竇萬福，祁靜靜，胡安華，陳善春，彭愛紅，許蘭珍，雷天剛，姚利曉，何永睿，李強

GST pull-down聯(lián)合LC-MS/MS篩選柑橘抗?jié)儾∞D(zhuǎn)錄因子CsBZIP40的互作蛋白

竇萬福，祁靜靜，胡安華，陳善春，彭愛紅，許蘭珍，雷天剛，姚利曉，何永睿，李強

（西南大學/中國農(nóng)業(yè)科學院柑桔研究所，重慶 400712）

CsBZIP40是一個與潰瘍病抗性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，本研究旨在篩選轉(zhuǎn)錄因子CsBZIP40在響應(yīng)柑橘潰瘍病菌（subsp.，）侵染過程中的互作蛋白，對CsBZIP40的互作網(wǎng)絡(luò)進行分析，為柑橘抗?jié)儾〉姆肿佑N提供理論依據(jù)。采用GST pull-down技術(shù)篩選柑橘在潰瘍病菌侵染過程中CsBZIP40的互作蛋白。首先，構(gòu)建帶有GST標簽的CsBZIP40蛋白融合表達載體，經(jīng)IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）誘導表達、純化后獲得GST-CsBZIP40融合蛋白作為誘餌蛋白；然后，將GST-CsBZIP40融合蛋白固定在谷胱甘肽親和磁珠上，用固定在親和磁珠的GST-CsBZIP40誘餌蛋白與接種潰瘍病菌或LB培養(yǎng)基后柑橘葉片總蛋白進行孵育，與GST-CsBZIP40誘餌蛋白結(jié)合的蛋白復合物洗脫收集后進行SDS-PAGE凝膠電泳驗證。將驗證成功的樣品洗脫液進行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測，鑒定出未侵染和侵染狀態(tài)下CsBZIP40的互作蛋白，將檢測到的蛋白利用甜橙基因組數(shù)據(jù)庫進行注釋，篩選出在潰瘍病菌侵染過程中與CsBZIP40特異結(jié)合的蛋白，并進行GO、KEGG和互作網(wǎng)絡(luò)分析。過表達的轉(zhuǎn)基因植株表型正常，與對照植株無明顯差異。過表達的轉(zhuǎn)基因植株潰瘍病抗性評價中病斑面積、病情指數(shù)均顯著小于野生型植株，分別為野生型的45%和54%。以該轉(zhuǎn)基因植株為材料成功提取出侵染潰瘍病菌后和未接種潰瘍病菌狀態(tài)下的柑橘葉片總蛋白。成功構(gòu)建出GST-CsBZIP40誘餌蛋白表達載體，誘導表達純化出GST-BZIP40誘餌蛋白。利用GST-CsBZIP40誘餌蛋白從侵染潰瘍病菌后柑橘總蛋白和未接菌柑橘總蛋白中成功釣取蛋白，并用LC-MS/MS檢測。經(jīng)過比對、注釋和篩選，在柑橘潰瘍病菌侵染過程中與GST-BZIP40特異結(jié)合的蛋白有53個，這些蛋白參與多個分子功能和通路。在這53個蛋白中，有6個蛋白（Cs1g02310、Cs3g05280、Cs3g23950、Cs6g13880、Cs7g12130、orange1.1t04973）可能與植物抗病性密切相關(guān)。數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)證明53個蛋白中44個與CsBZIP40有直接或間接的互作關(guān)系。潰瘍病菌侵染過程中有53個蛋白與CsBZIP40互作，根據(jù)注釋6個蛋白與植物抗病性密切相關(guān)，這些蛋白可能在提高柑橘生物脅迫抗逆性方面發(fā)揮著重要的作用。

