湯亞飛，裴凡，李正剛，佘小漫，于琳，藍(lán)國兵，鄧銘光，何自福

基于小RNA深度測序技術(shù)鑒定侵染廣東辣椒的病毒種類

湯亞飛，裴凡，李正剛，佘小漫，于琳，藍(lán)國兵，鄧銘光，何自福

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點實驗室，廣州 510640）

【】病毒病是廣東省辣椒生產(chǎn)上主要病害之一，田間病株率一般為5%—30%，嚴(yán)重時可達(dá)100%。本研究旨在探明危害廣東辣椒的病毒種類，為辣椒病毒病的防控提供理論依據(jù)。2013—2016年，從廣東省廣州、佛山、惠州、江門、梅州、湛江、茂名和韶關(guān)8市辣椒主要種植區(qū)采集疑似病毒病辣椒樣品125份，分別提取每份辣椒病樣總RNA，對從茂名、梅州、韶關(guān)3市采集的病樣按地點和癥狀混合成7份混合病樣進(jìn)行小RNA深度測序分析，根據(jù)小RNA深度測序分析結(jié)果，對每種病毒分別根據(jù)小RNA深度測序拼接的基因片段序列和GenBank數(shù)據(jù)庫中與該拼接序列同源性最高的病毒基因組序列保守區(qū)設(shè)計2對特異性引物，以小RNA深度測序的病樣RNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增效果對引物進(jìn)行篩選，進(jìn)一步應(yīng)用篩選出的引物，對采集于廣東省的125份辣椒病樣分別進(jìn)行RT-PCR檢測，根據(jù)檢測結(jié)果明確危害廣東辣椒的病毒種類。從采集于廣東省8市的辣椒主要種植區(qū)的125份病樣中檢測到14種病毒，按照檢出率從高到低依次為辣椒輕斑駁病毒（，PMMoV）(44.0%）、甜椒內(nèi)源RNA病毒（，BPEV）（32.8%）、煙草輕型綠花葉病毒（，TMGMV）（31.2%）、辣椒脈斑駁病毒（，ChiVMV）（29.6%）、辣椒黃脈病毒1（，PeVYV-1）（26.4%）、甜椒斑駁病毒（，PVMV）（25.6%）、黃瓜花葉病毒（，CMV）（18.4%）、辣椒環(huán)斑病毒（，ChiRSV）（16.8%）、辣椒黃脈病毒6（，PeVYV-6）（16.8%）、馬鈴薯 Y 病毒（，PVY）（15.2%）、辣椒褪綠病毒（，CaCV）（14.4%）、蠶豆萎蔫病毒2號（，BBWV-2）（9.6%）、辣椒隱癥病毒1（，PCV1）（8.8%）、煙草花葉病毒（，TMV）（4.0%）。其中，PMMoV、BPEV、TMGMV、ChiVMV、PeVYV-1和PVMV 6種病毒的檢出率在25%以上，但PMMoV、ChiVMV和PVMV分布廣泛，PMMoV除了茂名外，ChiVMV除了韶關(guān)外，其他7市辣椒產(chǎn)區(qū)均有分布；PVMV廣泛分布于8市辣椒產(chǎn)區(qū)，根據(jù)檢出率和分布范圍，得出PMMoV、ChiVMV和PVMV是危害廣東辣椒的優(yōu)勢病毒。同時發(fā)現(xiàn)，廣東辣椒上多種病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象普遍，在本研究125份病樣中病毒復(fù)合侵染率達(dá)到88.0%，其中2種、3種、4種、5種、6種、7種和8種病毒復(fù)合侵染檢出率分別為28.0%、25.6%、12.0%、9.6%、6.4%、1.6%和2.4%，由此可知，2種和3種病毒復(fù)合侵染是主要侵染形式。危害廣東辣椒的病毒有14種，其中PMMoV、ChiVMV和PVMV為優(yōu)勢病毒，且復(fù)合侵染普遍，2種和3種病毒復(fù)合侵染是主要侵染形式。

