陳靜靜，劉謝香，于莉莉，盧一鵬，張嗣天，張昊辰，關(guān)榮霞，邱麗娟

利用BSA法發(fā)掘野生大豆種子硬實(shí)性相關(guān)QTL

陳靜靜，劉謝香，于莉莉，盧一鵬，張嗣天，張昊辰，關(guān)榮霞，邱麗娟

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/國(guó)家農(nóng)作物基因資源與遺傳改良重大科學(xué)工程/農(nóng)業(yè)部種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

【】野生大豆的硬實(shí)性是大豆遺傳改良利用中的重要限制因素。利用BSA法發(fā)掘與大豆種子硬實(shí)性相關(guān)的QTL，為野生大豆在大豆遺傳改良中的合理利用奠定基礎(chǔ)。利用栽培大豆中黃39與野生大豆NY27-38雜交構(gòu)建F2和F7分離群體，從每個(gè)單株選取整齊一致的種子，取30粒種子置于鋪有一層濾紙的培養(yǎng)皿中，加入30 mL蒸餾水，25℃培養(yǎng)箱中暗處理4 h，設(shè)3次重復(fù)，分別統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中正常吸脹和硬實(shí)種子數(shù)。在F2群體中，選取22個(gè)正常吸脹單株（吸脹率＞90%）和16個(gè)硬實(shí)單株（吸脹率＜10%）；在F7群體中，選取20個(gè)完全吸脹單株（吸脹率=100%）和20個(gè)完全硬實(shí)單株（吸脹率=0%），單株DNA等量混合，分別構(gòu)建2個(gè)吸脹和2個(gè)硬實(shí)DNA池。利用259對(duì)在親本間有多態(tài)性的SSR標(biāo)記對(duì)吸脹和硬實(shí)DNA池進(jìn)行檢測(cè)，篩選在吸脹和硬實(shí)DNA池間表現(xiàn)多態(tài)性的SSR標(biāo)記；用192個(gè)SSR標(biāo)記檢測(cè)F7分離群體，構(gòu)建遺傳圖譜，利用復(fù)合區(qū)間作圖法定位大豆硬實(shí)相關(guān)QTL。利用F2個(gè)體構(gòu)建的吸脹和硬實(shí)DNA池，在第2染色體16.3 Mb區(qū)間和第6染色體23.4 Mb區(qū)間分別檢測(cè)到10個(gè)和8個(gè)在兩池間有差異的SSR標(biāo)記。利用這些標(biāo)記檢測(cè)F2群體，將第2染色體的QTL定位于Satt274與Sat_198間的276.0 kb區(qū)間，該區(qū)間包括已克隆的大豆硬實(shí)基因，解釋17.2%的表型變異。第6染色體的QTL位于標(biāo)記BARCSOYSSR_06_0993與BARCSOYSSR_06_1068間，可解釋17.8%的表型變異。利用F7株系構(gòu)建的吸脹和硬實(shí)DNA池，在第2（27.4 Mb區(qū)間）、6（27.8 Mb 區(qū)間）和3染色體（18.2 Mb區(qū)間）分別檢測(cè)到11個(gè)、9個(gè)和4個(gè)在兩池間有多態(tài)性的SSR標(biāo)記。利用F7群體構(gòu)建包括192個(gè)SSR標(biāo)記、覆蓋2 390.2 cM的遺傳圖譜，共檢測(cè)到3個(gè)硬實(shí)相關(guān)QTL，其中第2染色體定位到的QTL位于標(biāo)記Satt274與Sat_198間，可解釋23.3%的遺傳變異。第6染色體定位到的QTL位于標(biāo)記Sat_402與Satt557之間，可解釋20.4%的表型變異。在第3染色體標(biāo)記Sat_266與Sat_236間發(fā)現(xiàn)一個(gè)可以解釋4.9%表型變異的QTL，與BSA法檢測(cè)的結(jié)果相符。利用BSA法可以檢測(cè)到傳統(tǒng)遺傳作圖定位的所有與硬實(shí)性相關(guān)的QTL，證明BSA法發(fā)掘大豆種子硬實(shí)性主要QTL的高效性。