柑橘；柑橘潰瘍病；柑橘潰瘍病菌；BZIP；GST pull-down；互作蛋白

0 引言

【研究意義】柑橘產(chǎn)業(yè)在中國具有重要的經(jīng)濟地位，而病害嚴重影響著柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。柑橘潰瘍?。╟itrus bacterial canker，CBC）是主要的病害之一，它是一種由柑橘黃單胞桿菌柑橘亞種（subsp.，）所引起的檢疫性細菌病害[1]。傳統(tǒng)的防治方法具有環(huán)境污染、毀園、效果差、成本高等弊端，且無法根治[2]。培育優(yōu)良抗性品種是解決柑橘潰瘍病危害的有效途徑，而通過分子育種方法培育抗性品種是控制柑橘潰瘍病最為經(jīng)濟、有效、環(huán)保的方法。挖掘有潛力的候選基因是分子育種的重要基礎(chǔ)，CsBZIP40是一個與潰瘍病抗性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子[3]，可通過與具有轉(zhuǎn)錄激活作用的結(jié)構(gòu)域相互作用調(diào)控下游相關(guān)基因的表達[4]。對CsBZIP40調(diào)控機理的研究首先需要明確該轉(zhuǎn)錄因子是否與其他蛋白互作共同發(fā)揮功能，因此，篩選CsBZIP40響應(yīng)柑橘潰瘍病菌侵染過程中的互作蛋白很有必要?！厩叭搜芯窟M展】大部分的轉(zhuǎn)錄因子無法單獨調(diào)控基因的表達，一般情況下，幾個轉(zhuǎn)錄因子同時直接或間接地與順式作用元件結(jié)合，才能調(diào)控下游基因的表達[5]。轉(zhuǎn)錄因子間形成多聚體或與其他蛋白質(zhì)因子形成調(diào)控復合因子時首先是轉(zhuǎn)錄因子的聚集，由一個轉(zhuǎn)錄因子招募與其共同作用的轉(zhuǎn)錄因子，然后結(jié)合通用轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶形成啟動子復合物，開啟基因的轉(zhuǎn)錄。一個轉(zhuǎn)錄因子是否能夠促進基因的轉(zhuǎn)錄，必須有相關(guān)蛋白同時出現(xiàn)，而且這個轉(zhuǎn)錄因子必須處于能夠與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的狀態(tài)[5]，一些基因在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中參與多條途徑。轉(zhuǎn)錄因子在植物抵抗病原菌的反應(yīng)中起重要作用[6-7]，比如會通過識別不同的順式作用元件，影響多種基因的表達，響應(yīng)生物脅迫[8-9]。BZIP蛋白在抵抗病害、調(diào)節(jié)植物抗性應(yīng)答方面發(fā)揮著重要的作用，過表達和的轉(zhuǎn)基因植株可以提高對木薯枯萎病的抗性[10]，干擾表達水稻中的BZIP轉(zhuǎn)錄因子TGA2.1使水稻對稻瘟病抗性明顯增強[11]。GST pull-down是一種體外篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白的經(jīng)典技術(shù)[12-13]，廣泛應(yīng)用于互作蛋白的研究中。Akiyama等[14]將稻瘟病抗性相關(guān)的堿性幾丁質(zhì)酶基因RC24和苜蓿-1,3-葡萄糖酶基因-1,3-Glu同時導入水稻中，利用GST pull-down技術(shù)從水稻中分離出一個抗稻瘟病蛋白的互作蛋白；趙文等[15]應(yīng)用GST pull-down技術(shù)對抗病蛋白PID2的早期響應(yīng)蛋白進行了探索，得到31個蛋白在感病狀態(tài)下特異結(jié)合；林生等[16]使用GST pull-down技術(shù)釣取出侵染下SoSGT1的7個響應(yīng)蛋白?！颈狙芯壳腥朦c】CsBZIP40為筆者實驗室驗證的與柑橘抗?jié)儾∠嚓P(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，為了研究其生物學功能，構(gòu)建了過表達載體并轉(zhuǎn)化柑橘獲得了轉(zhuǎn)基因植株，可作為研究CsBZIP40的功能和柑橘潰瘍病菌侵染過程中CsBZIP40的互作蛋白和分子機理的試驗材料。但CsBZIP40在柑橘體內(nèi)發(fā)揮作用的分子機理尚不清晰?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對潰瘍病菌侵染過程中CsBZIP40互作蛋白的挖掘，從蛋白質(zhì)層面探明CsBZIP40在調(diào)控柑橘對潰瘍病抗性過程中發(fā)揮功能的關(guān)鍵因子，為進一步研究CsBZIP40的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子機理打下基礎(chǔ)，并為抗?jié)儾》肿佑N提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2018年在西南大學/中國農(nóng)業(yè)科學院柑桔研究所完成。

1.1 材料與試劑

試驗植物材料為過表達的晚錦橙植株葉片。供試潰瘍病菌是西南大學柑桔研究所保存的亞洲種A株系。植物總RNA提取、膠回收、反轉(zhuǎn)錄和質(zhì)粒提取采用AIDLAB公司的相關(guān)試劑盒；實時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR）使用BIORAD公司的熒光染料；T-A克隆試劑和pGEMT easy載體購自TaKaRa公司；PGEX-4T-1載體、克隆菌株Top10和BL21(DE3)原核表達菌株購于南京德泰生物。

1.2 CsBZIP40過表達植株柑橘潰瘍病抗性評價

使用引物（FCsBZIP40-1：TAACCAAGAAGGACCTG CTTTTGAT，RCsBZIP40-1：CTTTTCTTGTGATGGTTTT GCATCT）鑒定轉(zhuǎn)基因菌株。陽性菌株提取葉片總RNA并反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)基因特異性區(qū)域和柑橘內(nèi)參基因設(shè)計定量PCR引物（FCsBZIP40-2：AGTTCCCTTTGGGCATCTCG，RCsBZIP40-2：ACCATT TGCAGATCCGTCGT，F(xiàn)actin：CATCCCTCAGCACCTT CC，Ractin：CCAACCTTAGCACTTCTCC），并用qRT-PCR檢測的表達量，相對表達量采用2-ΔΔCt法（ΔCt=CtCsBZIP40-CtActin）計算，使用Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析并繪圖。于液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)柑橘潰瘍病菌至OD600nm為0.5，菌液進行離心并用LB培養(yǎng)基重懸后分裝備用；采集的葉片清洗并用75%的酒精消毒后放入超純水中沖洗，置于超凈臺；以葉脈為中心進行針刺，六針為一組，每側(cè)兩組；用移液器點樣潰瘍病菌菌液，每針孔點樣1 μL。然后將柑橘葉片的葉柄用浸濕的脫脂棉包裹，石蠟帶密封于培養(yǎng)皿，于28℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（16 h光照/8 h黑暗）。對照組用LB代替潰瘍病菌菌液，其他操作保持一致。分別在0、1、3、5 d取樣。部分葉片點菌后培養(yǎng)10 d拍照，用Image J V1.47軟件統(tǒng)計病斑面積（mm2）。按照病斑面積將病情分為0—7共8級，以字母R表示病斑面積，0級（R≤0.25 mm2），1級（0.25 mm2＜R≤0.5 mm2），2級（0.5 mm2＜R≤0.75 mm2），3級（0.75 mm2＜R≤1 mm2），4級（1 mm2＜R≤1.25 mm2），5級（1.25 mm2＜R≤1.5 mm2），6級（1.5 mm2＜R≤1.75 mm2），7級（R＞1.75 mm2）；根據(jù)公式計算病情指數(shù)：DI=100×Σ（各級病斑數(shù)×相應(yīng)級數(shù)值）/（病斑總數(shù)×最大級數(shù)）[17]。