辣椒病毒?。环N類鑒定；小RNA深度測序；RT-PCR；廣東省

0 引言

【研究意義】病毒病是辣椒（）生產(chǎn)上的主要病害，在世界各辣椒產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，影響辣椒的產(chǎn)量與品質(zhì)。廣東是我國辣椒主要產(chǎn)區(qū)之一，年種植面積約10萬公頃，其中年冬種面積超過70%，病毒病每年均對辣椒生產(chǎn)造成不同程度的損失。因此，對危害廣東辣椒的病毒種類開展研究，對減輕辣椒病毒病的危害以及促進(jìn)辣椒產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】可侵染辣椒并引起病害的病毒種類眾多，世界各地陸續(xù)報道的辣椒病毒有70種以上[1]，而我國發(fā)現(xiàn)至少有37種[2-29]，具體包括煙草花葉病毒（，TMV）、黃瓜花葉病毒（，CMV）、馬鈴薯Y病毒（，PVY）、苜?；ㄈ~病毒（，AMV）、蠶豆萎蔫病毒2號（，BBWV-2）、番茄花葉病毒（，ToMV）、蠶豆萎蔫病毒1號（，BBWV-1）、馬鈴薯X病毒（，PVX）、煙草蝕紋病毒（，TEV）、煙草脆裂病毒（，TRV）、辣椒脈斑駁病毒（，ChiVMV）、辣椒斑駁病毒（，PepMoV）、辣椒輕斑駁病毒（，PMMoV）、蕪菁花葉病毒（，TuMV）、辣椒褪綠病毒（，CaCV）、花生黃斑病毒（，GYSV）、中國辣椒黃化曲葉病毒（，PYLCCNV）、云南辣椒曲葉病毒（，PeLCYnV）、煙草曲莖病毒（，TbCSV）、番茄斑萎病毒（，TSWV）、辣椒環(huán)斑病毒（，ChiRSV）、煙草輕型綠花葉病毒（，TMGMV）、番茄黃化曲葉病毒（，TYLCV）、番茄褪綠病毒（，ToCV）、辣椒內(nèi)源RNA病毒（，BPEV）、鳳仙花壞死斑點病毒（，INSV）、辣椒黃脈病毒（，PeVYV）、甜椒斑駁病毒（，PVMV）、西瓜銀斑駁病毒（，WSMoV）、甜瓜蚜傳黃化病毒（，MABYV）、甜菜西方黃化病毒（，BWYV）、番茄斑駁花葉病毒（，ToMMV）、南瓜蚜傳黃化病毒（，CABYV）、煙草叢頂病毒（，TBTV）、辣椒隱潛病毒1號（，PCV1）、辣椒隱潛病毒2號（，PCV2）。對于危害廣東辣椒的病毒種類也有一些報道，如饒雪琴等[30]對廣州市郊及鄰近地區(qū)的辣椒病毒病進(jìn)行調(diào)查與病原檢測，CMV與TMV的檢出率分別為36.67%和43.33%；張竹青[5]從廣東省39份辣椒病樣中檢測到TMV、ChiVMV、CMV、BBWV-1、BBWV-2、PVY、ToMV、PMMoV和PVMV 9種病毒，以TMV檢出率最高，為30.76%；劉勇等[12]在廣州辣椒病樣中檢測到CaCV。應(yīng)用RT-PCR方法，姚玉榮等[31]在采集于廣東湛江、茂名等地120份辣椒病樣中檢測到CMV、PMMoV、PVY、TYLCV、PVX，其中CMV檢出率最高，為24.17%；湯亞飛等[26]在廣東興寧辣椒病樣中檢測到WSMoV?！颈狙芯壳腥朦c】前人的研究大多根據(jù)病株癥狀、已有的研究結(jié)果等作為依據(jù)，選擇幾種病毒作為檢測對象，應(yīng)用鑒別寄主、血清學(xué)及RT-PCR等檢測鑒定方法，這些方法難以發(fā)現(xiàn)未知的病毒，而且辣椒上病毒復(fù)合侵染十分普遍，“多毒一癥”的現(xiàn)象也并不少見，研究結(jié)果的局限性顯而易見。本研究采用小RNA深度測序結(jié)合RT-PCR檢測驗證，可較全面地檢測與鑒定侵染廣東辣椒的病毒種類?！緮M解決的關(guān)鍵問題】明確危害廣東辣椒的病毒種類，為進(jìn)一步防控辣椒病毒病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2013年9月至2016年12月在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成。

1.1 樣本來源

2013—2016年，從廣東省廣州、佛山、惠州、江門、梅州、湛江、茂名和韶關(guān)8市辣椒主產(chǎn)區(qū)隨機(jī)采集病毒病疑似病樣125份，其中廣州22份、佛山4份、惠州9份、江門3份、梅州10份、湛江34份、茂名27份、韶關(guān)16份。采集的樣品在田間及時放入干冰速凍，帶回實驗室保存于-80℃冰箱。

