謝潔，王明，丁紅映，李青，王萬興，熊興耀，秦玉芝

馬鈴薯低溫響應(yīng)的及其靶基因表達(dá)與結(jié)構(gòu)分析

謝潔1，王明1，丁紅映1，李青1，王萬興2，熊興耀2，秦玉芝1

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，長沙 410128；2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

【】研究馬鈴薯富含亮氨酸重復(fù)序列(leucine-rich repeat receptor-like protein kinase LRR-RLK)類受體蛋白激酶基因受（）調(diào)控響應(yīng)非生物脅迫的機(jī)理。通過低溫響應(yīng)馬鈴薯miRNA測序分析與靶基因預(yù)測，發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控1個(gè)可能的LRR類受體蛋白激酶基因?qū)Φ蜏刈龀鲰憫?yīng)；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（Quantitative Real-time PCR，RT-qPCR）驗(yàn)證和響應(yīng)低溫脅迫的表達(dá)情況；利用RLM-5′RACE確定作用于的切割位點(diǎn)；利用PCR技術(shù)克隆得到的DNA序列和CDS序列，生物信息學(xué)分析的結(jié)構(gòu)和功能；利用RT-qPCR分析/在馬鈴薯各組織中的表達(dá)情況及其響應(yīng)各種非生物脅迫的表達(dá)情況。RT-qPCR結(jié)果表明，低溫誘導(dǎo)表達(dá)，的表達(dá)則受到低溫的抑制，和的表達(dá)在低溫脅迫下呈負(fù)相關(guān)性；RLM-5′RACE分析表明，作用于的切割位點(diǎn)是ATTCCT//CCTGAGTT，馬鈴薯/調(diào)控模塊在低溫響應(yīng)中起作用?？寺〗Y(jié)果表明的CDS序列長度為2 685 bp，編碼894個(gè)氨基酸，DNA序列長度為3 549 bp，含有1個(gè)內(nèi)含子、2個(gè)外顯子、3′非編碼區(qū)和5′非編碼區(qū)，的靶位點(diǎn)位于CDS序列內(nèi)部（960—981 bp，GGAACTATTCCTCCTGAGTTT）。生物信息學(xué)顯示是1個(gè)富含亮氨酸重復(fù)序列(leucine-richrepeat，LRR)的類受體蛋白激酶基因，編碼的蛋白屬于跨膜分泌蛋白。馬鈴薯組織表達(dá)RT-qPCR分析顯示，在葉中的表達(dá)量最高，根次之，莖中（地上莖、塊莖和匍匐莖）表達(dá)量較低；而的表達(dá)情況與相反，其在葉中的表達(dá)最低，在莖中表達(dá)最高（匍匐莖>塊莖>地上莖）。多種非生物脅迫結(jié)果顯示，和表達(dá)在NaCl脅迫下呈負(fù)相關(guān)，受到NaCl脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。與對照相比，ABA和6-BA處理下表達(dá)先下降之后呈波浪小幅回調(diào)；6-BA處理下表達(dá)持續(xù)升高，ABA處理下表達(dá)先上升后下降。GA3、PEG和IAA處理8 h時(shí)，的表達(dá)達(dá)到峰值，GA3、PEG和IAA處理都能誘導(dǎo)表達(dá)，但其變化趨勢與相關(guān)性不強(qiáng)。具備編碼LRR類受體蛋白激酶的核酸、氨基酸序列和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是的靶基因；/調(diào)控模塊在馬鈴薯組織器官中具備明顯作用；在轉(zhuǎn)錄后水平通過抑制馬鈴薯的表達(dá)對低溫脅迫做出響應(yīng)，同時(shí)，馬鈴薯調(diào)控模塊在NaCl和6-BA脅迫響應(yīng)中起作用，但不對ABA、GA3、IAA和PEG脅迫做出響應(yīng)，和分別在轉(zhuǎn)錄水平受到ABA、GA3、IAA和PEG脅迫信號調(diào)控。

