代紅翠，張慧，薛艷芳，高英波，錢欣，趙海軍，成浩，李宗新，劉開昌

不同耕作和秸稈還田下褐土真菌群落變化特征

代紅翠1,3，張慧2,3，薛艷芳2,3，高英波2,3，錢欣2,3，趙海軍3，成浩4，李宗新2,3，劉開昌1,3

（1山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，濟(jì)南 250100；2山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，濟(jì)南 250100；3小麥玉米國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100；4青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東青島 266109）

【】研究華北平原地區(qū)小麥-玉米周年復(fù)種模式下不同耕作和秸稈還田方式對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及功能的影響，并探索農(nóng)田土壤肥力對(duì)耕作和秸稈還田方式響應(yīng)差異的生物學(xué)機(jī)制，為優(yōu)化耕作與秸稈還田方式和提高農(nóng)田土壤肥力提供理論依據(jù)。本研究以華北平原小麥-玉米周年復(fù)種農(nóng)田土壤為研究對(duì)象，采用Miseq高通量測(cè)序技術(shù)，結(jié)合FUNGuild真菌功能預(yù)測(cè)工具，分析3種耕作方式（免耕、深耕與旋耕）與兩種秸稈還田方式（麥秸單季還田與小麥-玉米秸稈雙季還田）定位試驗(yàn)條件下，小麥成熟期土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與功能的差異，結(jié)合土壤理化性質(zhì)，進(jìn)一步探究農(nóng)田土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及功能變化的環(huán)境驅(qū)動(dòng)因子。與免耕雙季還田相比，深耕秸稈雙季還田與深耕單季還田0—10 cm耕層土壤有機(jī)碳含量分別降低35.04%和44.30%；免耕秸稈單季還田10—20 cm耕層土壤中堿解氮含量顯著低于其他處理。農(nóng)田土壤0—10 cm土層真菌主要包含子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和壺菌門(Chytridiomycota)，相對(duì)豐度分別為68.98%、16.96%和1.62%；10—20 cm土層真菌主要包含子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、壺菌門(Chytridiomycota)和球囊菌門(Glomeromycota)，相對(duì)豐度分別為68.44%、15.52%、1.51%和1.23%。不同處理土壤真菌群落結(jié)構(gòu)存在差異，與秸稈單季還田相比，秸稈雙季還田0—10 cm和10—20 cm土層擔(dān)子菌門(Basidiomycota)相對(duì)豐度分別提高了50.07%和29.08%。進(jìn)一步分析土壤群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的原因，結(jié)果顯示0—10 cm土層土壤真菌群落多元回歸樹第一次分割以土壤有機(jī)碳為節(jié)點(diǎn)，其閾值為11.17 g·kg-1，旋耕雙季還田和免耕雙季還田與其他處理分離；10—20 cm土層土壤真菌群落多元回歸樹第一次分割以堿解氮為節(jié)點(diǎn)，其閾值為6.52 mg·kg-1，免耕單季還田與其他處理分離。從營(yíng)養(yǎng)類型看，各處理0—10 cm（26.84%）和10—20 cm（23.91%）土層土壤真菌均以病理營(yíng)養(yǎng)型為主；與免耕相比，深耕和旋耕處理0—10 cm土層病理營(yíng)養(yǎng)型真菌相對(duì)豐度分別顯著降低25.16%和16.45%，且以深耕單季還田最低。病理營(yíng)養(yǎng)型真菌相對(duì)豐度與土壤有機(jī)碳、可溶性有機(jī)碳、全氮、堿解氮和速效鉀含量均呈顯著正相關(guān)關(guān)系。不同耕作與秸稈還田方式改變了農(nóng)田土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及功能，土壤有機(jī)碳和堿解氮的改變是影響真菌群落組成的主要因素；深耕能夠降低秸稈還田后土壤病理營(yíng)養(yǎng)型真菌相對(duì)豐度，利于保持農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)健康。