1.2 主要試劑

植物RNA提取試劑盒（Easy Pure Plant RNA Kit）及大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（1st Strand cDNA Synthesis Kit）、DNA分子量標(biāo)記（DL2000、DL5000）、pMD20-T、Solution Ⅰ、Premix Taq DNA聚合酶購自寶生物工程（大連）有限公司；膠回收試劑盒（Gen JET Gel Extraction Kit）購自Thermo 公司；氨芐青霉素、X-gal、EDTA購自生工生物工程（上海）股份有限公司（簡稱上海生工）；瓊脂糖購自廣州華奇盛生物科技有限公司；其他常規(guī)分析純試劑購自廣州市芊薈化玻儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 病害調(diào)查 采用5點取樣法對廣東省辣椒主產(chǎn)區(qū)的病毒病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，每點調(diào)查不少于20株，觀察田間癥狀，并統(tǒng)計病株率。

1.3.2 小RNA深度測序 從茂名、梅州、韶關(guān)3市的辣椒病樣中按地點和癥狀分別取5—6個病樣進(jìn)行等量混合，其中茂名4份、梅州1份、韶關(guān)2份共計7份混合病樣，用于小RNA深度測序，小RNA深度測序委托上海生工完成。

1.3.3 RT-PCR檢測 病樣RNA提?。悍謩e取125份辣椒病樣葉組織各100 mg，用植物RNA提取試劑盒分別提取其總RNA，溶解于40 μL DEPC處理的ddH2O中，保存于-80℃冰箱，用于后續(xù)試驗。

引物設(shè)計：根據(jù)小RNA深度測序分析結(jié)果，應(yīng)用引物在線設(shè)計網(wǎng)站（http://primer3.ut.ee/）為每種病毒均設(shè)計2對特異性引物。第1對引物是直接根據(jù)小RNA深度測序拼接出的病毒基因片段序列設(shè)計；第2對引物是根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中與該拼接序列同源性最高的病毒基因組序列保守區(qū)設(shè)計，目的片段大小為400—800 bp。引物由上海生工合成。

引物篩選：以參與小RNA深度測序的病樣RNA為模板，用上述2對特異引物分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，驗證小RNA深度測序分析結(jié)果的同時篩選出后續(xù)病樣中病毒檢測的引物對。取5 μL病樣RNA，用隨機(jī)引物（TaKaRa公司）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系和具體方法按照試劑盒說明書上的步驟進(jìn)行，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL，PCR MIXER 25 μL，10 μmol·L-1的上、下游引物各2 μL，加滅菌水至終體積50 μL。反應(yīng)程序：94℃變性3 min，94℃變性0.5 min，52℃退火0.5 min，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃延伸反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物；進(jìn)一步切膠回收特異片段，進(jìn)行克隆、測序與比對分析，根據(jù)序列比對結(jié)果、RT-PCR擴(kuò)增效果，每種病毒篩選出一對特異引物，用于對辣椒病樣RT-PCR檢測。

RT-PCR檢測：應(yīng)用篩選獲得的每種病毒特異性較好的引物對，對采集于廣東各辣椒產(chǎn)區(qū)的125份辣椒病樣分別進(jìn)行RT-PCR檢測，以明確其所含病毒種類。

2 結(jié)果

2.1 廣東辣椒病毒病發(fā)生與危害情況

2013—2016年，調(diào)查了廣東省廣州、佛山、惠州、江門、梅州、湛江、茂名、韶關(guān)8個辣椒主產(chǎn)區(qū)的辣椒病毒病發(fā)生情況，結(jié)果顯示，辣椒病毒病主要表現(xiàn)為花葉、黃化、皺縮、泡斑等癥狀（圖1），其中以花葉最為普遍。一般田塊辣椒病毒病的病株率5%—30%，嚴(yán)重的田塊的病株率可達(dá)60%以上，甚至100%。

2.2 小RNA深度測序分析

通過小RNA深度測序從7份混合辣椒病樣分析出13種病毒（表1），每個地區(qū)的病毒種類存在差異（表2），茂名4份混合樣品中分析出ChiRSV、BBWV-2、CMV、ChiVMV、PVMV、CaCV、TMGMV、PCV1、PeVYV-1、PeVYV-6、BPEV 11種病毒；梅州1份混合樣品分析出BPEV、CaCV、PVMV、PMMoV、PVY 5種病毒；韶關(guān)2份混合樣品中分析出CaCV、PCV1、PMMoV 3種病毒。