大豆；種子硬實(shí)；QTL定位

0 引言

【研究意義】栽培大豆在大約5000年前由一年生野生大豆馴化而來(lái)[1-2]，種子硬實(shí)性是與大豆馴化相關(guān)的一個(gè)重要性狀。與非硬實(shí)種子相比，硬實(shí)大豆種子具有較高的種子活力與較長(zhǎng)的種子壽命[3-5]。在熱帶和亞熱帶地區(qū)高溫多雨條件下，硬實(shí)種子不易吸脹，延緩了種子的劣變，有利于種子的保存與運(yùn)輸[4]。野生大豆的硬實(shí)性有利于其在自然環(huán)境下的生存繁衍，但該性狀卻影響了野生大豆在栽培大豆雜交改良中的利用效率。因此，發(fā)掘硬實(shí)相關(guān)的重要QTL位點(diǎn)，對(duì)于硬實(shí)性狀的遺傳解析及野生大豆利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】遺傳研究證明大豆種子硬實(shí)性由多基因控制。大豆硬實(shí)的形成受種皮和種臍影響最大，與種皮的角質(zhì)層和柵欄層有關(guān)，正常吸脹的種子其背部角質(zhì)層存在細(xì)小裂痕，硬實(shí)種子的角質(zhì)層卻無(wú)裂痕。在顯微鏡下觀察硬實(shí)種子時(shí)，柵欄細(xì)胞外存在一條致密的透明帶，該透明帶可能與大豆種子硬實(shí)性高度相關(guān)[1,6-10]。Keim等[11]檢測(cè)到5個(gè)與野生大豆種子硬實(shí)性相關(guān)的RFLP（restrict fragment length polymorphism）標(biāo)記，可解釋71%的遺傳變異，其中一個(gè)包括位點(diǎn)的區(qū)間可解釋32%的遺傳變異。日本學(xué)者在C2（第6染色體）、D1b（第2染色體）和I（第20染色體）連鎖群發(fā)現(xiàn)大豆硬實(shí)性相關(guān)的QTL，并發(fā)現(xiàn)控制種皮色的位點(diǎn)（第8染色體）和控制茸毛色的位點(diǎn)（第6染色體）與大豆硬實(shí)緊密連鎖[12-14]。Singh等[15]檢測(cè)到4個(gè)SSR標(biāo)記（Satt434、Satt538、Satt281和Satt598）與種皮吸脹性緊密連鎖，解釋3.9%—4.5%的表型變異。利用硬實(shí)大豆PI 594619與大豆品種PI 587982A雜交，發(fā)現(xiàn)PI 594619的硬實(shí)性狀受1個(gè)單顯性基因控制，并將該基因定位于第2染色體（D1b連鎖群）[16]。最近，利用冀豆12與硬實(shí)地方品種黑豆雜交構(gòu)建分離群體，除前期定位的第2和第6染色體外，在第14染色體（B2連鎖群）上也定位了硬實(shí)相關(guān)QTL[17]。Jang等[18]通過(guò)精細(xì)定位，將第2染色體一個(gè)控制大豆種子硬實(shí)性的QTL（）定位于93 kb區(qū)間，在10個(gè)注釋基因中推測(cè)編碼1,4-β-葡聚糖內(nèi)切酶的為候選基因，將來(lái)自硬實(shí)近等基因系的基因組片段轉(zhuǎn)入吸脹品種中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因促進(jìn)了柵欄細(xì)胞外層1,4-β-葡聚糖的積累，導(dǎo)致種子產(chǎn)生硬實(shí)。而Sun等[19]研究發(fā)現(xiàn)野生大豆PI 468916和PI 479752的硬實(shí)性受單顯性基因控制，并將該基因錨定到第2染色體22 kb區(qū)間，排除了，最后確定編碼鈣調(diào)磷酸跨膜蛋白的為候選基因，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)證明該基因是控制大豆種子硬實(shí)的關(guān)鍵位點(diǎn)。上述研究說(shuō)明了控制大豆種子硬實(shí)性遺傳機(jī)制的復(fù)雜性，同時(shí)也說(shuō)明不同遺傳背景下可能存在不同的硬實(shí)性相關(guān)QTL位點(diǎn)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前人通過(guò)傳統(tǒng)的群體遺傳圖譜構(gòu)建方法進(jìn)行大豆種子硬實(shí)性基因/QTL定位的研究，往往費(fèi)時(shí)費(fèi)力。BSA法作為一種快速檢測(cè)與目標(biāo)性狀連鎖標(biāo)記的方法[20]，在大豆株高、抗逆和品質(zhì)性狀的基因/QTL定位研究中被廣泛應(yīng)用[21-31]。但迄今為止，在大豆硬實(shí)性重要基因/QTL定位中的研究尚未見(jiàn)BSA法應(yīng)用的報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究利用中國(guó)栽培大豆中黃39與野生大豆NY27-38雜交構(gòu)建的分離群體，采用BSA法開(kāi)展大豆種子硬實(shí)性QTL定位研究，通過(guò)與傳統(tǒng)遺傳作圖方法比較，明確BSA法發(fā)掘大豆種子硬實(shí)相關(guān)主效QTL位點(diǎn)的效率，促進(jìn)野生大豆種子硬實(shí)性遺傳機(jī)制研究，為野生大豆在大豆遺傳改良中的合理利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所選育的中黃39為母本，以野生大豆NY27-38（從國(guó)家種質(zhì)資源庫(kù)保存的河北省承德市的野生大豆ZYD2738中選擇的單株）為父本配制雜交組合。2014年在北京順義種植來(lái)自一個(gè)F1單株的F2分離群體，F(xiàn)3代開(kāi)始每個(gè)世代都采用單粒傳繁殖，2017年在北京順義種植重組自交系群體（recombinant inbred lines，RIL）（F7，203個(gè)家系）；2015年在北京順義種植來(lái)自另一個(gè)F1單株的F2分離群體（301個(gè)單株）。行長(zhǎng)3 m，株距0.5 m，行距1.1 m。田間采集單株葉片，液氮冷凍后保存在-80℃冰箱備用。在植株完熟時(shí)單株收獲，為避免種子的機(jī)械損傷，采用手工脫粒。