1.3 GST-CsBZIP40融合蛋白載體構(gòu)建、表達與純化

以錦橙cDNA為模板，上游引物FCsBZIP40-3：ATGGCGAGTCACA GAATTGG（帶HI酶切位點），下游引物FCsBZIP40-3：TCA AAAGTTCGAGAAATGAT（帶I酶切位點），進行PCR擴增的CDS序列；PCR產(chǎn)物連接T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5；用HI和I酶切質(zhì)粒和表達載體PGEX-4T-1，將線性化的載體和基因片段連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)；提取陽性菌株質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中培養(yǎng)至菌液OD值為0.6，加入0.2 mmol?L-1IPTG誘導，置于15℃搖床誘導表達；全菌采用50 mmol?L-1Tris，150 mmol?L-1NaCl（pH 8.0）緩沖液（含1% Triton X-100，1 mmol?L-1DTT，1 mmol?L-1PMSF）超聲波裂解，同時以50 mmol?L-1Tris，150 mmol?L-1NaCl（pH 8.0）緩沖液平衡GST親和層析磁珠，之后用含40 mmol?L-1GSH的平衡緩沖液洗脫目標蛋白，并收集洗脫組分進行SDS-PAGE檢測；收集純度濃度相對較高的樣品，將其透析到1×PBS（pH 7.8），5% Glycerol中，透析結(jié)束后用0.22 μm過濾器過濾，分裝并保存于-80℃。采用Bradford法測定蛋白濃度，用R250染色的SDS-PAGE判斷純度。

1.4 柑橘總蛋白提取

取1 g柑橘葉片（分別接種潰瘍病菌和LB），充分研磨后加入1 mL裂解液（50 mmol?L-1Tris-HCl，50 mmol?L-1NaCl，1 mmol?L-1EDTA，1% Triston X-100，1 mmol?L-1DTT，1 mmol?L-1PMSF，pH 8.0）重懸葉片組織；4℃冰浴30 min，期間每隔5 min混勻一次，利用超聲波破碎儀在冰浴中破碎葉片組織（750W，超聲6s，間隔1s，超聲20次）；用高速冷凍離心機（12 000r/min）離心20min，取上清。取50 μL上清加50 μL 2×點樣緩沖液沸水浴5min，12 000r/min離心2min，取上清進行SDS-PAGE。

1.5 GST pull-down反應(yīng)

（1）取3個EP管標號為①、②、③，分別加入100 μL GST-磁珠到①、②、③管中，用1 mL PBS潤洗3次。將150 μg的GST-CsBZIP40誘餌蛋白（標號6）加入到①號管中，150 μg GST標簽蛋白（標號1）加入到②號管中，③號管中不做處理，將①、②、③號管中分別加入PBS補至600 μL并混合均勻，4℃層析柜孵育結(jié)合2 h；（2）將①、②號管離心后分別用PBS+1% Triton X-100洗3次，再用PBS洗3次，兩個管中分別取出50 μL GST-CsBZIP40誘餌蛋白和GST-磁珠的混合物（標號2）、GST標簽蛋白與GST-磁珠的混合物（標號7）進行SDS-PAGE驗證；（3）分別向上述①、②、③號管剩余的GST-磁珠中同時加入150 μg的潰瘍病菌侵染后柑橘葉片總蛋白（標號11），并用PBS補足液體到600 μL左右，以便蛋白之間能充分結(jié)合，4℃層析柜孵育結(jié)合2 h，離心后收集流出液體進行SDS-PAGE驗證（①、②、③號管流出液體收集后標號8、3、12）；（4）分別用PBS+1% Triton X-100洗3次，再用PBS洗3次，收集第1次的洗雜液備用，①、②、③號管洗雜液收集標號9、4、13）。然后用BBI（還原型谷胱甘肽GSH）洗磁珠，收集洗脫液進行SDS-PAGE驗證（①、②、③號管洗脫液收集后標號10、5、14）；（5）將上述標號1-14的液體分別加入50 μl 2×點樣緩沖液沸水浴5 min，12 000 r/min離心2 min，取上清采用SDS-PAGE進行檢測（泳道與收集標號一致）。未侵染潰瘍病菌柑橘GST pull-down試驗總蛋白換為未感病柑橘總蛋白即可，其他操作相同。

1.6 LC-MS/MS分析

將樣品送至南京德泰生物有限公司進行LC-MS/MS分析，質(zhì)譜結(jié)果用在線軟件MaxQuant V1.5檢索數(shù)據(jù)庫[18]，獲取在潰瘍病菌侵染過程中與CsBZIP40特異結(jié)合的蛋白序列、分子量等信息，進行后續(xù)信息學分析。

1.7 生物信息學分析

將潰瘍病菌侵染過程中特異表達的蛋白用在線軟件OmicsBean（http//www. omicsbean.cn）從分子功能方面進行GO富集分析和KEGG[19]信號通路富集分析。KEGG數(shù)據(jù)庫以文獻為基礎(chǔ)，表示分子相互作用和反應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)通路數(shù)據(jù)，包括比較全面的代謝通路圖譜。STRING[20]是一個用來共享已知或預(yù)測的蛋白相互作用的數(shù)據(jù)庫，用STRING（https://string-db.org）在線軟件進行蛋白互作驗證。

2 結(jié)果

2.1 過表達植株鑒定與評價

過表達植株表型正常，與對照植株無明顯差異（圖1-A）。以全基因組DNA為模板進行PCR，在1 000 bp和500 bp有兩條植株特征條帶出現(xiàn)，分別為擴增自基因組和轉(zhuǎn)入的外源基因，在750 bp有一條模糊條帶可能是柑橘基因組中的非特異性擴增結(jié)果（圖1-B）。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)表達量在轉(zhuǎn)基因植株中表達量相比野生型高出70倍（圖1-C）。轉(zhuǎn)基因柑橘葉片接種潰瘍病菌10 d后接種LB的葉片無菌斑生成，而接種潰瘍病菌的葉片均有潰瘍菌斑出現(xiàn)。同野生型相比，過表達植株的柑橘葉片發(fā)病輕，表現(xiàn)出一定的抗病性（圖1-D）。對病斑面積進行統(tǒng)計顯示過表達葉片上的病斑面積小于野生型葉片上的病斑面積，僅為野生型的45%（圖1-E）。病情指數(shù)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因的病情指數(shù)植株明顯低于野生型葉片上的病情指數(shù)，僅為野生型的54%（圖1-F）。上述結(jié)果表明過表達的柑橘對潰瘍病具有較高的抗性。