2.3 RT-PCR驗證小RNA深度測序結(jié)果

應(yīng)用1.3.3設(shè)計的每種病毒2對特異引物，以用于小RNA測序病樣RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示（表3），所有小RNA深度測序分析出的病毒均能得到RT-PCR驗證，同時發(fā)現(xiàn)應(yīng)用RT-PCR方法能在少量病樣中檢測到小RNA深度測序未分析出的病毒種類。

2.4 RT-PCR檢測引物篩選

根據(jù)每種病毒2對特異引物的擴(kuò)增效果和條帶單一性，13種病毒各篩選到一對擴(kuò)增效果較好的引物（表4），用于后續(xù)病毒種類的檢測。小RNA深度測序結(jié)果中未分析出TMV，而有前人研究報道TMV是引起廣東辣椒病毒病的主要病原，因此，對廣東辣椒病毒種類檢測時，除檢測上述13種病毒外，還增加了對TMV檢測。

表1 小RNA深度測序分析出的病毒種類所屬的科屬情況

圖1 辣椒病毒病田間癥狀

表2 小RNA深度測序分析廣東辣椒樣品中病毒的結(jié)果

-：陰性Negative

2.5 廣東各地辣椒病樣RT-PCR檢測結(jié)果

應(yīng)用篩選獲得的每一種病毒特異性較好的引物，對125份疑似辣椒病毒病樣分別進(jìn)行RT-PCR檢測。結(jié)果表明（表5），廣州病樣中檢測到9種病毒，其中ChiVMV檢出率最高，為54.5%；佛山病樣中檢測到5種病毒，其中PMMoV檢出率最高，為100.0%；惠州病樣檢測到6種病毒，其中PVMV檢出率最高，為77.8%；梅州病樣中檢測到8種病毒，其中PMMoV檢出率最高，為100.0%；江門病樣中檢測到6種病毒，其中ChiVMV、CMV、PMMoV檢出率較高，為66.7%；湛江病樣中檢測到10種病毒，其中PMMoV檢出率最高，為73.5%；茂名病樣中檢測到12種病毒，其中BPEV檢測率最高，為59.3%；韶關(guān)病樣中檢測到11種病毒，其中TMGMV檢出率最高，為75.0%。

表3 小RNA深度測序分析結(jié)果與RT-PCR驗證結(jié)果比較

Table 3 Comparison of results between small RNA deep sequencing and RT-PCR

+：陽性Positive；-：陰性Negative

2.6 14種病毒在廣東省辣椒病樣中的檢出率及其分布情況

從125份辣椒病樣中，共檢測出14種病毒（表5），檢出率依次為PMMoV（44.0%）、BPEV（32.8%）、TMGMV（31.2%）、ChiVMV（29.6%）、PeVYV-1（26.4%）、PVMV（25.6%）、CMV（18.4%）、ChiRSV（16.8%）、PeVYV-6（16.8%）、PVY（15.2%）、CaCV（14.4%）、BBWV-2（9.6%）、PCV1（8.8%）、TMV（4.0%）。其中，PMMoV、BPEV、TMGMV、ChiVMV、PeVYV-1和PVMV 6種病毒的檢出率在25%以上。

14種病毒在廣東各辣椒產(chǎn)區(qū)的分布存在一定的差異（表5）。PVMV廣泛分布于廣州、佛山、惠州、梅州、江門、湛江、茂名及韶關(guān)8市辣椒產(chǎn)區(qū)；PMMoV除了茂名外，其他7市辣椒產(chǎn)區(qū)均有分布；ChiVMV除了韶關(guān)外，其他7市辣椒產(chǎn)區(qū)均有分布；PVY除了佛山外，其他7市辣椒產(chǎn)區(qū)均有分布；PeVYV-1、PeVYV-6、CaCV和BPEV 4種病毒分布于5個市的辣椒產(chǎn)區(qū)；TMGMV、CMV及PCV1 3種病毒分布于4個市的辣椒產(chǎn)區(qū)；ChiRSV分布于廣州、茂名和湛江3個市的辣椒產(chǎn)區(qū)；BBWV-2僅分布于佛山和茂名2個市的辣椒產(chǎn)區(qū)；而TMV僅在韶關(guān)辣椒病樣品中檢測到。