1.2 種子吸脹性鑒定

從每個(gè)單株上選取整齊一致的種子90粒，在鋪有一層濾紙的培養(yǎng)皿中放置30粒，加入30 mL蒸餾水，3次重復(fù)。將培養(yǎng)皿放置于25℃培養(yǎng)箱中暗處理4 h，體積增加的種子，為正常吸脹種子，大小不變的種子為硬實(shí)種子。統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中正常吸脹種子數(shù)，以3次重復(fù)的吸脹百分率平均值作為單株的吸脹率。吸脹率=正常吸脹種子粒數(shù)/測(cè)定粒數(shù)×100%，吸脹率≤20%的為硬實(shí)，吸脹率介于20%—80%的為中間類型，吸脹率≥80%的為吸脹[19]。

1.3 基因組DNA提取與DNA池構(gòu)建（BSA法）

從每個(gè)單株上取壹元硬幣大小的嫩葉，用DNA純化試劑盒（genomic DNA purification kit，Thermo Scientific）提取單株葉片基因組DNA。在F2群體中，共取樣38個(gè)單株，包括22個(gè)種子正常吸脹單株（吸脹率＞90%）和16個(gè)硬實(shí)單株（吸脹率＜10%）；在F7群體中，共取樣40個(gè)單株，包括20個(gè)完全吸脹單株（吸脹率=100%）和20個(gè)完全硬實(shí)單株（吸脹率=0%），單株DNA等量混合，分別構(gòu)建吸脹和硬實(shí)DNA池。

1.4 分子標(biāo)記的選擇及分析

從SoyBase數(shù)據(jù)庫(kù)（https://soybase.org/）中選擇分布于大豆20條染色體的543個(gè)SSR標(biāo)記（每條染色體的標(biāo)記數(shù)在17—40個(gè)，平均每條染色體上27個(gè)標(biāo)記），由博邁德生物技術(shù)有限公司合成，用中黃39和NY27-38進(jìn)行多態(tài)性引物篩選。根據(jù)發(fā)表文章合成CAPS標(biāo)記Hs1AseI的2條引物（F：5′-TTTAACCTCAAGTGGAGTTAC-3′；R：5′-CTAAC TTCAAGAGTGCAATGT-3′）[19]。

PCR總反應(yīng)體系為20 μL，包括10×Easy Taq Buffer（Mg2+）2.0 μL、2.5 mmol·L-1dNTPs 1.5 μL、無(wú)菌水9.3 μL、Taq 酶（5 U·μL-1）0.2 μL、引物（2 μmol·L-1）2.0 μL和DNA（20 ng μL-1）5.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃5 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，34個(gè)循環(huán)；72℃5 min，4℃保存。SSR標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。CAPS標(biāo)記Hs1AseI的PCR產(chǎn)物用內(nèi)切酶Ⅰ酶切，酶切體系為10 μL：PCR產(chǎn)物5.0 μL、無(wú)菌水3.4 μL、Ⅰ內(nèi)切酶（NEB, USA）0.6 μL和10×NEB Buffer 1.0 μL，混勻并置于37℃酶切1 h，酶切產(chǎn)物用1.4%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.5 BSA法和遺傳群體作圖法定位硬實(shí)性相關(guān)QTL

BSA法：利用親本間有多態(tài)性的259個(gè)多態(tài)性SSR標(biāo)記對(duì)F2和F7群體的吸脹池和硬實(shí)池進(jìn)行檢測(cè)，篩選在硬實(shí)和吸脹DNA池間表現(xiàn)多態(tài)性的SSR標(biāo)記（其中一個(gè)DNA池?cái)U(kuò)增的條帶粗細(xì)為另一個(gè)DNA池相應(yīng)條帶的1/2或更低時(shí)，判定該標(biāo)記在2個(gè)DNA池間存在多態(tài)性）。用池間有多態(tài)性的標(biāo)記檢測(cè)F2群體中所有單株的DNA，利用QTL IciMapping4.0（http://www.isbreeding.net）軟件繪制遺傳連鎖圖譜，并進(jìn)行QTL定位（臨界閾值LOD=2.5）。