2.2 GST-CsBZIP40誘餌蛋白載體構(gòu)建、表達與純化

PCR擴增的編碼序列（圖2-A），用HⅠ和Ⅰ酶切的編碼序列和PGEX-4T-1表達載體，酶切產(chǎn)物連接獲得融合表達載體PGEX-CsBZIP40（圖2-B）。雙酶切驗證表達載體確認目的片段插入無誤（圖2-C）。重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10菌株，培養(yǎng)并提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化BL21(DE3)表達菌株，IPTG誘導表達GST-CsBZIP40誘餌蛋白，結(jié)果表明在0.2 mmol·L-1IPTG誘導和15℃培養(yǎng)條件下上清液中的GST-CsBZIP40蛋白表達比較均一且表達量穩(wěn)定，融合蛋白分子量82 kD（圖3-A）。通過GST瓊脂糖凝膠親和層析純化GST- CsBZIP40誘餌蛋白（圖3-B）。隨后對純化的GST- CsBZIP40誘餌蛋白進行質(zhì)檢，濃度為0.214 mg·mL-1（圖3-C），純度為90%（圖3-D）。

A：過表達CsBZIP40轉(zhuǎn)基因植株表型Phenotypes of CsBZIP40 overexpression lines。B：轉(zhuǎn)基因植株系中CsBZIP40的陽性檢測The positive detection of CsBZIP40 in transgenic lines；M：marker；1：陽性檢測條帶Positive detection band。C：過表達CsBZIP40的相對表達量The relative expression of overexpressed CsBZIP40。D：接種潰瘍病菌的轉(zhuǎn)基因植株和野生型對照葉片 Disease spots of transgenic lines and the wild-type (WT) inoculated with LB and Xcc。E：接種潰瘍病菌的轉(zhuǎn)基因植株和野生型對照病斑面積 Lesion area of transgenic lines and the wild-type inoculated with Xcc；F：接種潰瘍病菌的轉(zhuǎn)基因植株和野生型對照病情指數(shù) Disease index of transgenic lines and the wild-type inoculated with Xcc

2.3 GST pull-down

成功提取接種潰瘍病菌和未接種潰瘍病菌柑橘葉片總蛋白，然后將這兩組總蛋白分別與結(jié)合在GST-磁珠上的GST-CsBZIP40誘餌蛋白進行孵育，收集流出、洗雜、洗脫液體，上樣泳道編號與方法介紹中一致（圖4）。SDS-PAGE結(jié)果顯示GST-CsBZIP40誘餌蛋白能夠與GST-磁珠親和，吸附在GST-磁珠上的融合蛋白能夠從柑橘總蛋白中成功釣取蛋白，扣除GST標簽蛋非特異性吸附的條帶后，仍然有差異條帶，說明GST-CsBZIP40蛋白能夠從柑橘總蛋白中獲得有相互作用的未知蛋白，可以將洗脫樣做LC-MS/MS檢測，做進一步確認分析。

2.4 LC-MS/MS檢測

質(zhì)譜得到的GST-CsBZIP40的結(jié)合蛋白除去GST蛋白對照組鑒定的蛋白后，共鑒定到53個潛在的直接或間接相互作用的蛋白。這53個蛋白在柑橘潰瘍病菌侵染過程中與CsBZIP40直接或間接結(jié)合。用軟件MaxQuant V1.5檢索數(shù)據(jù)庫獲得蛋白的序列信息。使用甜橙基因組數(shù)據(jù)庫[21]對這些蛋白進行注釋，注釋出植物廣譜抗性相關(guān)蛋白（Cs1g02310）、轉(zhuǎn)錄因子（Cs3g23950）、抗病蛋白（Cs3g05280）和活性氧代謝相關(guān)蛋白（Cs6g13880）等（表1）。這些蛋白可能與CsBZIP40共同起作用以提高柑橘對潰瘍病的抗性。其中，NPR蛋白（Cs1g02310）為已經(jīng)報道過的明確與BZIP40有相互作用的蛋白，證明本試驗得到的結(jié)果可信[22]。

A：CsBZIP40的PCR擴增PCR amplification of CsBZIP40；M：2000 bp分子量標記2000 bp molecular marker；1：擴增產(chǎn)物，約1 530 bp amplified product, about 1 530 bp。B：CsBZIP40-GST融合表達載體的構(gòu)建Construction of CsBZIP40-GST fusion expression vector。C：融合表達載體的酶切驗證Enzymic digestion of CsBZIP40-GST vector；1：完整質(zhì)粒條帶the complete plasmid band；2：CsBZIP40-GST；M：10 000 bp分子量標記10 000 bp molecular marker

A：GST-CsBZIP40融合蛋白表達 Expression of GST-CsBZIP40；M1：Marker；1：無IPTG誘導表達對照Expression of GST-CsBZIP40 without IPTG；2：15℃加IPTG誘導表達IPTG and 15℃induced expression。B：誘餌蛋白純化Bait protein purification；3：全菌破碎離心后上清supernatant after centrifugation；4：上清同GST孵育后流出液supernatant after incubation with GST；M2：Marker；5、6：40 mmol?L-1洗脫GST-CsBZIP40 40 mmol?L-1 eluent GST-CsBZIP40。C：誘餌蛋白純化后濃度檢測Concentration detection after purification of bait protein；M3：SDS-PAGE Marker；7：標準BSA standard BSA；8：GST-CsBZIP40。D：誘餌蛋白純化后純度檢測Fineness detection after purification of bait protein；M4：WB Marker；9：GST-CsBZIP40

A：感染潰瘍病菌的葉片總蛋白GST pull-down結(jié)果The GST pull-down from total protein of leaves infected by Xcc；B：未感染潰瘍病菌的葉片總蛋白GST pull-down結(jié)果The GST pull-down from total protein of leaves infected by LB medium