2.7 廣東辣椒病樣中病毒侵染情況

廣東辣椒上多種病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象普遍（表6）。在125份病樣中，僅15份樣品中只檢測到1種病毒，為單一病毒侵染外，其余均為復(fù)合侵染，其中2種病毒侵染的樣品有35份，占28.0%；3種病毒侵染的樣品有32份，占25.6%；4種病毒侵染的樣品有15份，占12.0%；5種病毒侵染的樣品有12份，占9.6%；6種病毒侵染的樣品有8份，占6.4%；7種病毒侵染的樣品有2份，占1.6%；而8種病毒侵染的樣品也有3份，占2.4%。

不同地區(qū)的辣椒病樣中病毒復(fù)合侵染情況也存在差異（表6）。茂名地區(qū)辣椒病樣中病毒復(fù)合侵染形式最多樣化，存在2種、3種、5種、6種、7種、8種病毒復(fù)合侵染；其次梅州和韶關(guān)，辣椒病樣中存在5種復(fù)合侵染形式。

3 討論

本研究應(yīng)用小RNA深度測序及RT-PCR方法對侵染廣東省辣椒的病毒種類進(jìn)行了較全面的檢測與分析，鑒定出侵染危害廣東辣椒的病毒14種，分別為PMMoV、BPEV、TMGMV、ChiVMV、PeVYV-1、PVMV、CMV、ChiRSV、PeVYV-6、PVY、CaCV、BBWV-2、PCV1、TMV。其中，PMMoV、ChiVMV和PVMV 3種病毒檢出率在25%以上，且在本研究8市的辣椒主產(chǎn)區(qū)中的7市及以上產(chǎn)區(qū)均有分布。由此推測，PMMoV、ChiVMV和 PVMV是目前危害廣東辣椒的優(yōu)勢病毒。

關(guān)于廣東省侵染危害辣椒的病毒種類及其優(yōu)勢病毒，前人報道在廣東辣椒上分別檢測到CMV、TMV、CaCV、PMMoV、PVX、PVY、PVMV、TYLCV、ChiVMV、BBWV-l、BBWV-2、WSMoV及ToMV 13種病毒，并認(rèn)為TMV與CMV為主要病原[2,5,12,26,30-31]。本研究通過小RNA深度測序未分析出TMV、PVX、TYLCV、BBWV-1、WSMoV、ToMV 6種病毒，但新發(fā)現(xiàn)TMGMV、BPEV、PeVYV-1、PeVYV-6、ChiRSV、PCV1這6種病毒。此外，在檢測的14種病毒中，CMV和TMV檢出率僅分別為18%和4%，二者在廣東辣椒上發(fā)生并不普遍，與前人的研究結(jié)果不同。導(dǎo)致這些差異的可能原因，一方面是不同地區(qū)侵染辣椒的病毒種類固有差異及其演替，另一方面是不同研究所采用的檢測方法不同。前人的研究采用應(yīng)用鑒別寄主、血清學(xué)及RT-PCR等檢測鑒定方法，這些方法局限于對已知病毒種類的檢測，無法發(fā)現(xiàn)未知病毒，而小RNA深度測序分析可在無病樣中病毒信息的情況下一次性全面掃描病樣中含有的病毒，信息量大，可檢測到未知病毒，但是檢測成本相對較高，也會由于病樣中不同病毒含量的差異，造成對含量低的病毒漏檢。本研究基于小RNA深度測序分析結(jié)果，并通過RT-PCR驗證，可較全面地檢測與鑒定侵染廣東辣椒的病毒種類。