遺傳群體作圖法：利用分布于大豆20條染色體的192個(gè)SSR標(biāo)記檢測(cè)F7群體203個(gè)單株，利用QTL IciMapping4.0軟件繪制遺傳連鎖圖譜，并進(jìn)行QTL定位（臨界閾值LOD=2.5）。

2 結(jié)果

2.1 大豆種子硬實(shí)性鑒定及遺傳分析

2.1.1 大豆種子硬實(shí)性鑒定 從中黃39、NY27-38，以及F1單株收獲的種子（F1:2）中各取50粒完整種子，用蒸餾水處理。處理2 h，中黃39的種子開(kāi)始吸脹，其中26%的種子完全吸脹，74%的種子表現(xiàn)種皮皺縮，未達(dá)到完全吸脹；NY27-38有2粒種子吸脹；F1:2有4粒種子吸脹。處理4 h，中黃39的種子100%吸脹；NY27-38種子有3粒吸脹；F1:2種子有4粒吸脹。根據(jù)親本表現(xiàn)將種子吸脹鑒定時(shí)間確定為4 h（圖1-A和圖1-B）。

中黃39×NY27-38的F1:2種子處理4 h時(shí)，92%的種子表現(xiàn)為硬實(shí)，說(shuō)明硬實(shí)為顯性，吸脹為隱性。F2群體301個(gè)單株中，吸脹率≤20%的有53株，吸脹率介于20%—80%的為155株，吸脹率≥80%的為93株（圖1-C）。F7群體203個(gè)家系，吸脹率≤20%的為105個(gè)，吸脹率介于20%—80%的為45個(gè)，吸脹率≥80%的為53個(gè)（圖1-D）。

2.1.2 種子硬實(shí)性與種皮色的關(guān)系 前人研究發(fā)現(xiàn)大豆種子硬實(shí)性與種皮色相關(guān)位點(diǎn)和連鎖[12]。本研究中，F(xiàn)2分離群體包括78個(gè)黃種皮、151個(gè)綠種皮、26個(gè)褐種皮和46個(gè)黑種皮單株。吸脹和硬實(shí)大豆中都包括不同種皮色材料，但比例各不相同（圖2-A）。硬實(shí)單株中黑種皮材料最多（占50.0%），中間類型和吸脹單株主要為綠種皮（在中間類型中占54.3%，在吸脹單株中占50.0%）（圖2-B）。F7群體包括58個(gè)黃種皮、36個(gè)綠種皮、70個(gè)褐種皮和39個(gè)黑種皮單株，硬實(shí)單株中黑種皮材料最多（占32.4%），中間類型主要是黃種皮（占51.1%），吸脹單株中褐種皮最多（占60.4%）（圖2-C）。

2.2 大豆種子硬實(shí)性QTL定位

2.2.1 BSA法定位種子硬實(shí)相關(guān)QTL 用親本間有多態(tài)性的259個(gè)SSR標(biāo)記分析F2群體吸脹和硬實(shí)DNA池，共篩選到18個(gè)與大豆種子硬實(shí)相關(guān)的SSR標(biāo)記，其余的標(biāo)記在2個(gè)DNA池間無(wú)差別。在第2染色體上16.3 Mb區(qū)間有10個(gè)多態(tài)性SSR標(biāo)記，包括Satt141、Satt703、Sat_069、Sat_183、Satt274、Satt459、Sat_198、Sat_415、Sat_192和Sat_283，其中Satt274、Satt459在DNA池間顯示帶型有/無(wú)的差異，即在吸脹DNA池中只有吸脹親本中黃39的條帶，硬實(shí)DNA池中只有硬實(shí)親本NY27-38的條帶，Sat_198和Sat_415在吸脹DNA池中只有吸脹親本（中黃39）帶型，硬實(shí)池中是雙親帶型。其余位點(diǎn)在2個(gè)DNA池均擴(kuò)增出雙親帶型，但不同親本來(lái)源的條帶粗細(xì)有差別。說(shuō)明在該染色體16.3 Mb區(qū)間的標(biāo)記在吸脹和硬實(shí)DNA池間都顯示多態(tài)性（圖3-A）。第6染色體上23.4 Mb區(qū)間有8個(gè)SSR標(biāo)記在2個(gè)池間條帶粗細(xì)的差異，分別為Satt376、Satt286、Satt277、Satt557、BARCSOYSSR_06_1068、BARCSOYSSR_06_1090、BARCSOYSSR_06_1155和BARCSOYSSR_06_1339，未發(fā)現(xiàn)DNA池間帶型有/無(wú)差異。利用這些SSR標(biāo)記對(duì)F2群體所有單株進(jìn)行檢測(cè)，定位到2個(gè)主效QTL，硬實(shí)的增效性來(lái)自野生大豆NY27-38。第2染色體QTL位于標(biāo)記Satt274與Sat_198之間，LOD值13.3，可解釋17.2%的表型變異。第6染色體QTL位于標(biāo)記BARCSOYSSR_06_0993與BARCSOYSSR_06_1068之間，LOD值為13.0，可解釋17.8%的表型變異。