馬鈴薯；；；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；RLM-5′RACE

0 引言

【研究意義】（）家族是一個(gè)古老且高度保守的家族，廣泛參與植物的生長發(fā)育、側(cè)生器官極性形成、花器官形成及脅迫響應(yīng)[1]。富含亮氨酸重復(fù)受體的蛋白激酶在參與植物抗逆性反應(yīng)、發(fā)育調(diào)控及激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中發(fā)揮作用[2]。運(yùn)用分子生物學(xué)手段探索脅迫相關(guān)基因的表達(dá)特征和受（）調(diào)控的模式，對將來利用基因工程手段進(jìn)行耐逆境馬鈴薯品種的選育與改良具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】miRNA是一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，通過對mRNA進(jìn)行切割或造成翻譯阻遏來抑制靶標(biāo)基因的表達(dá)[3]，實(shí)現(xiàn)對環(huán)境脅迫信號的響應(yīng)[4-6]。研究表明進(jìn)入RISC后通過“Two-Hit”（兩個(gè)的靶向位點(diǎn)）的機(jī)制作用在上，誘導(dǎo)產(chǎn)生兩個(gè)（靶向基因），這兩個(gè)序列相似，都可以作用在上，對靶mRNA進(jìn)行切割或翻譯抑制使沉默[7]。植物在自然條件下經(jīng)常受到冷、旱、NaCl、激素、重金屬等多種非生物因素的脅迫，目前，對響應(yīng)低溫及各種非生物脅迫已有不少研究。木薯在低溫脅迫下的表達(dá)量下降[8]，高山冰緣植物高山離子芥中通過調(diào)控靶基因的表達(dá)對低溫做出響應(yīng)[9]，在低溫脅迫處理的甜楊幼苗葉片中表達(dá)升高，表達(dá)情況與在毛果楊受4℃低溫處理后經(jīng)微陣列分析獲得的表達(dá)譜結(jié)果極為相似[10]。對煙草進(jìn)行干旱脅迫和恢復(fù)澆水處理研究顯示，在不同干旱條件下出現(xiàn)差異表達(dá)[11]，表明可能參與植物的NaCl脅迫響應(yīng)過程。研究人員通過分析NaCl脅迫下玉米冠根組織的降解組文庫，檢測到的靶標(biāo)無機(jī)焦磷酸酶顯著變化[12]，在高粱[13]、煙草[14]、擬南芥[15]和大麥[16]等植物中都發(fā)現(xiàn)無機(jī)焦磷酸酶在NaCl脅迫下表達(dá)量發(fā)生改變，推測能通過調(diào)控?zé)o機(jī)焦磷酸酶的表達(dá)參與多種植物的NaCl脅迫響應(yīng)；大豆研究中發(fā)現(xiàn)，還可以通過靶向作用于參與植物的NaCl脅迫響應(yīng)[17]。激素脅迫同樣影響的表達(dá)，BA能顯著促進(jìn)‘全明星’草莓試管苗中的表達(dá)；IAA也能顯著提高其中的表達(dá)量[18]。Yoon等[19]研究指出，在高IAA濃度下（10 μmol·L-1或50 μmol·L-1）處理12—24 h，擬南芥的表達(dá)水平明顯增加，而在低濃度（10 nmol·L-1）下處理相同時(shí)間，表達(dá)量沒有顯著差異。重金屬脅迫是馬鈴薯生產(chǎn)過程中的重要影響因素之一，DING等[20]研究發(fā)現(xiàn)脅迫下過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系中OsHMA和OsNramp的表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)了水稻地上部分鎘積累量的增加。而亞麻中能編碼轉(zhuǎn)錄本，推測通過調(diào)控亞麻植物的生長過程在Al脅迫中起作用[22]。本研究中的一個(gè)預(yù)測靶基因?qū)俑缓涟彼嶂貜?fù)受體的蛋白激酶，該類蛋白激酶是植物應(yīng)答逆境和防御相關(guān)過程的重要酶類。LEE等[23]發(fā)現(xiàn)水稻中富含亮氨酸重復(fù)受體的蛋白激酶OsRLK1被低溫和NaCl脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，JUNG等[24]發(fā)現(xiàn)辣椒的CALRR1在高NaCl和脫落酸（ABA）等非生物脅迫下表達(dá)。【本研究切入點(diǎn)】/調(diào)控模塊響應(yīng)低溫等非生物脅迫的研究目前還未見報(bào)道。本研究試圖通過測序、RT-qPCR、克隆、RLM-5′ RACE等分子生物學(xué)手段探索馬鈴薯中/調(diào)控模塊作用模式。【擬解決的關(guān)鍵問題】克隆、解析序列結(jié)構(gòu)與功能，并研究/調(diào)控模塊在低溫、NaCl、6-BA、ABA、GA3、IAA和PEG脅迫下的響應(yīng)情況，同時(shí)分析與在馬鈴薯不同組織中的調(diào)控關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 植物材料

馬鈴薯GS393（LZ3.4），由美國威斯康星州馬鈴薯種質(zhì)庫（http://www.ars-grin. gov/npgs/acc/acc_queries.html）引進(jìn)的耐寒馬鈴薯材料，耐-4℃低溫，冷馴化后可耐-6℃。GS393組培苗按常規(guī)管理（19℃），出苗至莖抽生3—4節(jié)用于基因克隆和RLM-5′RACE試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)處理

2016年12月，對60瓶生長期一致的組培苗進(jìn)行冷馴化（5℃）及霜凍處理（-4℃），常規(guī)管理且生長期一致的組培苗作對照。進(jìn)入冷馴化前所取混合樣為CK；5℃馴化第1、2、3天的混合樣為TLX1（對照為CLX1）；5℃馴化第8、9、10天的混合樣為TLX2（對照為CLX2）；5℃馴化10 d后經(jīng)-4℃霜凍處理的前1、2、3 h的混合樣為TLH1（對照為CLH1）；5℃馴化10 d后經(jīng)-4℃霜凍處理的前7、8、9 h的混合樣為TLH2（對照為CLH2）。2016年12月底播種，常規(guī)大田管理，于2017年4月分別取根、莖、葉、匍匐莖和塊莖，進(jìn)行及的各組織特異性表達(dá)分析。2017年11月對180瓶生長期一致的馬鈴薯GS393組培苗分別用100 mg?L-1IAA、100 mg?L-1ABA、100 mg?L-16-BA、100 mg?L-1GA3、11.7 g?L-1NaCl和20 g?L-1PEG脅迫處理，用于和的表達(dá)分析。以上試驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù)，取材后用液氮迅速冷凍，-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物