表4 用于檢測14種病毒的引物

表5 125份病樣RT-PCR檢測結(jié)果

表6 各地區(qū)14種病毒單一或復(fù)合侵染的發(fā)生情況

不同地區(qū)檢測出的病毒種類不同，且優(yōu)勢病毒也存在差異。甘肅河西地區(qū)辣椒上有CMV、PMMoV、TMV、PVY、TEV，其中TMV和CMV為優(yōu)勢病毒種類[32]；侵染重慶辣椒的病毒有BBWV-2、CMV、TMV、TuMV、ToMV，其中CMV為優(yōu)勢病毒種類[4]；侵染海南辣椒的病毒有CMV、ChiVMV、PMMoV、ChiRSV和PVMV，其中CMV為優(yōu)勢病毒，但ChiRSV、PMMoV和PVMV 3種病毒的檢出率在30%以上，已發(fā)展成為海南辣椒上不可忽視的病原[33]；侵染貴州辣椒的病毒為BBWV-2、CMV、PMMoV、TMV、PVY、ToMV、TuMV、TSWV、AMV和PepMoV等10種，其中CMV為優(yōu)勢病毒[34]；侵染天津辣椒的病毒包括BBWV、CMV、TMV、ToMV、TSWV、TYLCV，其中CMV為優(yōu)勢病毒種類[35]；而侵染山東辣椒的病毒包括BBWV-2、CMV、ChiVMV、PMMoV、TMV、PVY、ToMV、TMGMV、AMV、TYLCV、PeVYV、BWYV、MABYV和PCV 14種，其中PMMoV和CMV的檢出率非常高，達(dá)到60%以上[36]。本研究結(jié)果顯示在危害廣東辣椒的14種病毒中，PMMoV、ChiVMV和PVMV為優(yōu)勢病毒，與國內(nèi)其他省辣椒上優(yōu)勢病毒存在明顯差異。同時發(fā)現(xiàn)，廣東省不同地區(qū)的優(yōu)勢病毒種類存在明顯差異，梅州地區(qū)PMMoV檢出率最高，為100.0%；佛山地區(qū)PMMoV檢出率最高，為100.0%；湛江地區(qū)PMMoV檢出率最高，為73.5%；廣州地區(qū)ChiVMV檢出率最高，為54.5%；江門地區(qū)PMMoV、ChiVMV、CMV檢出率很高，為66.7%；惠州地區(qū)PVMV檢出率最高，為77.8%；但茂名和韶關(guān)地區(qū)檢出率最高的病毒分別為BPEV和TMGMV，檢出率為59.3%和75.0%，不是危害廣東省辣椒的優(yōu)勢病毒ChiVMV、PVMV和PMMoV；這一現(xiàn)象很有可能與當(dāng)?shù)氐姆N植制度、栽培品種以及栽培環(huán)境有關(guān)，如茂名地區(qū)以冬種辣椒為主，從20世紀(jì)80年代開始種植，種植年限長，品種較為單一，以甜椒為主，與廣東省其他地區(qū)種植模式存在明顯差異；韶關(guān)屬于粵北地區(qū)，氣候較其他地區(qū)存在明顯差異，因此栽培品種上存在一定的差異。

植物病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象在自然界中普遍存在。張竹青[5]對國內(nèi)9省辣椒病毒樣品檢測結(jié)果顯示，同時感染2種或2種以上病毒的占檢測樣品的79.33%；姚玉榮等[31]報道海南省和廣東省田間以CMV和PMMoV復(fù)合侵染辣椒現(xiàn)象較為普遍；郭思瑤等[4]報道重慶地區(qū)辣椒病毒病復(fù)合侵染率為66.10%，其中2種、3種、4種及以上病毒復(fù)合侵染率分別為30.51%、26.27%、9.32%；王莉爽等[34]報道貴州地區(qū)辣椒上2種或3種病毒復(fù)合侵染率為32.66%。本研究發(fā)現(xiàn)廣東辣椒上病毒復(fù)合侵染十分普遍。在檢測的125個病樣品中，病毒復(fù)合侵染率高達(dá)88.0%，其中2種和3種病毒復(fù)合侵染形式的檢出率最高，分別為28.0%、25.6%。由此可知，2種和3種病毒復(fù)合侵染是主要的侵染形式。

4 結(jié)論

利用小RNA深度測序及RT-PCR方法鑒定出危害廣東辣椒的病毒包括14種，分別為PMMoV、BPEV、TMGMV、ChiVMV、PeVYV-1、PVMV、CMV、ChiRSV、PeVYV-6、PVY、CaCV、BBWV-2、PCV1、TMV。其中，PMMoV、ChiVMV和PVMV 3種病毒不僅檢出率超過25%，且在廣東8市辣椒產(chǎn)區(qū)有7市及以上產(chǎn)區(qū)有分布，是危害廣東辣椒的優(yōu)勢病毒，與國內(nèi)其他省辣椒上優(yōu)勢病毒存在明顯差異；此外，廣東辣椒上多種病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象較為嚴(yán)重，其中2種和3種病毒復(fù)合侵染是主要的侵染形式。