利用親本間有多態(tài)性的259個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)F7群體的吸脹和硬實(shí)DNA池進(jìn)行檢測(cè)，共篩選到24個(gè)在吸脹和硬實(shí)池間存在差異的SSR標(biāo)記，其余的標(biāo)記在兩池間無(wú)差別。第2染色體27.4 Mb區(qū)間上有11個(gè)，其中Satt274、Satt459顯示帶型有/無(wú)差異，其余標(biāo)記在2個(gè)DNA池顯示條帶粗細(xì)差別（圖4-A）。第6染色體27.8 Mb 區(qū)間上有9個(gè)標(biāo)記，位于Satt376和Satt460之間（圖4-B）；第3染色體18.2 Mb 區(qū)間上有4個(gè)，分別為Satt125、Sat_280、Sat_266和Sat_236（圖4-C）。在第3和第6染色體上，吸脹與硬實(shí)DNA池間的多態(tài)性SSR標(biāo)記都是條帶粗細(xì)差別。

2.2.2 遺傳群體作圖及硬實(shí)性相關(guān)QTL定位 為驗(yàn)證BSA方法檢測(cè)硬實(shí)性相關(guān)QTL的效率，利用分布于大豆20條染色體的192個(gè)SSR標(biāo)記檢測(cè)F7群體203個(gè)家系，構(gòu)建了長(zhǎng)度為2 390.2 cM的遺傳圖譜（平均每條染色體上10個(gè)標(biāo)記，標(biāo)記間平均距離為12.4 cM），共定位到3個(gè)大豆種皮硬實(shí)性QTL，硬實(shí)的增效性來(lái)自野生大豆NY27-38。第2染色體的QTL位于標(biāo)記Satt274與Sat_198之間，LOD值14.0，可解釋23.3%的表型變異，該區(qū)間包括已克隆的[19]；第3染色體上的QTL位于標(biāo)記Sat_266與Sat_236之間，LOD值2.7，可解釋4.9%的表型變異；第6染色體上的QTL位于標(biāo)記Sat_402與Satt557之間，LOD值11.5，可解釋20.4%的表型變異（表1）。3個(gè)QTL的定位區(qū)間與BSA法篩選的池間差異SSR標(biāo)記分布區(qū)間吻合（圖4），說(shuō)明BSA法可以篩選到所有F7群體用傳統(tǒng)遺傳作圖法檢測(cè)到的硬實(shí)相關(guān)主要QTL位點(diǎn)。

A：中黃39、NY27-38、F1:2種子處理0、2和4 h的吸脹表型；B：處理12 h，中黃39、NY27-38、F1:2種子在不同時(shí)間點(diǎn)的吸脹比例；C：F2群體吸脹頻率分布；D：F7群體吸脹頻率分布

A：F2群體不同種皮色大豆處理4 h吸脹性；B：F2群體不同種皮色大豆的表型分布；C：F7群體不同種皮色大豆的表型分布

表1 不同群體檢測(cè)到的大豆種子硬實(shí)性QTL

2.2.3 中黃39×NY27-38的F2和F7群體的QTL對(duì)吸脹性的影響 為分析不同QTL位點(diǎn)的效應(yīng)，選擇每個(gè)區(qū)間與QTL緊密連鎖的標(biāo)記，分析不同基因型材料的吸脹性。在F2群體中，當(dāng)個(gè)體在第2染色體QTL位點(diǎn)的基因型為吸脹親本中黃39基因型（標(biāo)記為a），而第6染色體基因型分別為中黃39基因型（a）、雜合（h）、野生大豆基因型（b）的單株平均吸脹百分率為92.5%、84.0%和66.7%；當(dāng)個(gè)體在第2染色體QTL位點(diǎn)的基因型為雜合（h），而第6染色體基因型分別為中黃39基因型（a）、雜合（h）、野生大豆基因型（b）的單株平均吸脹百分率為72.9%、40.1%和45.2%；當(dāng)?shù)?染色體基因型固定為b（來(lái)自野生大豆的基因型），而第6染色體基因型分別為a（吸脹等位變異）、h（雜合）、b（硬實(shí)等位變異）的平均吸脹百分率為67.3%、41.4%和43.5%（圖5-A）。