耕作方式；秸稈還田；土壤真菌群落；高通量測(cè)序；多元回歸樹

0 引言

【研究意義】耕地質(zhì)量下降是中國(guó)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要限制性因素[1]。在以小麥-玉米周年種植制度為主的華北平原，長(zhǎng)期的集約化種植使耕層淺薄化、土壤緊實(shí)化、養(yǎng)分利用率較低等一系列土壤健康問題尤為突出[2]。這可能是由傳統(tǒng)耕作措施（如翻耕、移除秸稈、過度施用化肥等）使表土暴露，破壞了土壤結(jié)構(gòu)，引起耕地質(zhì)量下降[3-4]。目前，耕作方式優(yōu)化與秸稈還田被當(dāng)作是現(xiàn)階段該地區(qū)農(nóng)田土壤肥力提升的重要措施[5]。一般認(rèn)為，不同耕作、施肥和管理方式等可能引起土壤微生物群落和功能的變化。土壤微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用，80%—90%的土壤相關(guān)功能由微生物調(diào)節(jié)，包括土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化，土壤系統(tǒng)的穩(wěn)定性及抗干擾能力等[6]。真菌構(gòu)成了大部分微生物生物量，具有促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)循環(huán)，并且參與毒物降解和作物病害發(fā)生等重要的土壤生態(tài)過程[7]，是維持生態(tài)系統(tǒng)功能的基礎(chǔ)和生態(tài)系統(tǒng)健康的指示物[8]。因此，研究華北平原小麥玉米周年種植制度下，耕作措施和秸稈還田方式下真菌群落、功能變化及其驅(qū)動(dòng)因素對(duì)提升農(nóng)田土壤肥力具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】耕作方式作為重要的農(nóng)田管理措施影響農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境[9]，合理的耕作與秸稈還田方式可以有效地增加土壤有機(jī)質(zhì)含量，為土壤微生物的生長(zhǎng)與繁殖提供豐富的養(yǎng)分資源[10]。WANG等[11]在西北土中研究發(fā)現(xiàn)，耕作方式通過影響土壤顆粒機(jī)械組成和養(yǎng)分含量，進(jìn)而影響土壤子囊菌門和擔(dān)子菌門的分布水平。SUN等[12]通過磷脂脂肪酸法（PLFA）研究認(rèn)為在東北黑土中免耕比翻耕更有利于增加表層土壤微生物生物量，且在表層形成以真菌為優(yōu)勢(shì)種群的群落，利于真菌的生長(zhǎng)。郭梨錦等[13]在湖北小麥-水稻輪作農(nóng)田中免耕顯著降低真菌和革蘭氏陰性菌的生物量以及真菌/細(xì)菌，長(zhǎng)期免耕和秸稈還田有利于提高土壤微生物多樣性?？梢?，耕作與秸稈還田方式影響農(nóng)田土壤真菌群落生物量與群落組成。目前，關(guān)于農(nóng)田不同耕作與秸稈還田方式對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與功能的影響研究并不完善。應(yīng)用Illumina MiSeq高通量測(cè)序可以在種水平研究真菌群落組成，但很難解讀真菌的功能[14]。此外，基于PLFA法可以對(duì)主導(dǎo)作用的功能型真菌進(jìn)行分類比較，但更側(cè)重微生物群落的總體分析，總體種類較少，數(shù)據(jù)量相對(duì)較小[15]。【本研究切入點(diǎn)】合理的耕作與秸稈還田方式能夠改善土壤水、肥、氣、熱等條件，促進(jìn)土壤微生物生長(zhǎng)，是改善土壤肥力狀況的重要措施。然而，土壤真菌群落及功能對(duì)不同耕作和秸稈還田方式的響應(yīng)差異，尤其是不同耕作和秸稈還田方式影響了哪些關(guān)鍵養(yǎng)分指標(biāo)，進(jìn)而調(diào)控了土壤真菌群落與功能，亟需進(jìn)行深入研究。本研究采用高通量測(cè)序法對(duì)土壤真菌群落多樣性進(jìn)行比較，并結(jié)合FUNGuild工具預(yù)測(cè)真菌功能營(yíng)養(yǎng)型，系統(tǒng)比較不同耕作與秸稈還田方式對(duì)農(nóng)田土壤真菌群落和功能的影響研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文基于華北平原小麥-玉米周年復(fù)種多年定位試驗(yàn)，采用Miseq高通量測(cè)序，基于FUNGuild對(duì)真菌序列進(jìn)行功能分類，研究土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及功能對(duì)不同耕作和秸稈還田方式的響應(yīng)差異，并結(jié)合土壤理化性狀揭示其驅(qū)動(dòng)因素，以期闡明不同耕作和秸稈還田方式影響華北農(nóng)田土壤肥力的生物學(xué)機(jī)制，為華北平原農(nóng)田土壤地力提升提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