利用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，由上海生工公司合成，其序列見表。

1.4 RNA的提取

總RNA的提取采用天根公司的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取，的提取采用天根公司的miRcutemiRNA提取分離試劑盒。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，用德國eppendorf Biospectrometer? basic紫外可見光熒光分光光度計(jì)（eppendorf Biospectromete? basic，Germany）檢測核酸的濃度和純度。

1.5 RT-PCR

總RNA的反轉(zhuǎn)錄采用北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司的金牌逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit），的反轉(zhuǎn)錄采用天根公司的miRcute增強(qiáng)型miRNAcDNA第一鏈合成試劑盒。

1.6 克隆

利用DNA凝膠回收試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收擴(kuò)增片段，與pEASY?-T5Zero Cloning Vector載體連接，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞中，通過藍(lán)白斑篩選PCR鑒定陽性克隆。DNA凝膠回收試劑盒購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，pEASY?- T5Zero Cloning Kit載體購自泰思德公司，其他藥品為國產(chǎn)分析純。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

的RT-qPCR檢測采用北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司的2×T5 Fast RT-qPCRMix，的RT-qPCR檢測采用天根公司的miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測試劑盒。使用ABI公司的7500定量PCR儀，96孔板和光學(xué)膜完成定量PCR反應(yīng)。以rRNA基因作為管家基因，清水模板為陰性對照，采用2-△△Ct法計(jì)算相對表達(dá)量的高低。

1.8 RLM-5′ RACE

5′ RACE參照FirstChoice?RLM-RACE Kit試劑盒的方法進(jìn)行，相應(yīng)酶購自promega公司，接頭引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.9 序列測定及分析

測序工作委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。利用NCBI （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行BLAST比對和基因編碼區(qū)ORF的預(yù)測；使用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）對進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測；使用portparam（http://web.expasy.org/ protparam/）工具分析SCLRRK1的理化性質(zhì)；使用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對SCLRRK1進(jìn)行跨膜區(qū)分析；使用signalP（http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）對SCLRRK1的信號肽進(jìn)行預(yù)測；使用NEBcutter（http://nc2.neb. com/NEBcutter2/index.php）對序列的限制性酶切位點(diǎn)進(jìn)行分析；使用predictprotein（https:// www.predictprotein.org/）在線軟件分析蛋白SCLRRK1的二級結(jié)構(gòu)；使用SWISS-MODEL（http://www.swissmodel. expasy.org/）在線分析軟件對SCLRRK1建模并獲得三級結(jié)構(gòu)模型。

2 結(jié)果

2.1 ScmiR390-5p負(fù)調(diào)控SCLRRK1并具有響應(yīng)低溫特性

2.1.1 馬鈴薯轉(zhuǎn)錄組及miRNA測序分析 采用Illumina HiSeqTM2500測序平臺對樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和miRNA高通量測序，以馬鈴薯（PGSC_DM_v4.03）為參考基因組，根據(jù)|log2 FC|≥1和FDR≤0.01比較、篩選差異表達(dá)基因（Differentially expressed genes，DEGs），與miRBase數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對—注釋，將序列與miRBase中該miRNA成熟體序列進(jìn)行無錯(cuò)配比對，比對上的序列定義為已知的miRNA。并以此為依據(jù)作為miRNA的表達(dá)量統(tǒng)計(jì)，進(jìn)行DEGs分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低溫馴化后期（8、9和10 d，圖1-A）106個(gè)miRNA上調(diào)，11個(gè)miRNA下調(diào)。其中8個(gè)上調(diào)miRNA的靶基因表現(xiàn)為顯著下調(diào)；3個(gè)上調(diào)miRNA的靶基因在轉(zhuǎn)錄組分析中表現(xiàn)為顯著上調(diào)；11個(gè)下調(diào)miRNA的靶基因中有2個(gè)在轉(zhuǎn)錄組分析中表現(xiàn)為顯著上調(diào)。進(jìn)入霜凍處理，與對照材料比較，馴化后的材料霜凍處理早期（前1、2和3 h，圖1-B）65個(gè)miRNA上調(diào)，238個(gè)miRNA下調(diào)。其中4個(gè)上調(diào)miRNA的靶基因在轉(zhuǎn)錄組分析中表現(xiàn)為顯著下調(diào)；6個(gè)上調(diào)miRNA的靶基因在轉(zhuǎn)錄組分析中表現(xiàn)為顯著上調(diào)。

表1 本研究所用引物序列

A: TLX2-CLX2; B: TLH1-CLH1

2.1.2靶基因預(yù)測 采用http://plantgrn. noble.org/psRNATarget/上的方法進(jìn)行miRNA靶基因預(yù)測，并根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析其差異顯著性與表達(dá)趨勢，本研究關(guān)注的及其差異顯著的靶基因表達(dá)情況見表2。因前期觀察到馴化后期和進(jìn)入霜凍前期都表現(xiàn)為上調(diào)，其預(yù)測靶基因（）、和則表現(xiàn)為顯著下調(diào)，本研究選定（）作為先期靶向調(diào)控基因研究對象，進(jìn)行基因克隆、靶向關(guān)系和脅迫響應(yīng)分析。