A：第2染色體DNA池多態(tài)性SSR標(biāo)記鑒定；B：第6染色體DNA池多態(tài)性SSR標(biāo)記鑒定。1：吸脹池；2：硬實(shí)池

在F7群體中，由于第2染色體定位區(qū)間包括已克隆的，因此，該區(qū)間采用功能基因標(biāo)記Hs1AseI的基因型[19]。當(dāng)?shù)?和第3染色體QTL位點(diǎn)的基因型為a，第6染色體基因型為b時(shí)的單株平均吸脹百分率為66.0%。當(dāng)?shù)?和第3染色體QTL位點(diǎn)基因型為b，第6染色體基因型為a時(shí)的單株平均吸脹百分率為35.8%。當(dāng)?shù)?和第6染色體基因型為a，第3染色體基因型為b時(shí)的單株平均吸脹百分率為77.0%。當(dāng)?shù)?和第6染色體基因型為b，第3染色體基因型為a時(shí)的單株平均吸脹百分率為14.6%。當(dāng)3個(gè)定位區(qū)間基因型全為a時(shí)（n=19），平均吸脹百分率為81.5%；當(dāng)3個(gè)定位區(qū)間基因型全為b時(shí)（n=27），平均吸脹百分率為4.1%（圖5-B），說(shuō)明3個(gè)位點(diǎn)存在加性效應(yīng)，其中第2和第6染色體QTL效應(yīng)更大。

3 討論

3.1 不同遺傳背景大豆種子硬實(shí)性QTL定位

大豆種子硬實(shí)是一個(gè)復(fù)雜的數(shù)量性狀，不同遺傳背景下，控制硬實(shí)的位點(diǎn)不完全相同。在本研究中，F(xiàn)2群體硬實(shí)與吸脹分離比不符合3﹕1（χ=10.73，=0.0043），說(shuō)明該群體硬實(shí)性并非由單基因控制，與已有報(bào)道不同[18-19]。利用F2和RIL群體在第2染色體276.0 kb區(qū)間定位的主效QTL，包含前人在第2染色體的定位區(qū)間[12,16,18-19]，與艾麗娟等[17]發(fā)現(xiàn)的第2染色體QTL（標(biāo)記Sat_069與Sat_183）相距941.0 kb。說(shuō)明第2染色體上的硬實(shí)相關(guān)位點(diǎn)是不同野生大豆中共有的重要QTL位點(diǎn)。F2與F7群體的第6染色體上與硬實(shí)相關(guān)的區(qū)間部分重疊，該區(qū)間包含在地方品種黑豆中檢測(cè)到的26.9 MB區(qū)間（Sat_402—Satt460）內(nèi)[17]。Watanabe等[13]發(fā)現(xiàn)的QTL（標(biāo)記Satt489與Satt100之間）和Sakamoto等[12]定位的大豆種子硬實(shí)性QTL（標(biāo)記Satt316和Satt489之間）都與本研究在第6染色體的定位區(qū)間相距3.1 Mb。Singh等[15]檢測(cè)到的與Satt281緊密連鎖QTL與本研究第6染色體的定位區(qū)間相距9.8 Mb。這些研究表明，在第6染色體也存在不同材料間共有的硬實(shí)性相關(guān)QTL位點(diǎn)，可以作為進(jìn)一步研究的重要位點(diǎn)。前人研究報(bào)道大豆種子硬實(shí)QTL與種皮色位點(diǎn)和位點(diǎn)位置相鄰近或可能其本身是控制大豆種子硬實(shí)的一個(gè)QTL[11-13]。大豆種皮色相關(guān)的位點(diǎn)（18534606—18541507，Wm82.a1. v1.1）位于本研究的第6染色體QTL區(qū)間內(nèi)，這在一定程度上解釋了不同種皮色的家系吸脹性存在差異的原因，尤其是黑種皮大豆吸脹率顯著低于其他種皮色大豆。除此之外，本研究在第3染色體1.6 Mb區(qū)間定位到一個(gè)尚未報(bào)道的貢獻(xiàn)率為4.9%的QTL，說(shuō)明該位點(diǎn)可能為NY27-38特有的位點(diǎn)。

A：第2染色體DNA池多態(tài)性SSR標(biāo)記鑒定；B：第6染色體DNA池多態(tài)性SSR標(biāo)記鑒定；C：第3染色體DNA池多態(tài)性SSR標(biāo)記鑒定。1：吸脹池；2：硬實(shí)池