定位試驗(yàn)設(shè)于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所龍山試驗(yàn)基地（117°32′E，36°43′N）。該試驗(yàn)基地位于華北平原典型小麥玉米一年兩熟輪作區(qū)，土壤類型為褐土，屬于典型溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年均日照時(shí)數(shù)2 647.6 h，年均氣溫12.8℃，年均降雨量600.8 mm，無霜期209 d。試驗(yàn)地土壤有機(jī)質(zhì)為14.81 g·kg-1，全氮為0.85 g·kg-1，有效磷為19.26 mg kg-1，速效鉀為46.37 mg kg-1，pH為7.64。

自2012年10月，設(shè)置大田裂區(qū)試驗(yàn)，主因素為小麥播前免耕（NT）、深耕（DT）和旋耕（RT）3種耕作方式（玉米均為貼茬免耕直播）；副因素為小麥-玉米秸稈雙季秸稈還田（DS）和小麥秸稈單季還田（SS），共6個(gè)處理（表1）。每個(gè)處理3次重復(fù)，共18個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積為6 m×45 m =270 m2。小麥品種為濟(jì)麥22，播量172.5 kg·hm-2，播種方式為寬幅精播；玉米品種為魯單9066，行距60 cm，種植密度為75 000株/hm2。在小麥播種前，施用600 kg·hm-2復(fù)合肥（N﹕P2O5﹕K2O為17﹕17﹕17）作基肥，小麥拔節(jié)期追施尿素225 kg·hm-2。在玉米播種前，施用600 kg·hm-2復(fù)合肥（N﹕P2O5﹕K2O為17﹕17﹕17）作基肥，在玉米大口期追施尿素225 kg·hm-2。

1.2 樣品采集

于2017年6月小麥?zhǔn)斋@期，小區(qū)“S”形5點(diǎn)采集0—10 cm 和10—20 cm 耕層土壤樣品。同小區(qū)同土層樣品混為一個(gè)土樣，用冰盒保存并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。剔去植物根和小石塊等雜質(zhì)后，部分樣品凍存于-80℃冰箱中，用于土壤微生物分析，部分鮮土樣用于測(cè)定土壤可溶性有機(jī)碳（DOC），部分樣品自然風(fēng)干后過0.25 mm和1 mm篩測(cè)定土壤養(yǎng)分指標(biāo)，剩余樣品-80℃冷藏測(cè)定土壤真菌群落。

1.3 測(cè)定方法

采用重鉻酸鉀-容量法測(cè)定土壤有機(jī)碳（TOC），凱氏定氮法測(cè)定全氮（TN），堿解氮（AN）采用堿解擴(kuò)散法，有效磷（AP）采用鉬銻抗分光光度法，速效鉀（AK）采用火焰光度法。以上測(cè)定方法均參考《土壤農(nóng)化分析》[16]。pH測(cè)定采用電位法，水土比為5﹕1。

表1 不同耕作與秸稈還田方式處理

土壤真菌群落的18S rRNA測(cè)序土壤DNA提取使用DNA提取試劑盒（OMEGA，美國(guó)），提取方法參照說明書。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提基因組DNA的純度和完整性。使用NanoDrop ND-2000分光光度計(jì)（NanoDrop，ND2000，Thermo Scientific，Wilmington）測(cè)定所提DNA的濃度與純度。選用真菌18S通用引物0817F:5'-TTAGCATGGAATAATRRAA TAGGA-3'，1196R: 5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC -3'進(jìn)行擴(kuò)增[17]，選用TransGen AP221-02試劑盒，擴(kuò)增體系為20 μL，包括4 μL的5×FastPfu Buffer，2 μL的2.5 mmol·L-1dNTPs，引物（5 μmol·L-1）各0.8 μL，0.4 μL的FastPfu Polymerase和10 ng模板DNA。 擴(kuò)增條件為95℃解鏈2 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s, 72℃ 30 s，25個(gè)循環(huán)，再72℃延伸5 min，于ABI GeneAmp? 9700型PCR儀上進(jìn)行。每個(gè)樣本3次重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收擴(kuò)增子，依照AxyPrep DNA Gel Extraction Kit說明書進(jìn)行純化（Axygen Biosciences, Union City, U.S.），再用QuantiFluorTM-ST（Promega, U.S.）進(jìn)行定量。采用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行雙端進(jìn)行測(cè)序，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供技術(shù)支持。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