2.1.3 低溫脅迫下與的表達(dá) 通過生物信息學(xué)預(yù)測得到的靶基因（MG763883），RT-qPCR和半定量PCR結(jié)果如圖2所示。隨著低溫5℃馴化時(shí)間的增加的表達(dá)量增加，靶基因的表達(dá)持續(xù)下降，與未經(jīng)處理的GS393相比（CK），馴化后期的表達(dá)量僅0.05（圖2-B，A為對照）；未經(jīng)馴化的材料在霜凍（-4℃）脅迫下的表達(dá)量持續(xù)上升，靶基因的表達(dá)下降，但下降幅度沒有馴化脅迫明顯（圖2-C）；馴化材料霜凍處理的表達(dá)下降，預(yù)測靶基因的表達(dá)持續(xù)上升，馴化材料霜凍處理后期的表達(dá)量達(dá)到272（圖2-D）。結(jié)果表明，低溫脅迫下與的表達(dá)量存在負(fù)相關(guān)性。

2.1.4 低溫脅迫下可能通過結(jié)合的切割位點(diǎn)調(diào)控該基因表達(dá) 根據(jù)預(yù)測作用位點(diǎn)兩翼設(shè)計(jì)兩對引物，采用巢氏PCR擴(kuò)增目的基因片段，如圖3所示。靶基因擴(kuò)增出明亮的產(chǎn)物料帶，產(chǎn)物大小為415 bp，與預(yù)測結(jié)果一致，將上述PCR產(chǎn)物切膠回收直接與T載體連接，篩選鑒定陽性者送公司測序，克隆片段序列與預(yù)測結(jié)果一致，作用于靶基因的GGAACTATTCCT//CCTGAGTTT片段。與存在靶向關(guān)系，證明馬鈴薯低溫脅迫響應(yīng)中存在調(diào)控模塊。

表2 不同處理間ScmiR390-5p及其差異顯著的靶基因表達(dá)情況

CK：未做處理樣本取混合樣；TLX1：5℃馴化第1、2、3天的混合樣（對照CLX1）；TLX2：5℃馴化第8、9、10天的混合樣（對照CLX2）；TLH1：5℃馴化10 d后經(jīng)-4℃霜凍處理的前1、2、3 h的混合樣（對照CLH1）；TLH2：5℃馴化10 d后經(jīng)-4℃霜凍處理的前7、8、9 h的混合樣（對照CLH2）

圖3 ScmiR390-5p對SCLRRK1剪切位點(diǎn)的RLM–RACE驗(yàn)證

2.2 馬鈴薯SCLRRK1序列分析

2.2.1 馬鈴薯CDS序列分析 對NCBI的EST數(shù)據(jù)庫中馬鈴薯EST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索獲得的序列信息。在CDS序列的兩端設(shè)計(jì)引物，以馬鈴薯組培苗GS393的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到1條長度約2 685 bp的特異條帶（圖4-A），測序結(jié)果表明，該片段長度為2 685 bp，與馬鈴薯相關(guān)區(qū)段的同源性為99%，的靶序列處于CDS序列內(nèi)部（960—981 bp，GGAACTA TTCCTCCTGAGTTT）。

2.2.2 馬鈴薯DNA序列分析 以馬鈴薯組培苗GS393的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1條約3 549 bp的特異條帶（圖4-B）。測序結(jié)果表明，該片段長度為3 564 bp，與馬鈴薯相關(guān)區(qū)段的同源性為95%。

圖4 馬鈴薯SCLLRK1基因擴(kuò)增結(jié)果

2.2.3的結(jié)構(gòu)分析 采用portparam在線軟件對的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析顯示其分子質(zhì)量約為223 kD，理論等電點(diǎn)pI為4.92，總共包括28 902個(gè)原子，分子式為C8300H13915N2687O3542S458。蘇氨酸（Thr）的含量最高，達(dá)到32.18%。其不穩(wěn)定指數(shù)為38.9，脂肪指數(shù)為28.31，根據(jù)Guruprasad方法表明SCLRRK1為穩(wěn)定蛋白?？偟挠H水性平均系數(shù)為0.62，預(yù)測該蛋白屬于疏水性蛋白。pedictprotein在線分析SCLRRK1的二級結(jié)構(gòu)顯示其α-螺旋占38.7%，延伸鏈占17.23%，β-折疊占8.28%，無規(guī)則卷曲占35.79%。SWISS-MODEL在線對SCLRRK1的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。SCLRRK1整體呈現(xiàn)大螺旋的結(jié)構(gòu)，主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成，α-螺旋和無規(guī)則卷曲中間有延伸鏈連接，含有少量的β-折疊，這與二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果基本一致。

2.2.4 SCLRRK1的功能域分析 通過在線ProtScale工具預(yù)測SCLRRK1的親疏水性，SCLRRK1質(zhì)氨基酸殘基中氨基酸疏水性最大值為3.494，最小值為-2.526，疏水性氨基酸的數(shù)目大于親水性氨基酸的數(shù)目，且在540—562位氨基酸（IVLAVIGSGLAVFVCVTVVVLLF）之間含有一個(gè)典型的疏水區(qū)域，可見SCLRRK1為疏水性蛋白（圖5）。使用TMHMM在線分析軟件對SCLRRK1進(jìn)行跨膜區(qū)分析顯示編碼區(qū)序列存在明顯的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，1—539位氨基酸位于細(xì)胞膜表面，540—562位氨基酸之間形成一個(gè)典型的跨膜螺旋區(qū)，563—694位氨基酸位于細(xì)胞內(nèi)，與該蛋白的疏水性區(qū)域分析結(jié)果基本一致，表明該蛋白可能是一個(gè)與細(xì)胞信號傳導(dǎo)有關(guān)的膜受體蛋白（圖6）。使用SignalP4.1server對馬鈴薯進(jìn)行信號肽預(yù)測顯示C score表示剪切位點(diǎn)分值（C值），S score表示信號肽分值（S值），Y score表示綜合剪切位點(diǎn)分值（Y值）。的S平均值大于0.5，預(yù)測該基因?yàn)榉置诘鞍浊掖嬖谛盘栯?。從圖7中可以明顯看出N端信號肽，剪切點(diǎn)位于25和26位氨基酸之間。