A：F2群體；B：F7群體 A: F2 population; B: F7 population

3.2 BSA法可用于大豆硬實(shí)性QTL的高效發(fā)掘

BSA法在大豆基因/QTL定位中已有較多報(bào)道，Mansur等[21]利用RFLP標(biāo)記驗(yàn)證了BSA方法發(fā)掘大豆成熟期、株高、抗倒伏和產(chǎn)量性狀相關(guān)QTL的有效性。之后BSA法逐步被應(yīng)用于大豆抗病、抗蟲(chóng)和耐逆境脅迫性狀的研究，在大豆離子含量和營(yíng)養(yǎng)成分等相關(guān)的品質(zhì)性狀研究中也有報(bào)道[21-31]。為確定BSA法在大豆種子硬實(shí)性QTL定位中的應(yīng)用效果，本研究利用F2和F7群體進(jìn)行相關(guān)研究，分別檢測(cè)到18個(gè)和24個(gè)在硬實(shí)和吸脹DNA池間有差異的SSR標(biāo)記。利用F7群體構(gòu)建包括192個(gè)SSR標(biāo)記的遺傳圖譜，復(fù)合區(qū)間作圖定位到3個(gè)硬實(shí)相關(guān)QTL，分別對(duì)應(yīng)在第2、第6和第3染色體利用BSA法篩選的區(qū)間，表明利用BSA法挖掘大豆種子硬實(shí)QTL的高效性。值得關(guān)注的是，利用BSA法在F7群體中檢測(cè)到一個(gè)位于第3染色體的微效QTL（LOD=2.7，貢獻(xiàn)率4.9%），BSA法在F2群體中未檢測(cè)到該位點(diǎn)。為確定是否由于該位點(diǎn)在F2群體中效應(yīng)較小而不能被BSA法檢測(cè)到，本研究利用該區(qū)間的3個(gè)分子標(biāo)記（Satt125、Satt549、Satt312）對(duì)F2群體進(jìn)行檢測(cè)，遺傳作圖后也未檢測(cè)到超過(guò)閾值的QTL，說(shuō)明了不同分離世代QTL位點(diǎn)的貢獻(xiàn)率不同。比如在第2染色體（已克隆的）定位區(qū)間為中黃39的基因型（a）時(shí)，若其他位點(diǎn)基因型為野生大豆基因型（b），F(xiàn)2單株的平均吸脹率為66.7%，而在F7分離群體中這類單株的平均吸脹率只有37.2%（圖5）。利用BSA法發(fā)掘農(nóng)藝性狀相關(guān)QTL位點(diǎn)時(shí)，如果極端個(gè)體數(shù)量過(guò)少，容易檢測(cè)到假陽(yáng)性位點(diǎn)。與基因型分離最豐富的F2群體相比，RIL群體具有來(lái)自雙親的穩(wěn)定重組，在本研究中利用極端個(gè)體進(jìn)行DNA池構(gòu)建時(shí)，RIL群體的極端家系數(shù)量更多（吸脹率為0和100%的家系分別有20個(gè)和20個(gè)），在F2群體中吸脹率為0和100%的家系分別有0個(gè)和8個(gè)，將極端個(gè)體表型值分別調(diào)整為10%和90%時(shí)才有足夠的個(gè)體構(gòu)建DNA池。這與Wang等[32]對(duì)F2、RIL和DH群體綜合分析后的結(jié)論相同，即利用F2群體構(gòu)建DNA池進(jìn)行QTL位點(diǎn)發(fā)掘效果較差，RIL群體建池效果更好。但無(wú)論F2或RIL群體，均可利用BSA法快速發(fā)掘與硬實(shí)相關(guān)的主效QTL染色體區(qū)間（圖3和圖4）。目前，BSA法已與全基因組測(cè)序（bulked-segregant analysis sequencing，BSA-Seq）或轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（bulked segregant RNA- sequencing，BSR-Seq）相結(jié)合，用于不同作物重要性狀相關(guān)QTL或候選基因的發(fā)掘[33-36]。

與傳統(tǒng)遺傳群體作圖相比（本研究為203個(gè)家系，192個(gè)SSR標(biāo)記），BSA法只需要用親本間多態(tài)性的分子標(biāo)記（本研究中為259個(gè)SSR標(biāo)記）對(duì)極端個(gè)體混合獲得的2個(gè)DNA池進(jìn)行檢測(cè)，一旦確定候選區(qū)間，也僅需要用候選區(qū)間的幾個(gè)標(biāo)記檢測(cè)整個(gè)群體，通過(guò)連鎖分析進(jìn)行QTL準(zhǔn)確定位，大大提高QTL發(fā)掘效率。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)不同染色體上兩個(gè)DNA池間有多態(tài)性的標(biāo)記分布在16.3—27.8Mb區(qū)間內(nèi)，說(shuō)明在用BSA法進(jìn)行QTL區(qū)間篩選時(shí)，確保每5.0 Mb有一個(gè)多態(tài)性標(biāo)記，在候選區(qū)間會(huì)檢測(cè)到連續(xù)多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，可有效排除假陽(yáng)性位點(diǎn)。