經(jīng)過QIIME（v1.8.0）軟件過濾、拼接、去除嵌合體后[18-19]，聚類為用于物種分類的OTU（Operational Taxonomic Units），并將所有樣品進(jìn)行抽平。采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析[20]，置信度閾值為0.7，選用Silva（Release128 http://www.arb-silva.de）數(shù)據(jù)庫[21]，得到分類學(xué)信息。利用Mothur軟件（Version 1.31.2）進(jìn)行α多樣性分析[22]。基于Unifrace距離進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)分析[23]。

根據(jù)“1SE”準(zhǔn)則，最小交叉驗(yàn)證相對(duì)誤差值來確定分類結(jié)果，能很好地反映異質(zhì)環(huán)境下群落的結(jié)構(gòu)特征[24]，使用R 3.5.1軟件運(yùn)行mvpart和MVPARTwrap程序包運(yùn)行并繪制多元回歸樹。使用Python 3.7進(jìn)行真菌功能類群FUNGuild數(shù)據(jù)庫[25]比對(duì)。不同處理方差分析（ANOVA）與多重比較（Duncan’s test）用SPSS 20.0軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 耕作方式對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

不同耕作方式顯著影響土壤理化性質(zhì)（表2）。方差分析結(jié)果表明，耕作方式顯著影響農(nóng)田0—10 cm（＜0.01）及10—20 cm土層土壤有機(jī)碳（TOC）（＜0.001），0—10 cm（＜0.01）及10—20 cm可溶性有機(jī)碳（DOC）（＜0.05）含量。土壤0—10 cm土層，與免耕雙季秸稈還田相比，深耕雙季秸稈還田TOC與DOC分別降低35.04%和23.89%（＜0.05）；深耕單季秸稈還田TOC與DOC比免耕單季秸稈還田分別降低26.09%和33.78%（＜0.05）。土壤10—20 cm土層，深耕雙季秸稈還田與旋耕雙季秸稈還田TOC含量比免耕雙季秸稈還田分別提高21.64%與38.21%（＜0.05）。秸稈還田方式顯著影響土壤0—10 cm及10—20 cm土層TOC（＜0.01；＜0.001），DOC（＜0.01；＜0.05）與TN（＜0.05；＜0.001）含量。免耕處理中，單季秸稈還田比雙季秸稈還田土壤0—10 cm土層TOC、DOC和TN分別顯著降低24.64%，21.61%和12.61%（＜0.05）。

2.2 土壤真菌多樣性

利用Illumina MiSeq平臺(tái)對(duì)真菌18S rRNA基因測(cè)序結(jié)果顯示，36個(gè)土壤樣本共獲得1 372 440條有效序列，378個(gè)OTU，各樣本的覆蓋率指數(shù)（good's coverage）顯示各樣本的覆蓋率指數(shù)顯示0—10及10—20 cm土層土壤OTUs涵蓋了土壤中99.9%的真菌（表3）。測(cè)序深度能夠比較真實(shí)地反映土壤樣本的真菌群落，代表真菌群落多樣性。將數(shù)據(jù)抽平，每個(gè)樣品得到23295條高質(zhì)量序列（表3）。

OTU數(shù)目與α多樣性指數(shù)表示物種的豐富度，即一個(gè)群落或生境內(nèi)物種的復(fù)雜程度，值越高表明群落內(nèi)物種數(shù)目越多。方差分析結(jié)果表明，耕作方式顯著影響0—10 cm和10—20 cm土層真菌OTU數(shù)目，而秸稈還田方式顯著影響0—10 cm土層真菌香農(nóng)指數(shù)。

本研究中，圖1顯示農(nóng)田土壤0—10 cm土層真菌主要包含子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和壺菌門（Chytridiomycota），相對(duì)豐度分別為68.98%、16.96%和1.62%，約占87.55%，未被分類到已知真菌（Unclassified）的序列占9.45%；土壤10—20 cm土層真菌主要包含子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）和球囊菌門（Glomeromycota），相對(duì)豐度分別為68.44%、15.52%、1.51%和1.23%，約占86.71%，未被分類到已知真菌的序列占10.95%。其中，雙季秸稈還田（DS）處理比單季秸稈還田（SS）處理在0—10 cm和10—20 cm土層Basidiomycota相對(duì)豐度分別顯著提高50.07%和29.08%（圖2，＜0.05）。β多樣性用來比較不同環(huán)境中真菌群落結(jié)構(gòu)的差異性，UniFrac距離用于估計(jì)不同處理間的差異。在0—10 cm土層，PCoA縱坐標(biāo)圖顯示PC1軸和PC2軸分別可以解釋37.29%和23.11%群落組成差異（圖3-a）。相同處理的樣本聚集在一起, 這表明來自相同樣本的相似性很高但不同處理的樣品之間存在差異。秸稈單季還田中，免耕、深耕和旋耕處理之間的簇分離，進(jìn)一步說明不同處理土壤真菌群落之間存在差異。相反，在10—20 cm土層，除NTS與DTD外，不同處理樣本彼此靠近，說明處理之間真菌群落結(jié)構(gòu)相似（圖3-b）?？梢? 不同耕作和秸稈還田制度對(duì)農(nóng)田不同土層土壤真菌群落的影響存在差異。

