏高原生態(tài)畜牧業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心開(kāi)放基金（QZGYXT01）

朱江江，E-mail：zhujiang4656@hotmail.com。

林亞秋，E-mail：linyq1999@163.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）