圖5 SCLRRK1親水性/疏水性預(yù)測

圖6 SCLRRK1的跨膜區(qū)預(yù)測

2.2.5 SCLRRK1的氨基酸序列分析 SMART結(jié)構(gòu)域預(yù)測，結(jié)合氨基酸序列分析（圖8），得知SCLRRK1是一類LRR型富含Ser/Thr/Tyr的蛋白激酶，第2—17個(gè)氨基酸和第566—576的氨基酸間含有兩個(gè)低復(fù)雜度區(qū)域，第90—113個(gè)氨基酸、第114—137個(gè)氨基酸、第138—162個(gè)氨基酸、第210—234個(gè)氨基酸、第330—354個(gè)氨基酸和第426—451個(gè)氨基酸間含有6個(gè)LRR區(qū)域，是富含亮氨酸的重復(fù)序列，第540—562個(gè)氨基酸間含有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，第613—888個(gè)氨基酸間含有1個(gè)蛋白激酶基因STYKc域?？寺〔⑼瓿上到y(tǒng)分析后在NCBI上進(jìn)行基因注冊（MG763883），并命名為。

圖7 SCLRRK1的信號肽預(yù)測

方框內(nèi)為低復(fù)雜度區(qū)域；單下劃線為LRR區(qū)域；雙下劃線為跨膜螺旋區(qū)；陰影部分為蛋白激酶基因STYKc域；橢圓內(nèi)是ScmiR390-5p的識別位點(diǎn)

2.3 ScmiR390-5p和SCLRRK1的組織表達(dá)特異性

如圖9所示，在葉中的表達(dá)量最高，根次之，在塊莖和匍匐莖中的表達(dá)量較低；而的表達(dá)情況與相反，其在葉中的表達(dá)最低，在匍匐莖中的表達(dá)最高，塊莖次之。該結(jié)果與調(diào)控模塊中負(fù)調(diào)控關(guān)系相符。

2.4 馬鈴薯SCLRRK1的部分非生物脅迫響應(yīng)

與對照相比，ABA和6-BA處理24 h時(shí)表達(dá)量最低，之后呈波浪小幅回調(diào)；6-BA處理8 h，達(dá)到表達(dá)峰值，之后40 h內(nèi)維持高位水平，ABA處理36 h表達(dá)呈波浪上升到峰值后快速下降；GA3、PEG和IAA處理8 h即表達(dá)達(dá)到峰值，GA3、PEG和IAA處理都能誘導(dǎo)表達(dá)，但其變化趨勢與相關(guān)性不強(qiáng)；在NaCl處理8 h時(shí)出現(xiàn)表達(dá)下降，之后回升（圖10）。NaCl和6-BA脅迫處理的各時(shí)間點(diǎn)上，表達(dá)趨勢都與相反，分析認(rèn)為負(fù)調(diào)控在轉(zhuǎn)錄后水平對NaCl脅迫做出響應(yīng)，即馬鈴薯調(diào)控模塊在NaCl和6-BA脅迫響應(yīng)中起作用，而在響應(yīng)ABA、GA3、IAA和PEG脅迫時(shí)，和可能分別受到各自的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控。

圖9 ScmiR390-5p和SCLRRK1在各組織中表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量分析和半定量分析

3 討論

已有研究表明在植物感受逆境脅迫而做出適應(yīng)性調(diào)整過程中miRNA可以通過調(diào)控靶基因的表達(dá)來參與植物逆境的調(diào)控[25-26]。在逆境脅迫下，植物體內(nèi)形成非生物脅迫因素、miRNA/靶基因、其他相關(guān)miRNA等多方面因素反饋環(huán)路網(wǎng)絡(luò)[27-28]。/tasiRNA/ ARF在葉等器官的極性發(fā)育[29]，特別對植物橫向器官發(fā)育及生長時(shí)期的轉(zhuǎn)變[30]等方面有重要調(diào)控作用，/TAS3/ARF2/ARF3/ARF4定量控制側(cè)根生長的作用模式已經(jīng)得到證實(shí)[31]。響應(yīng)低溫[8-10]及各種非生物脅迫[15-22]也有不少研究，但在響應(yīng)非生物脅迫過程中的具體靶向（基因）報(bào)導(dǎo)多局限于生物信息預(yù)測階段，隨著研究的深入及技術(shù)不斷發(fā)展，挖掘miRNAs的潛在靶基因及驗(yàn)證其功能對于闡明miRNAs調(diào)控機(jī)制意義重大。

圖10 ScmiR390-5p和SCLRRK1在各種非生物脅迫下的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