表2 不同耕作和秸稈還田方式下土壤化學(xué)性質(zhì)

數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3），同列數(shù)值后不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05）。*表示＜0.05，**表示＜0.01，***表示＜0.001，ns 表示差異不顯著。NTD，免耕+雙季秸稈還田；NTS，免耕+小麥單季秸稈還田；DTD，深耕+雙季秸稈還田；DTS，深耕+小麥單季秸稈還田；RTD，旋耕+雙季秸稈還田；RTS，旋耕+小麥單季秸稈還田。下同

Values are means ± standard deviation (n=3). Different letters mean significant differences (＜0.05). * indicates a significant difference between treatments at＜0.05; ** indicates a significant difference between treatments at＜0.01; *** indicates a significant difference between treatments at＜0.001. no tillage+double-season returning (NTD), no tillage+single-season returning (NTS), deep tillage+double-season returning (DTD), deep tillage+single-season returning (DTS), rotary tillage+double-season returning (RTD) and rotary tillage+single-season returning (RTS). The same as below

表3 不同耕作和秸稈還田方式下土壤真菌高通量測(cè)序及群落α多樣性指數(shù)

2.3 土壤真菌功能類群

采用FUNGuild預(yù)測(cè)農(nóng)田土壤真菌群落的營(yíng)養(yǎng)型，本研究結(jié)果鑒定為病理營(yíng)養(yǎng)型（Pathotroph）、腐生營(yíng)養(yǎng)型（Saprotroph）和共生營(yíng)養(yǎng)型（Symbiotroph）以及其他無法鑒定營(yíng)養(yǎng)型的種群。從營(yíng)養(yǎng)類型看，華北平原小麥玉米農(nóng)田土壤真菌以病理營(yíng)養(yǎng)型為主（圖4），與NT相比，DT和RT處理分別顯著降低25.16%和16.45%（圖4-a，＜0.05），且以DTS處理最低。RT處理腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌豐度顯著高于DT（0—10 cm）和NT（10—20 cm）（圖4-b，＜0.05），說明秸稈還田后旋耕更有利于腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌的生長(zhǎng)。共生營(yíng)養(yǎng)型真菌在0—10 cm土層SS處理中含量顯著高于DS（圖4-c，＜0.05），說明連續(xù)多年集約化的雙季秸稈還田不利于共生營(yíng)養(yǎng)型真菌在農(nóng)田耕層土壤中的富集。

2.4 土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系

多元回歸樹（MRT）是一種研究物種分布與環(huán)境因子之間關(guān)系的數(shù)量分類方法。將微生物群落進(jìn)行多元回歸分析，以明確驅(qū)動(dòng)土壤真菌群落的主要因子。圖5顯示不同處理0—10 cm土層土壤真菌群落多元回歸樹第一次分割以有機(jī)碳為節(jié)點(diǎn)，將所有處理分為兩組，將RTD和NTD處理與其他處理分解，該次分組能解釋群落結(jié)構(gòu)變化的40.58%，其閾值為11.17；10—20 cm土層土壤真菌群落多元回歸樹第一次分割以堿解氮為節(jié)點(diǎn)，將NTS處理與其他處理分解，該次分組能解釋群落結(jié)構(gòu)變化的65.84%，其閾值為6.52。

圖1 不同處理0—10 cm（a）和10—20 cm（b）土層真菌優(yōu)勢(shì)門組成（平均相對(duì)豐度＞1%）

NT：免耕；DT：深耕；RT：旋耕；DS：雙季秸稈還田；SS：?jiǎn)渭窘斩掃€田。下同

土壤0—10 cm（a）和10—20 cm（b）土層真菌群落主坐標(biāo)分析，采用UniFrac距離算法比較不同處理間群落的差異

數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05）

Data are means±standard deviation; Different small letters mean significant differences (＜0.05）