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Identification of Viruses Infecting Peppers in Guangdong by Small RNA Deep Sequencing

TANG YaFei, PEI Fan, LI ZhengGang, SHE XiaoMan, YU Lin, Lan GuoBing, DENG MingGuang, HE ZiFu

(Plant Protection Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection, Guangzhou 510640)

【】The viral disease is one of the major diseases of pepper production in Guangdong province. The disease incidence is generally 5%-30% in the field, which can up to 100% in serious field. The objective of this study is to identify virus species infecting pepper in Guangdong province, and to provide a theoretical basis for the prevention and control of pepper virus disease.【】From 2013 to 2016, a total of 125 susceptible pepper plant samples were collected from 8 major pepper growing areas of Guangzhou, Foshan, Huizhou, Jiangmen, Meizhou, Zhanjiang, Maoming and Shaoguan in Guangdong Province. Total RNA was extracted respectively from the leaves of 125 pepper samples. The 7 mixed samples collected from Maoming, Meizhou and Shaoguan were analyzed by small RNA deep sequencing. According to the results of small RNA deep sequencing analysis, two pairs of specific primers of each virus were designed to RT-PCR. The first pair of specific primers was designed according to the sequences of spliced gene fragments from small RNA deep sequencing. The second pair of specific primers was designed according to the conserved region sequences of viral genome in the GenBank database with the highest homology to sequences of spliced gene fragments from small RNA deep sequencing. Using disease samples RNA involved in small RNA deep sequencing as a template, the RT-PCR amplification was carried out with the two pairs of primers. Based on RT-PCR amplification results, the better pair of specific primers of each virus was selected. Furthermore, all 125 samples collected from Guangdong Province were subjected to detect viruses with the better pair of specific primers by RT-PCR.【】Fourteen viruses were identified in 125 samples collected from major pepper growing areas in 8 cities of Guangdong province. According to the order of detection rate from high to low, they were(PMMoV) (44.0%),(BPEV) (32.8%),(TMGMV) (31.2%),(ChiVMV) (29.6%),(PeVYV-1) (26.4%),(PVMV) (25.6%),(CMV) (18.4%),(ChiRSV) (16.8%),(PeVYV-6) (16.8%),(PVY) (15.2%),(CaCV) (14.4%),(BBWV-2) (9.6%),(PCV1) (8.8%),(TMV) (4.0%). The detection rates of PMMoV, BPEV, TMGMV, ChiVMV, PeVYV-1 and PVMV were over 25%. PMMoV, ChiVMV and PVMV were widely distributed in Guangdong province. PMMoV (except Maoming), ChiVMV (except Shaoguan) were detected in pepper producing areas of other 7 cities. PVMV was detected in pepper producing areas of 8 cities. According to detection rate and distribution range, it was concluded that PMMoV, ChiVMV and PVMV were the dominant viruses infecting pepper in Guangdong province. The mixed infection phenomenon was common on peppers in Guangdong province. The detection rate of mixed infection was up to 88.0% in 125 samples. Among them, the mixed detection rates of 2 kinds, 3 kinds, 4 kinds, 5 kinds, 6 kinds, 7 kinds and 8 kinds of viruses were 28.0%, 25.6%, 12.0%, 9.6%, 6.4%, 1.6%, 2.4%, respectively. So, 2 kinds and 3 kinds of viruses mixed infection were the main infection forms on peppers in Guangdong province.【】There are 14 kinds of viruses endangering pepper plants in Guangdong province, among which PMMoV, ChiVMV and PVMV are the dominant viruses. The phenomenon of mixed infection is common. The main infection forms on peppers are 2 kinds and 3 kinds of viruses mixed infection in Guangdong province.

pepper virus diseases; virus identification; small RNA deep sequencing; RT-PCR; guangdong province

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.13.006

2019-03-15；

2019-04-29

國家重點研發(fā)計劃（2018YFD0201209）、廣東省科技創(chuàng)新戰(zhàn)略專項資金重點領(lǐng)域研發(fā)計劃（2018B020205003）、2017年省級現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)推廣體系建設(shè)項目（2017LM4163）

湯亞飛，E-mail：yf.tang1314@163.com。裴凡，E-mail：1028176331@qq.com。湯亞飛和裴凡為同等貢獻(xiàn)作者。

何自福，Tel：020-87597476；E-mail：hezf@gdppri.com

（責(zé)任編輯 岳梅）