本研究通過對的靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測獲得一個(gè)類酪氨酸型富含亮氨酸重復(fù)的類受體蛋白激酶靶蛋白，并通過RLM- 5′RACE驗(yàn)證了作用于的靶點(diǎn)，序列系統(tǒng)分析表明，主要包括胞內(nèi)激酶域（cytoplasmic protein kinase domain）、胞外結(jié)構(gòu)域（extracellular domain）和跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembran domain）[32]等多種信號識別傳遞途徑中的關(guān)鍵組分，它們作為質(zhì)膜受體能夠感受外界刺激，通過磷酸化作用參與胞內(nèi)信號傳遞。LRR型類受體蛋白激酶是植物中已知的最大的一類跨膜類受體蛋白激酶，其在植物生長發(fā)育激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及脅迫反應(yīng)中具有重要的調(diào)控功能。大部分LRR型類受體蛋白激酶的N-末端有信號肽（signal peptide）和亮氨酸拉基序（leucine zipper motif），胞外域包含多個(gè)LRR基序，每個(gè)基序都有保守序列l(wèi)xxlxxlxxlx-lxxnxlvgxip，激酶域靠近C末端[33-38]。LEE等[23]發(fā)現(xiàn)水稻LRR類受體蛋白激酶Os-RLK1能夠被低溫誘導(dǎo)表達(dá)，余剛等[39]將得到的四翅濱藜LRK基因?qū)氲结劸平湍钢校l(fā)現(xiàn)其在低溫等脅迫下的存活率明顯高于對照，表明其具有較好的耐低溫等能力。本研究也發(fā)現(xiàn)在馬鈴薯低溫脅迫條件下表達(dá)受到抑制，證實(shí)LRR型類受體蛋白激酶參與低溫脅迫響應(yīng)過程。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)低溫誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)與之負(fù)相關(guān)，即/模塊對低溫做出響應(yīng)。另外，經(jīng)過5℃冷馴脅迫處理10 d的馬鈴薯在進(jìn)行霜凍處理，的表達(dá)量升高，與沒進(jìn)過冷馴化的材料表現(xiàn)出相反的表達(dá)模式，推測持續(xù)低溫脅迫下/模塊隨著低溫作用時(shí)間的延長可能存在反饋調(diào)節(jié)。進(jìn)一步分析/模塊的組織特異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在葉中的表達(dá)量最高，根次之，在塊莖和匍匐莖中的表達(dá)量較低；而的表達(dá)情況與相反。該結(jié)果暗示/模塊也可能參與馬鈴薯器官發(fā)育，具體有待進(jìn)一步深入研究證實(shí)。

富含亮氨酸重復(fù)的類受體蛋白激酶在其他非生物脅迫反應(yīng)中也發(fā)揮著重要的作用，胞外串聯(lián)排列的LRRs基序能夠接受外來的信號，除了激素等小分子化合物以外，它還能接受一些小分子多肽類激素的信號。HONG等[40]從擬南芥植株克隆得到，在干旱或高NaCl脅迫下其表達(dá)量明顯增高。本研究還發(fā)現(xiàn)負(fù)調(diào)控，在轉(zhuǎn)錄后水平對NaCl和6-BA脅迫做出響應(yīng)，即馬鈴薯調(diào)控模塊在NaCl和6-BA脅迫響應(yīng)中起作用，而在響應(yīng)ABA、GA3、IAA和PEG脅迫時(shí)，和可能分別受到各自的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控。

4 結(jié)論

RT-qPCR和半定量PCR表明，在低溫脅迫下，負(fù)調(diào)控表達(dá)，RLM-5′RACE證實(shí)調(diào)控轉(zhuǎn)錄的切割位點(diǎn)是ATTCCT//CCTGAGTT?？寺～@得的CDS序列和DNA序列，生物信息學(xué)分析表明是一類富含亮氨酸重復(fù)受體類蛋白激酶，屬于典型的跨膜疏水性蛋白，存在多個(gè)胞外LRR結(jié)構(gòu)域、1個(gè)單次跨膜區(qū)以及1個(gè)胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域。

/調(diào)控模塊在馬鈴薯組織器官中具備明顯作用；在轉(zhuǎn)錄后水平通過抑制馬鈴薯的表達(dá)對低溫脅迫做出響應(yīng)。同時(shí)，馬鈴薯調(diào)控模塊在NaCl和6-BA脅迫響應(yīng)中起作用。/調(diào)控模塊不對ABA、GA3、IAA和PEG脅迫做出響應(yīng)，和分別在轉(zhuǎn)錄水平受到上述信號調(diào)控。

[1] 謝潔, 王明, 李青, 潘妃, 熊興耀, 秦玉芝. 植物的研究進(jìn)展. 生物技術(shù)通報(bào), 2018, 34(6): 1-10.

XIE J, WANG M, LI Q, PAN F, XIONG X Y, QIN Y Z. Research progress of plant miR390., 2018, 34(6): 1-10. (in Chinese)

[2] 馬媛媛, 甘睿, 王寧寧. 植物富含亮氨酸重復(fù)序列型類受體蛋白激酶的生物學(xué)功能. 分子植物(英文版), 2005, 31(4): 331-339.

MA Y Y, GAN R, WANG N N. Biological functions of leucine-rich repeat class of receptor-like protein., 2005, 31(4): 331-339. (in Chinese)

[3] 魏強(qiáng), 梁永宏, 李廣林. 植物miRNA的進(jìn)化. 遺傳, 2013, 35(3): 315-323.