表1 抗病相關(guān)的CsBZIP40互作蛋白

2.5 CsBZIP40互作蛋白GO富集分析

對質(zhì)譜得到的蛋白用OmicsBean在線軟件從分子功能層面進行GO功能富集分析，證明這些蛋白的功能主要集中在分子功能。分子功能的前10個GO分別與結(jié)構(gòu)分子活性（7個）、色素結(jié)合（4個）、蛋白質(zhì)結(jié)合（20個）、核糖體結(jié)構(gòu)成分（6個）、蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合（6個）、硫氧還蛋白過氧化物酶活性（1個）、葉黃素結(jié)合（1個）、葉綠素結(jié)合（4個）、mRNA結(jié)合（4個）、Delta24甾醇還原酶活性（1個）有關(guān)或相關(guān)（圖5-A）。在這些分子功能富集中，20個蛋白與蛋白結(jié)合有關(guān)，提示與CsBZIP40結(jié)合的蛋白主要參與了蛋白結(jié)合調(diào)控過程。從這53個蛋白的功能富集網(wǎng)絡(luò)可以看出許多基因參與了幾個不同的功能，比如Cs2g19680參與了蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、色素結(jié)合和葉綠素結(jié)合等多個功能（圖5-B）。

2.6 CsBZIP40互作蛋白的KEGG分析

＜0.05時，有3個可信度較高的富集通路，分別為淀粉和蔗糖代謝通路、光合作用天線蛋白通路和核糖體通路（圖6-A）。這3個通路中淀粉和蔗糖代謝通路與光合作用天線蛋白通路屬于代謝相關(guān)的通路，而核糖體通路則與遺傳信息相關(guān)（圖6-B）。有5個基因參與淀粉和蔗糖代謝通路、11個基因參與光合作用天線蛋白通路、6個基因參與核糖體通路，而且每個代謝通路中的幾個蛋白之間也往往存在相互作用（圖6-C）。KEGG結(jié)果表明CsBZIP40的互作蛋白可能在代謝、光合以及能量轉(zhuǎn)換與利用方面發(fā)揮重要的作用。

A：CsBZIP40互作蛋白GO分子功能富集分析GO molecular functional enrichment analysis of CsBZIP40 interacting proteins；B：CsBZIP40互作蛋白GO分子功能蛋白互作分析GO molecular functional protein interaction analysis of CsBZIP40 interacting proteins

2.7 蛋白互作分析

用CsBZIP40的53個互作蛋白序列同模式植物擬南芥的蛋白互作數(shù)據(jù)庫進行比對，挖掘與CsBZIP40同源的TGA9相互作用的蛋白（圖7）。互作網(wǎng)絡(luò)顯示53個蛋白中與TGA9直接或間接結(jié)合的蛋白有44個已經(jīng)得到數(shù)據(jù)支持，證明了本研究的可靠性。有9個蛋白在數(shù)據(jù)庫中尚無數(shù)據(jù)支撐。在這44個蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)中有15個基因處于重要節(jié)點位置，它們與較多的蛋白存在相互作用，比如蛋白AT5G27850與其他6個蛋白存在相互作用；蛋白CR88與其他10個蛋白存在相互作用。這些節(jié)點蛋白在響應(yīng)柑橘潰瘍病菌侵染的過程中可能發(fā)揮著重要的作用，節(jié)點蛋白CR88是一個熱休克蛋白，植物正常生長狀態(tài)下組織中很少能檢測到熱休克蛋白的表達，而在脅迫下會有大量熱休克蛋白表達，因此熱休克蛋白在植物抵抗外界脅迫中具有重要意義[23]。同時與之互作的蛋白MYB[24]、NPR1[22]均與植物抵抗生物脅迫密切相關(guān)。CR88蛋白與多個廣譜抗性蛋白互作，在柑橘體內(nèi)協(xié)同發(fā)揮作用，共同抵抗?jié)儾【鷮C體的侵染。

A：CsBZIP40互作蛋白KEGG信號通路分析KEGG signaling pathway analysis of CsBZIP40 interacting proteins；B：可信信號通路基因數(shù)量統(tǒng)計 Gene quantity statistics of trusted signaling pathway；C：信號通路蛋白互作分析interaction analysis of signaling pathway protein

節(jié)點代表潰瘍病菌侵染過程中CsBZIP40的結(jié)合蛋白，圓圈中的圖案為預(yù)測的蛋白三級結(jié)構(gòu)，空白表示三級結(jié)構(gòu)未知。不同顏色的連線表示不同數(shù)據(jù)來源The circle in the figure is the binding protein of CsBZIP40. The pattern in the circle is the predicted protein tertiary structure, and the blank indicates that the tertiary structure is unknown. Line segments indicate that there is a clear link between the two proteins that has been proven or reported

3 討論

植物在漫長的進化過程中逐漸形成了一系列復雜而有效的識別和保護機制來抵抗病原菌的侵染[23]，主要包括植物抗病基因介導的侵染部位細胞程序性死亡、超敏反應(yīng)與系統(tǒng)獲得抗性等[25-27]。擬南芥中BZIP（TGA）轉(zhuǎn)錄因子在免疫反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中處于重要的位置，在前人的研究中發(fā)現(xiàn)，BZIP轉(zhuǎn)錄因子上游受到NPR（non-expressor of PR gene）基因的調(diào)控，NPR基因在植物的系統(tǒng)獲得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）響應(yīng)中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[28]，NPR蛋白與TGA蛋白互作調(diào)控下游基因的表達[29]。CsBZIP40是柑橘中一個重要轉(zhuǎn)錄因子[30]，前期對CsBZIP40的功能研究與分析發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子與柑橘潰瘍病抗性明顯相關(guān)，柑橘基因組中轉(zhuǎn)錄因子CsBZIP40與擬南芥中TGA9高度同源，均屬于在病菌防御方面發(fā)揮作用的D亞家族[31]。CsBZIP40作為下游基因的調(diào)控因子[32-35]，對植物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)揮著重要的作用。本研究中，對過表達柑橘植株的抗?jié)儾≡u價結(jié)果表明過表達能顯著提高柑橘對潰瘍病的抗性，但機理尚不明確。本文從蛋白質(zhì)層面入手，利用GST pull-down技術(shù)獲取與CsBZIP40蛋白直接作用的蛋白，篩選出柑橘潰瘍病菌侵染過程中的結(jié)合蛋白，對解析CsBZIP40的調(diào)控機理具有重要意義。