圖4 不同耕作和秸稈還田方式下土壤0—10 cm和10—20 cm土層真菌功能營(yíng)養(yǎng)型相對(duì)豐度

Fig. 4 The relative abundance of soil fungal functional groups in 0-10 cm and 10-20 cm layers with different tillage and straw returning methods

TOC：有機(jī)碳；DOC：可溶性有機(jī)碳；TN：全氮；AN：堿解氮；AP：有效磷；AK：速效鉀；Error：相對(duì)誤差；CV error：交叉驗(yàn)證誤差；SE：交叉驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)誤

2.5 土壤真菌功能群與環(huán)境因子的關(guān)系

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Pathotroph豐度與土壤TOC（=0.600，＜0.001）、DOC（=0.563，＜0.001）、TN（=0.428，＜0.01）、AN（=0.394，＜0.05）和速效鉀（=0.517，＜0.01）均呈顯著正相關(guān)關(guān)系。除土壤pH外（= 0.570，＜0.01），Symbiotroph豐度與土壤TOC（= -0.535，＜0.01）、TN（= -0.597，＜0.001）、AN（= -0.525，＜0.01）、AP（= -0.698，＜0.001）和AK（= -0.503，＜0.01）均呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

3 討論

3.1 耕作和秸稈還田方式對(duì)土壤真菌群落組成的影響

土壤真菌是土壤的重要組成成分，與土壤肥力密切相關(guān)[26]。不同的農(nóng)田管理措施，如種植方式[27-28]，耕作措施[29]及施肥[15,30]等，對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的變化均有較大的影響。本研究結(jié)果顯示，不同耕作方式與秸稈還田方式下，子囊菌門、擔(dān)子菌門、壺菌門和接合菌門，均為農(nóng)田耕層土壤耕層的優(yōu)勢(shì)真菌。這與前人研究一致，如WANG等[31]江蘇稻麥輪作農(nóng)田中發(fā)現(xiàn)子囊菌門（68.9%）與擔(dān)子菌門（19.9%）占統(tǒng)治地位。與滇南茶園[30]，黃土高原春小麥-豌豆輪作[32]和美國(guó)小麥-休閑不同耕作方式農(nóng)田[33]對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的研究一致。然而，肖禮等[27]發(fā)現(xiàn)黃土高原3種典型種植類型梯田玉米地、蘋果、蘋果與土豆間作土壤真菌優(yōu)勢(shì)菌群為子囊菌門與接合菌門。另外，也有研究報(bào)道波蘭小麥-玉米農(nóng)田土壤真菌優(yōu)勢(shì)菌群為接合菌門與擔(dān)子菌門[34]。

表4 不同耕作與施肥制度土壤真菌功能營(yíng)養(yǎng)型豐度與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系

*表示＜0.05，**表示＜0.01，***表示＜0.001；樣本數(shù)=36

*Indicates a significant difference between treatments at＜0.05; **Indicates a significant difference between treatments at＜0.01; ***Indicates a significant difference between treatments at＜0.001; Sample size (=36)

雖然不同耕作方式之間土壤真菌群落物種組成相似，但不同秸稈還田方式土壤主要真菌門相對(duì)豐度存在差異。秸稈雙季還田擔(dān)子菌相對(duì)豐度高于單季還田。這說明擔(dān)子菌門的相對(duì)豐度受到秸稈還田量的影響。這可能是因?yàn)榻斩捀缓举|(zhì)素[35]，擔(dān)子菌門中的某些種群，如白腐真菌，分解碳氮比高的木質(zhì)素[36]。雙季秸稈還田為擔(dān)子菌提供了一個(gè)較好的生長(zhǎng)環(huán)境，更多地利用降解作物殘留物，從而促進(jìn)其快速增長(zhǎng)。不同處理因作物殘?bào)w量的差異及土壤微環(huán)境的不同，進(jìn)而改變了真菌物種組成。

3.2 真菌功能分類對(duì)耕作和秸稈還田方式的響應(yīng)