WEI Q, LIANG Y H, LI G L. Evolution of miRNA in plants., 2013, 35(3): 315-323. (in Chinese)

[4] Sunkar R, Li Y F, Jagadeeswaran G. Functions ofin plant stress responses., 2012, 17(4): 196-203.

[5] Khraiwesh B, Zhu J Y, Zhu J H. Role of miRNAs and siRNAs in biotic and abiotic stress responses of plants., 2012, 1819(2):137-148.

[6] Sunkar R. MicroRNAs with macro-effects on plant stress responses., 2010, 21(8): 805-811.

[7] Xia R, Xu J, Meyers B C. The emergence, evolution, and diversification of the-TAS3-ARF pathway in land plants., 2017, 29(6):1232-1247.

[8] 薄維平. 木薯耐寒相關(guān)microRNA的差異表達(dá)分析[D]. ?？? 海南大學(xué), 2010.

BO W P. Analysis of differential expression of cold-tolerance related microRNA in cassava [D]. Haikou: Hainan University, 2010. (in Chinese)

[9] 黨春艷. 高山離子芥低溫脅迫調(diào)控的miRNAs及其靶基因的表達(dá)分析[D]. 蘭州: 蘭州大學(xué), 2013.

DANG C Y. Expression anaysis of chilling-stress regulated minRNAs and targets in[D]. Lanzhou: Lanzhou University, 2013. (in Chinese)

[10] 孫潤澤, 侯琦, 章文樂. 甜楊低溫響應(yīng)microRNAs的克隆與分析. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2011, 30(2): 204-211.

SUN R Z, HOU Q, ZHANG W L. Cloning and analysis of the low temperature stress-responsive microRNAs from., 2011, 30(2): 204-211. (in Chinese)

[11] Chen Q S, Li M, Zhang Z C, Tie W W, Chen X, Jin L F, Zhai N, Zheng Q X, Zhang J F, Wang R, Xu G Y, Zhang H, Liu P P, Zhou H N. Integrated mRNA and microRNA analysis identifies genes and small miRNA molecules associated with transcriptional and post-transcriptional-level responses to both drought stress and re-watering treatment in tobacco., 2017, 18(1):62-77.

[12] 翟立紅. 玉米冠根和雄穗中microRNA及Argonaute基因表達(dá)的研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013.

ZHAI L H. Characterization and expression and analysis of microRNA and argonaute genes in crown roots and tassel of maize [D].Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2013. (in Chinese)

[13] 王寶山, 鄒琦. NaCl脅迫對高粱根、葉鞘和葉片液泡膜ATP酶和焦磷酸酶活性的影響. 植物生理學(xué)報(bào), 2000, 26(3): 181-188.

WANG B S, ZOU Q. Effects of NaCl stress on the tonoplast ATPase and PPase activity in roots, sheaths and blades of sorghum seedlings., 2000, 26(3):181-188. (in Chinese)

[14] 郭兆奎. 煙草吸鉀相關(guān)基因克隆與表達(dá)調(diào)控研究[D]. 哈爾濱: 哈爾濱工業(yè)大學(xué), 2008.

GUO Z K. The cloning and expression regulation of potassium uptake relative genes in[D]. Harbin: Harbin Institute of Technology, 2008. (in Chinese)

[15] 王波. 擬南芥和NaCl生植物灰綠藜液泡膜焦磷酸酶基因與TIR1基因表達(dá)相關(guān)性分析[D]. 烏魯木齊: 新疆大學(xué), 2007.

WANG B. Analysis on gene expression correlation between vacuolar H+-pyrophosphatase and TRANSPORT INHIBITOR RESPONSE1 (TIR1) inand halophyte[D]. Urumqi: Xinjiang University, 2007. (in Chinese)

[16] 佐拉. 野生大麥與栽培大麥耐NaCl性的生理及遺傳差異研究[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2014.

ZUO L. Physiological and genetic difference in salt stress tolerance in wild and cultivated barleys [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2014. (in Chinese)

[17] 吳冰月, 宋普文, 陳華濤. 2個(gè)大豆RNA依賴的RNA聚合酶基因和的克隆與分析. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 37(3): 27-34.

WU B Y, SONG P W, CHEN H T. Cloning and expression pattern analysis ofandin soybean., 2014, 37(3): 27-34. (in Chinese)

[18] 李賀, 毛健鑫, 戚華彩. 草莓miR390基因及其啟動(dòng)子的鑒定與表達(dá)分析. 果樹學(xué)報(bào), 2014, 31(3): 362-336.

LI H, MAO J X, QI H C. Identification and expression analysis ofgene and its promoter from strawberry., 2014, 31(3): 362-336. (in Chinese)

[19] YOON E K, YANG J H, LIM J, KIM S H, KIM S K, LEE W S. Auxin regulation of the microRNA390-dependent transacting small interfering RNA pathway inlateral root development., 2010, 38: 1382-1391.

[20] DING Y F, YE Y Y, JIANG Z H, WANG Y, ZHU C. MicroRNA390 is involved in cadmium tolerance and accumulation in rice., 2016, 7(127): 235-244.

[21] 劉涼琴, 宋愛萍, 張永俠. 馬藺根系響應(yīng)Cd脅迫的miRNA高通量測序分析. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào), 2016, 25(3): 1-11.