對潰瘍病菌侵染過程中特異表達的53個蛋白結(jié)合相關(guān)的數(shù)據(jù)庫檢索、生物信息學預(yù)測、比對和功能分析，結(jié)果表明與數(shù)據(jù)庫中得到的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中部分重合，證明了該研究的準確性，同時豐富了數(shù)據(jù)庫。GO注釋顯示，這53個蛋白的功能主要歸類為能量代謝、光合作用以及植物抗逆相關(guān)蛋白。其中Cs1g02310、Cs3g05280、Cs3g23950、Cs6g13880、Cs7g12130、orange1.1t04973可能與柑橘抗病抗逆性密切相關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子會通過上調(diào)或下調(diào)下游相關(guān)基因的表達來實現(xiàn)對某一過程的調(diào)控[36]，CsBZIP40轉(zhuǎn)錄因子如何實現(xiàn)的這個調(diào)控尚不明確，直接調(diào)控還是間接調(diào)控也不明晰。在這個過程中，一些與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的蛋白可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示，潰瘍病菌侵染過程中特異表達的某些蛋白可能在柑橘抵抗?jié)儾【倪^程中發(fā)揮著重要的作用，比如Cs3g05280在感染潰瘍病中特異結(jié)合，此蛋白在其他物種中的同源基因幾乎都參與抗病反應(yīng)，在植物抗逆過程中起著重要的作用；Cs1g02310與擬南芥中TGA1高度同源，NPR1和TGA1是植物體內(nèi)獲得系統(tǒng)抗性的關(guān)鍵氧化還原調(diào)控因子[37]；Cs6g13880是編碼Peroxiredoxin-2酶的基因，過氧化物酶是一類清除生物體內(nèi)活性氧的重要的酶，與提高植物抗逆性密切相關(guān)[38]；活性氧在植物局部和整體防御反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用[39]。因此，這兩個基因（Cs1g02310、Cs6g13880）在提高轉(zhuǎn)基因植株潰瘍病抗性中可能發(fā)揮著重要的作用。還有部分基因能夠提高柑橘對惡劣環(huán)境的耐受性，比如Cs3g05280與同源性較高，過表達能夠提高擬南芥對滲透脅迫的耐受性[30]；Cs7g12130編碼熱休克蛋白，熱休克蛋白是植物逆境條件下產(chǎn)生的應(yīng)激蛋白，通過分子伴侶保護機制保護逆境中的細胞，從而提高植物對逆境的忍耐力[40]；Cs7g15030與油菜素甾類生物合成相關(guān)，油菜素甾類能誘導H2O2的積累，增強植物抗氧化性[41]。這些蛋白在柑橘抵抗?jié)儾【鷷r，能夠增強柑橘本身的防御功能，延緩發(fā)病時間，減輕發(fā)病癥狀，從而表現(xiàn)出過表達轉(zhuǎn)基因植株對潰瘍病的抗性。

4 結(jié)論

BZIP40屬于病原菌抗性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，過表達轉(zhuǎn)基因晚錦橙表現(xiàn)出對潰瘍病的抗性。GST pull-down聯(lián)合LC-MS/MS篩選出53個在感染潰瘍病菌過程中與CsBZIP40互作的蛋白，這些蛋白包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白、植物抗病性蛋白、細胞壁合成調(diào)控蛋白、過氧化物酶、細胞程序性死亡調(diào)控蛋白等，參與不同的分子功能和代謝通路，在響應(yīng)柑橘潰瘍病菌的侵染過程中與CsBZIP40協(xié)同發(fā)揮作用。

[1] 姚廷山, 周彥, 周常勇. 柑橘潰瘍病分化及其研究進展. 園藝學報, 2015, 42(9): 1699-1706.

YAO T S, ZHOU Y, ZHOU C Y. Research development of the differentiation and control of citrus bacterial canker disease., 2015, 42(9): 1699-1706. (in chinese)

[2] BEHLAU F, CANTEROS B I, MINSAVAGE G V, JONES J B, GRAHAM J H. Molecular characterization of copper resistance genes fromsubsp.andsubsp.., 2011, 77(12): 4089-4096.

[3] 賈瑞瑞, 周鵬飛, 白曉晶, 陳善春, 許蘭珍, 彭愛紅, 雷天剛, 姚利曉, 陳敏, 何永睿, 李強. 柑橘響應(yīng)潰瘍病菌轉(zhuǎn)錄因子CsBZIP40的克隆及功能分析. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2017, 50(13): 2488-2497.

JIA R R, ZHOU P F, BAI X J, CHEN S C, XU L Z, PENG A H, LEI T G, YAO L X, CHEN M, HE Y R, LI Q. Gene cloning and expression analysis of canker-related transcription factor CsBZIP40 in citrus., 2017, 50(13): 2488-2497. (in chinese)

[4] 劉武, 戴良英. 植物抗逆相關(guān)ERF轉(zhuǎn)錄因子研究綜述.中國農(nóng)學通報, 2007, 23(4): 78-81.

LIU W, DAI L Y. ERF transcription factors related to plant stress-tolerance., 2007, 23(4): 78-81. (in chinese)

[5] LEHTI-SHIU M, PANCHY N,WANG P P, UYGUN S, SHIU S H. Diversity, expansion, and evolutionary novelty of plant DNA-binding transcription factor families., 2017, 1860(1): 3-20.

[6] MOLINA L, KAHMANN R. Angene involved in H2O2detoxification is required for virulence., 2007, 19(7): 2293-2309.