選擇適宜的耕作措施，增加真菌生物多樣性，可以預(yù)防或減少根系疾病的損害，在保持土壤質(zhì)量和健康方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。土壤真菌的多樣性決定了生態(tài)系統(tǒng)的多樣性和植物生產(chǎn)力[26]。根據(jù)營(yíng)養(yǎng)方式可將真菌分為病理營(yíng)養(yǎng)型、腐生營(yíng)養(yǎng)型和共生營(yíng)養(yǎng)型3種類型。本研究結(jié)果顯示，秸稈單季還田共生營(yíng)養(yǎng)真菌豐度高于秸稈雙季還田（圖4-c），其在作物健康、營(yíng)養(yǎng)和品質(zhì)方面具有重要作用[15]。因此，我們認(rèn)為秸稈單季還田比雙季還田更有益于土壤肥力和作物生產(chǎn)。病理營(yíng)養(yǎng)型真菌從宿主細(xì)胞獲取營(yíng)養(yǎng)來源，土壤中的病理營(yíng)養(yǎng)型真菌對(duì)植物生長(zhǎng)具有一定負(fù)面影響[31,37]。本研究中，病理營(yíng)養(yǎng)型真菌相對(duì)豐度為12.4%—37.2%，高于聶三安等[15]黃泥土不同施肥試驗(yàn)中的相對(duì)含量。這說明連續(xù)的秸稈還田促進(jìn)了土壤中的病理營(yíng)養(yǎng)型真菌生長(zhǎng)。不過，深耕一定程度上降低了病理營(yíng)養(yǎng)型真菌豐度，這說明深耕能夠降低秸稈還田后作物生長(zhǎng)過程中潛在的負(fù)面影響。不同的耕作方式及秸稈還田方式帶來的營(yíng)養(yǎng)條件與土壤微環(huán)境的改變對(duì)病理營(yíng)養(yǎng)型真菌存在顯著影響，土壤TOC與病理營(yíng)養(yǎng)型真菌顯著正相關(guān)（＜0.001），這說明通過大量秸稈還田，將土壤有機(jī)碳富集在耕層土壤，存在一定的負(fù)面影響。秸稈還田增加農(nóng)田病蟲害是我國(guó)華北地區(qū)麥玉輪作兩季秸稈還田農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在的問題[38]，本研究結(jié)果表明深耕能夠減少土壤病原真菌，降低農(nóng)田病蟲害風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)作物生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量與品質(zhì)。腐生真菌汲取生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)及氨基酸類物質(zhì)[39]，但研究結(jié)果顯示腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌豐度與土壤TOC和DOC并無相關(guān)關(guān)系。這可能是因?yàn)镕UNGuild功能比對(duì)是基于已有文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)，僅在一定程度上解析了真菌的功能[31]。本研究中62.00%的土壤真菌功能未被解析出來，復(fù)雜的土壤真菌群落功能仍有待深入研究。

3.3 土壤真菌群落組成及功能的相關(guān)因子分析

本研究發(fā)現(xiàn)土壤TOC（0—10 cm）是影響褐土真菌群落的主要因素，這與LIU等[40]報(bào)道東北黑土區(qū)與北方旱地區(qū)[41]土壤真菌群落的主要影響因子為土壤TOC相一致。對(duì)于免耕秸稈雙季還田與旋耕雙季秸稈還田來說，大量秸稈還田提高了表層土壤有機(jī)質(zhì)。有機(jī)質(zhì)作為微生物的能量來源和代謝底物，土壤有機(jī)質(zhì)的含量及其成分顯著影響著微生物的群落組成[42]。秸稈富含木質(zhì)素，通過秸稈還田土壤中增加的有機(jī)碳成分多為復(fù)雜且難被分解的木質(zhì)素等，更易被K-策略的貧營(yíng)養(yǎng)型真菌群落分解利用[43]。故免耕秸稈雙季還田與旋耕雙季秸稈還田真菌群落區(qū)別于其他處理。與此同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)土壤堿解氮是影響10—20 cm土層真菌群落的主要因素，與裴振等[44]在黃河三角洲鹽堿地土壤中研究結(jié)果相似。然而，這與北極圈群島[45]、瑞典北部森林[46]、我國(guó)毛竹林[47]和英國(guó)農(nóng)田土壤中[48]，pH是影響真菌群落結(jié)構(gòu)的主要理化性質(zhì)的研究結(jié)果不同。這可能是因?yàn)楸狙芯恐?，不同處理pH變化范圍不大，不足以對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。以上分析表明，不同秸稈還田及耕作方式對(duì)土壤TOC及AN的改變是影響了真菌群落的主要原因。