4 結(jié)論

在F2（中黃39×野生大豆NY27-38）分離群體檢測(cè)到2個(gè)與硬實(shí)性相關(guān)QTL位點(diǎn)，在F7分離群體檢測(cè)到3個(gè)與硬實(shí)性相關(guān)QTL位點(diǎn)。利用192個(gè)SSR標(biāo)記檢測(cè)F7分離群體203個(gè)家系，構(gòu)建遺傳圖譜，在第2、3和6染色體共定位到3個(gè)大豆種子硬實(shí)性QTL，與BSA法發(fā)掘的QTL位點(diǎn)一致。證明用分離群體中的16—22個(gè)極端個(gè)體構(gòu)建DNA池，在染色體上每5.0 Mb物理距離選擇一個(gè)親本間多態(tài)性標(biāo)記，即可有效發(fā)掘大豆種子硬實(shí)性主要QTL。

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QTL Mapping of Hard Seededness in Wild Soybean Using BSA Method

CHEN JingJing, LIU XieXiang, YU LiLi, LU YiPeng, ZHANG SiTian, ZHANG HaoChen, GUAN RongXia, QIU LiJuan

(Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement (NFCRI)/Key Laboratory of Germplasm Utilization, Ministry of Agriculture, Beijing 100081)

【】Hard seededness of wild soybean is an important effector that limits the utilization of wild resources in soybean genetic improvement. Bulked segregant analysis (BSA) was employed to identify major quantitative trait loci (QTLs) related with hard seededness in soybean, which laid a foundation for effective utilization of wild soybean germplasm in cultivated soybean improvement. 【】F2and F7segregation populations were constructed from a cross between cultivated soybean Zhonghuang39 and wild soybean NY27-38. Uniformly sized seeds were selected from each line, and 30 seeds were soaked in a petri dish with 30 mL distilled water for 4 hours at 25℃. The assay was replicated 3 times. The number of permeable and impermeable seeds were counted. In F2population, the first DNA pool was constructed from 22 individuals with permeable seeds (imbibition rate ＞90%), and second DNA pool was constructed from 16 individuals with impermeable seeds (imbibition rate ＜10%). In F7population, 20 lines with permeable seeds (100% imbibition) and 20 lines with impermeable seeds (no imbibition) were used to construct two DNA pools, respectively. To detect genomic regions associated with hard seededness, these DNA bulks were genotyped with 259 polymorphic SSR markers to identify markers linked to QTL. A linkage map was constructed with 192 SSR markers, QTLs related with hard seededness were identified by composite interval mapping in F7segregation population. 【】 Out of 259 SSR loci polymorphic between Zhonghuang39 and NY27-38, 10 and eight polymorphic SSR markers between the permeable and impermeable pools were detected in 16.3 Mb interval on chromosome 2 and 23.4 Mb interval on chromosome 6, respectively, in F2population. The QTL region (276.0 kb) located between Satt274 and Sat_198 on chromosome 2 contained previously cloned gene, the QTL explained 17.2% of the total genetic variation. The other QTL was mapped on chromosome 6 flanked by BARCSOYSSR_06_0993 and BARCSOYSSR_06_1068, accounting for 17.8% of the total genetic variation. In F7population, eleven, nine and four SSR polymorphic markers between the permeable and impermeable pools were detected in 27.4 Mb interval on chromosome 2, 27.8 Mb interval on chromosome 6, 18.2 Mb interval on chromosome 3, respectively. A linkage map of 192 SSR markers and covering 2 390.2 cM was constructed through composite interval mapping in F7population. Three QTLs related with hard seededness were detected. The QTL on chromosome 2 located between Satt274 and Sat_198, explained 23.3% of the total genetic variation; the QTL on chromosome 6 flanked by Sat_402 and Satt557, explained 20.4% of the total genetic variation; the QTL on chromosome 3 flanked by Sat_266 and Sat_236 accounted for 4.9% of the total genetic variation.【】In this study, three QTLs related to soybean hard seededness were identified by both BSA and traditional linkage mapping, indicating that BSA is an effective strategy for identifying QTLs in soybean.

soybean; hard seededness; QTL mapping

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.13.002

2019-02-28；

2019-04-14

國(guó)家自然科學(xué)基金（31830066）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（S2018QY03）

陳靜靜，E-mail：1061184187@qq.com。

關(guān)榮霞，E-mail：guanrongxia@caas.cn

（責(zé)任編輯 李莉）