[7] LIN C H, YANG S L, CHUNG K R. The YAP1 homolog-mediated oxidative stress tolerance is crucial for pathogenicity of the necrotrophic fungusin citrus., 2009, 22(8): 942-952.

[8] LIAO Y, ZOU H F, WEI W, HAO Y J, TIAN A G, HUANG J, LIU Y F, ZHANG J S, CHEN S Y. Soybean,andgenes function as negative regulator of ABA signaling and confer salt and freezing tolerance in transgenic., 2008, 228(2): 225-240.

[9] Amorim L L B, da Fonseca Dos Santos R, Neto J P B, Guida-Santos M, Crovella S, Benko-Iseppon A M. Transcription factors involved in plant resistance to pathogens., 2017, 18(4): 335-351.

[10] LI X L, FAN S H, HU W, LIU G Y, WEI Y X, HE C Z, SHI H T. Two cassava basic leucine zipper (bZIP) transcription factors (MebZIP3 and MebZIP5) confer disease resistance against cassava bacterial blight., 2017, 8: Article 2110.

[11] FITZGERALD H A, CANLAS P E, CHERN M S, RONALD P C. Alteration of TGA factor activity in rice results in enhanced tolerance topv.., 2005, 43: 335-347.

[12] WANG H, ZENG X. Analysing protein-protein interactions using a GST-fusion protein to pull down the interacting target from the cell lysate., 2000, 5(1): 26-30.

[13] REN L, CHANG E, MAKKY K, HAAS A L, KABOORD B, QORONFLEH M W. Glutathione-transferase pull-down assays using dehydrated immobilized glutathione resin., 2003, 322(2): 164-169.

[14] Akiyama T, PILLAI M A, SENTOKU N. Cloning, characterization and expression of, a rice endo-1,3--glucanase gene regulated developmentally in flowers and hormonally in germinating seeds., 2004, 220(1): 129-139.

[15] 趙文, 王靜, 李偉滔, 王靜, 李曉冰, 朱立煌, 陳學偉. 應(yīng)用GST pull-down技術(shù)篩選水稻抗稻瘟病蛋白PID3互作蛋白的研究. 植物病理學報, 2015, 45(5): 476-485.

ZHAO W, WANG J, LI W T, WANG J, LI X B, ZHU L H, CHEN X W. Screening of rice proteins interacting with the rice blast resistance protein PID3 by GST pull-down., 2015, 45(5): 476-485. (in chinese)

[16] 林生, 陳婷, 周明明, 陳觀水, 林文雄. 果蔗SoSGT1與侵染下果蔗葉片蛋白的互作研究. 熱帶亞熱帶植物學報, 2015, 23(3): 252-261.

LIN S, CHEN T, ZHOU M M, CHEN G S, LIN W X. Studies on interaction between SoSGT1 and proteins in leaves of chewing cane infected by., 2015, 23(3): 252-261. (in chinese)

[17] CHEN M, HE Y R, XU L Z, PENG A H, LEI T G, YAO L X, LI Q, ZHOU P F, BAI X J, DUAN M J, JIANG X Y, JIA R R, ZOU X P, CHEN S C. Cloning and expression analysis of citrus genesandresponding topv.infection., 2016, 2(4): 193-202.

[18] COX J, MANN M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification., 2008, 26(12): 1367-1372.

[19] KANEHISA M, SATO Y, FURUMICHI M, MORISHIMA K, TANNBE M. New approach for understanding genome variations in KEGG., 2018, 47(Database issue): D590-D595.

[20] SZKLARCZYK D, MORRIS J H, COOK H, KUHN M, WYDER S, SIMONOVIC M, SANTOS A, DONCHEVA N T, ROTH A, BORK P, JENSEN L J, MERING C. The STRING database in 2017: quality- controlled protein-protein association networks, made broadly accessible., 2017, 45(Database issue): D362-D368.

[21] XU Q, CHEN L L, RUAN X A, CHEN D J, ZHU A D, CHEN C L, BERTRAND D, JIAO W B, HAO B H, LYON M P, CHEN J J, GAO S, XING F, LAN H, CAHNG J W, GE X H, LEI Y, HU Q, MIAO YIN, WANG L, XIAO S X, BISWAS M K, ZENG W F, GUO F, CAO H B, YANG X M, XU X W, CEHNG Y J, ZHANG J, ROOSE M L, NAGARAJAN N, DENG X X, Ruan y. The draft genome of sweet orange ()., 2013, 45(1): 59-66.

[22] LINDERMAYR C, SELL S, MULLER B, LEISTER D, DURNER J. Redox regulation of the NPR1-TGA1 system ofby nitric oxide., 2010, 22(8): 2894-2907.

[23] SAFDAR W, MAJEED H, ALI B, HAVEED I. Molecular evolution and diversity of small heat shock proteins genes in plants., 2012, 44(special issue): 211-218.

[24] RAFFAELE S, RIVAS S, ROBY D. An essential role for salicylic acid in AtMYB30-mediated control of the hypersensitive cell death program in., 2006, 580(14): 3498-3504.

[25] Naseem M, Kaltdorf M, Dandekar T. The nexus between growth and defense signaling: auxin and cytokinin modulate plant immune response pathways., 2015, 66(16): 4885-4896.

[26] FEYS B J, PARKER J E. Interplay of signaling pathways in plant disease resistance., 2000, 16(10): 449-455.

[27] DANGL J L, JONES J D. Plant pathogens and integrated defense responses to infection., 2001, 411(6839): 826-833.

[28] MEUR G, BUDATHA M, CUPTA A D, PRAKASH S, KIRTI P B. Differential induction of NPR1 during defense responses in., 2006, 68(4): 128-137.

[29] MOU Z L, FAN W H, DONG X N. Inducers of plant systemic acquired resistance regulate NPR1 function through redox changes., 2003, 113(7): 935-944.