4 結(jié)論

本文通過對(duì)土壤真菌Illumina高通量測(cè)序結(jié)合FUNGuild功能比對(duì)，研究華北平原多年定位試驗(yàn)條件下小麥-玉米周年復(fù)種農(nóng)田土壤真菌群落多樣性和功能對(duì)不同耕作與秸稈還田方式的響應(yīng)。本研究中，Ascomycota和Basidiomycota是華北平原小麥-玉米農(nóng)田土壤中的優(yōu)勢(shì)真菌，以子囊菌為主。此外，雙季秸稈還田比單季秸稈還田提高了Basidiomycota相對(duì)豐度，土壤有機(jī)碳和堿解氮是影響土壤真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的主要因素。與免耕和旋耕相比，深耕能夠降低秸稈還田后病理營(yíng)養(yǎng)型真菌相對(duì)豐度，降低作物生長(zhǎng)存在潛在的負(fù)面影響，有利于保持農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)健康。

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Response of Fungal Community and Function to Different Tillage and Straw Returning Methods

DAI HongCui1,3, ZHANG Hui2,3, XUE YanFang2,3, GAO YingBo2,3, QIAN Xin2,3，ZHAO HaiJun3, CHENG Hao4, LI ZongXin2,3, LIU KaiChang1,3

(1Crop Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100;2Maize Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100;3National Engineering Laboratory for Wheat and Maize, Jinan 250100;4College of Agronomy, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, Shandong)

【】This study was conducted to explore the change of fungal community structure and function response to different tillage and straw returning methods in wheat-maize rotation system in the North China Plain. It aimed to clarify the biological mechanism of soil fertility improvement, which provided a theoretical support for sustainable development for agricultural production.【】A six-year field study with split plot design was conducted to investigate the effects of different soil tillage methods (no tillage, CT; deep tillage, DT; rotation tillage, ST) and straw returning methods (wheat and maize straws were returned to the field, DS; only wheat straw was returned to the field, SS) on changes of fungal community structure and function in soils from wheat-maize rotation system in the North China Plain. In combination with soil properties, multiple regression trees and correlation analysis was carried out to investigate driving factors of fungal community structure and function in soil．【】The results showed that, compared with NT, soil organic carbon content under DS and SS were reduced by 35.04% and 44.30% in 0-10 cm layer, respectively. The available nitrogen of NT under SS treatment was significantly lower than that under other treatments in 10-20 cm layer. Ascomycetes (68.98%), Basidiomycetes (16.96%) and Chytridiomycetes (1.62%) were the dominant fungus in 0-10 cm layer, while Ascomycetes (68.44%), Basidiomycetes (15.52%), Chytridiomycetes (1.51%) and Coccidiomycetes (1.23%) were the dominant fungus in 10-20 cm layer. The different tillage and straw returning methods changed soil fungal community structure. Specifically, the relative abundance ofin DS increased 50.07% and 29.08% respectively in 0-10 cm and 10-20 cm layers than that of SS. The multiple regression trees showed that soil fungal communities were divided into soil organic carbon nodes with a threshold of 11.17 mg·kg-1in 0-10 cm layer, additionally, the soil fungi community were divided into available nitrogen nodes with a threshold of 6.52 mg·kg-1in 10-20 cm layer. In this study, Pathotroph was mainly function type of soil fungi in 0-10 cm (26.84%) and 10-20 cm (23.91%) layers in wheat-maize rotation in the North China Plain. Compared with NT, Pathotroph relative abundance under DT and RT treatments were reduced by 25.16% and 16.45%, respectively. The results of correlation analysis showed that Pathotroph relative abundance were positively correlated with soil total organic carbon, dissolved organic carbon, total nitrogen, available nitrogen and available potassium.【】In general, our results indicated that different tillage and straw returning methods changed soil fungal community structure and relative abundance of functional groups. The content of soil organic carbon and available nitrogen were the driving factors shaped the fungal community structure. Besides, DT could reduce Pathotroph relative abundance, which was conducive to maintaining the soil ecosystem health.

tillage practice; straw returning; soil fungal community; high-throughput sequencing; multiple regression trees

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.13.008

2018-12-24；

2019-02-26

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD0300606）、山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系玉米創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-02-07，SDAIT-02-11）、山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程（CXGC2016A05）

代紅翠，E-mail：daihongcui2013@163.com。

劉開昌，Tel：0531-66659091；E-mail：liukc1971@126.com。通信作者李宗新，Tel：0531-66659402；E-mail：sdaucliff@sina.com

（責(zé)任編輯 李云霞）