[30] DESPRES C, DELONG C, GLAZE S, LIU E W, FOBERT P R. TheNPR1/NIM1 protein enhances the DNA binding activity of a subgroup of the TGA family of bZIP transcription factors., 2000, 12(2): 279-290.

[31] JAKOBY M, WEISSHAAR B, DROGE-Laser W, Vicente- Carbajosa J, TIEDEMANN J, Kroj T, Parcy F. BZIP transcription factors in., 2002, 7(3): 106-111.

[32] BARAH P, WINGE P, KUSNIERCZYK A, TRAN D H, BONES A M. Molecular signatures inin response to insect attack and bacterial infection., 2013, 8(3): e58987.

[33] PERSAK H, PITZSCHKE A. Tight interconnection and multi-level control ofMYB44 in MAPK cascade signaling., 2013, 8(2): e57547.

[34] NIJHAWAN A, JAIN M, TYAGI A K, KHURANA J P. Genomic survey and gene expression analysis of the basic leucine zipper transcription factor family in rice., 2008, 146(2): 333-350.

[35] LIU J Y, CHEN N N, CHEN F, CAI B, SANTO S, TORNIELLI G B, PEZZOTTI M, CHENG Z M. Genome-wide analysis and expression profile of the bZIP transcription factor gene family in grapevine ()., 2014, 15: 281.

[36] CHEN X H, BARNABY J, SREEDHARAN A, HUANG X, OrboviC V, Grosser J W, Wang N, dong x, song w y. Over-expression of the citrus geneconfers resistance to bacterial canker disease., 2013, 84: 115-122.

[37] ORGEUR M, MARTENS M, LEONTE G, NASSARI S, BONNIN M A, BORNO S T, TIMMERMANN B, HECHT J, DUPREZ D, STRICKER S. Genome-wide strategies identify downstream target genes of chick connective tissue-associated transcription factors., 2018, 145: dev.161208.

[38] WOOD Z A, POOLE L B, KARPLUS P A. Peroxiredoxin evolution and the regulation of hydrogen peroxide signaling., 2003, 300(5619): 650-653.

[39] DELLEDONNE M, XIA Y J, DIXON R A, LAMB C. Nitric oxide functions as a signal in plant disease resistance., 1998, 394(6693): 585-588.

[40] Al-Whaibi M H. Plant heat-shock proteins: A mini review., 2011, 23(2): 139-150.

[41] ZHANG A, ZHANG J, YE N H, CAO J, TAN M, ZAHNG J, JIANG M. ZmMPK5 is required for the NADPH oxidase-mediated self- propagation of apoplastic H2O2in brassinosteroid-induced antioxidant defence in leaves of maize., 2010, 61(15): 4399-4411.

Screening of Interacting Proteins of Anti-Canker transcription Factor CsBZIP40 in Citrus by GST pull-down combined with LC-MS/MS

DOU WanFu, QI JingJing, HU AnHua, CHEN ShanChun, PENG AiHong, XU LanZhen, LEI TianGang, YAO LiXiao, HE YongRui, LI Qiang

(Citrus Research Institute, Southwest University/Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712)

CsBZIP40 is a citrus canker-related transcription factor. The objective of this study is to screen the interacting proteins of CsBZIP40 in response tosubsp.() infection, and to analyze the interaction network of CsBZIP40, so as to provide a theoretical basis for molecular breeding of citrus canker resistance.The GST pull-down strategy was used to screen the interacting proteins of CsBZIP40 in the infection process of. Firstly, the vector of GST-CsBZIP40 was constructed and induced by IPTG (isopropyl-D-thiogalactoside). The fusion protein of GST-CsBZIP40 was purified for the next GST pull-down. Then GST-CsBZIP40 was fixed on the GST-beads and incubated with total proteins extracted fromover-expression plants infected byor LB medium as control. The protein complex bound to GST-CsBZIP40 bait protein was eluted and collected, and then verified by SDS-PAGE gel electrophoresis. The interacting proteins of CsBZIP40 were detected by LC-MS/MS and then annotated based on the genomic database of. The GO, KEGG pathways and the interaction network of the interacting proteins were also analyzed.The phenotype of transgenic plants over-expressionwas normal, and there was no significant difference between the transgenic plants and the control plants. The lesion area on the over-expression plant was significantly smaller compared to that on the wild-type (WT) (45%) and the disease index ofover-expression plant was significantly lower than that of WT (54%). The total proteins were successfully extracted fromover-expression plant infected byor LB medium, and the GST-CsBZIP40 was expressed and purified for the GST pull-down. GST-CsBZIP40 bait protein was used to catch the protein from the total proteins of-infected and uninfected citrus, then the protein was detected by LC-MS/MS.After comparison, annotation and screening, there are 53 interacting proteins specifically binding to GST-BZIP40 in the process ofinfection. These proteins are involved in many molecular functions and pathways. Among the 53 proteins, 6 proteins (Cs1g02310, Cs3g05280, Cs3g23950, Cs6g13880, Cs7g12130, orange1.1t04973) may be closely related to the plant disease resistance, 44 of the 53 proteins have been proven to interact directly or indirectly with CsBZIP40 in the database.In the infection of, 53 proteins interacted with CsBZIP40 were detected. According to the annotation, 6 proteins are closely related to plant disease resistance. These proteins may play an important role in improving the stress resistance of citrus under biological stress.

; citrus bacteria canker;subsp.(); BZIP; GST pull-down; interacting protein

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.13.005

2019-03-12；

2019-04-03

國家重點研發(fā)計劃（2018YFD1000306，2018YFD0201503）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費（SWU115025）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)資金（CARS-26）、廣西科技重大專項（桂科AA18118046-6）、重慶市社會事業(yè)與民生體系保障科技創(chuàng)新專項（cstc2016shms-ztzx80001，cstc2017shms-xdny80051）

竇萬福，E-mail：douwanfu@foxmail.com。

李強，E-mail：liqiang@cric.cn。通信作者何永睿，E-mail：heyongrui@cric.cn

（責任編輯 岳梅）