LIU L Q, SONG A P, ZHANG Y X. High throughput sequencing analysis on miRNA in root ofvar.response to Cd stress., 2016, 25(3): 1-11. (in Chinese)

[22] Dmitriev A A, Kudryavtseva A V, Bolsheva N L, Zyablitsin A V, Rozhmina T A, Kishlyan N V, Krasnov G S, Speranskaya A S, Krinitsina A A, Sadritdinova A F, Snezhkina A V, Fedorova M S, Yurkevich O Y, Muravenko O V, Belenikin M S, Melnikova N V. miR319, miR390, and miR393 are involved in aluminum response in flax (L.)., 2017, 2017: 4975146.

[23] LEE S C, KIM J Y, KIM S H, KIM S J, LEE K, HAN S K, CHOI H S, JEONG D H, AN G, KIM S R. Trapping and characterization of cold-responsive genes from T-DNA tagging lines in rice., 2004, 166(1): 69-79.

[24] JUNG E H, JUNG H W, LEE S C, HAN S W, HEU S, HWANG B K. Identification of a novel pathogen-induced gene encoding a leucine- rich repeat protein expressed in phloem cells of., 2004, 1676(3): 211-222.

[25] SUNKAR R, ZHU J K. Novel and stress-regulated microRNAs and other small RNAs from., 2004, 16(8): 2001-2019.

[26] KHRAIWESH B, ZHU J Y, ZHU J H. Role of miRNAs and siRNAs in biotic and abiotic stress responses of plants., 2012, 1819(2): 137-148.

[27] MENG Y J, SHAO C G, MA X X, WANG H Z, CHEN M. Expression-based functional investigation of the organ-specific microRNAs in., 2012, 7(11): e50870.

[28] DING Y F, TAO Y L, ZHU C. Emerging roles of microRNAs in the mediation of drought stress response in plants., 2013, 64(11): 3077-3086.

[29] GARCIA D, COLLIER S A, BYRNE M E, MARTIENSSEN R A. Specification of leaf polarity invia the trans-acting siRNA pathway., 2006, 16(9): 933-938.

[30] CHO S H, CORUH C, AXTELL M J. miR156 and miR390 regulate tasiRNA accumulation and developmental timing in., 2012, 24(12): 4837-4849.

[31] MARIN E, JOUANNET V, HERZ A, LOKERSE A S, WEIJERS D, VAUCHERET H, NUSSAUME L, CRESPI M D, MAIZEL A. miR390,TAS3 tasiRNAs, and their AUXIN RESPONSE FACTOR targets define an autoregulatory network quantitatively regulating lateral root growth., 2010, 22(4): 1104-1117.

[32] HANKS S K, QUINN A M, HUNTER T. The protein kinase family: Conserved features and deduced phylogeny of the catalytic domains., 1988, 241(4861): 42-52.

[33] 牛吉山. 植物和小麥蛋白激酶的研究現(xiàn)狀. 西北植物學(xué)報(bào), 2003, 23(1): 143-150.

NIU J S. Studies on plant and wheat protein kinases., 2003, 23(1): 143-150.

[34] Ullrich A, Schlessinger J. Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity., 1990, 61(2): 203-212.

[35] Stone J M, Walker J C. Plant protein kinase families and signal transduction., 1995, 108(2): 451-457.

[36] Mizuno S, Osakabe Y, Maruyama K, Ito T, Osakabe K, Sato T, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. Receptor- like protein kinase 2 (RPK 2) is a novel factor controlling anther development in., 2010, 50(5): 751-766.

[37] XU Z S, Xiong T F, Ni Z Y, Chen X P, Chen M, Li L C, Gao D Y ,Yu X D, Liu P, Ma Y Z. Isolation and identification of two genes encoding leucine-rich repeat (LRR) proteins differentially responsive to pathogen attack and salt stress in tobacco., 2009, 176(1): 38-45.

[38] HAN R, Jian C, Lv J Y, Yan Y, Chi Q, Li Z J, Wang Q, Zhang J, Liu X L, Zhao H X. Identification and characterization of microRNAs in the flag leaf and developing seed of wheat (L.)., 2014, 15: 289.

[39] 余剛, 李敬濤, 孫新華, 劉金亮, 潘洪玉. 四翅濱藜LRR類受體蛋白激酶基因在酵母中的表達(dá)及抗逆分析. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版), 2012, 50(6): 1257-1263.

YU G, LI J T, SUN X H, LIU J L, PAN H Y. Expression and functional characterization of an AcLRR gene fromin yeast., 2012, 50(6): 1257-1263. (in Chinese)

[40] HONG S W , JON JH, KWAK J M, NAM H G . Identification of a receptor-like protein kinase gene rapidly induced by abscisic acid, dehydration, high salt, and cold treatments in., 1997, 113(4):1203-1212.

Expression and Structural Analysis ofand Its Target Genes in Potato Response to Low Temperature

XIE Jie1, WANG Ming1, DING HongYing1, LI Qing1, WANG WanXing2, XIONG XingYao2, QIN YuZhi1

（1College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha 410128;2Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081）

The study was carried out to investigate the mechanism of potato leucine-rich repeat receptor-like protein kinase (LRR-RLK) receptor protein kinase SCLRRK1 regulated by() in response to abiotic stress.【】 By sequencing and analyzing potato miRNAs in response to low temperature conditions and predicting target genes, we found thatresponded to low temperatures by regulating a potential LRR-like receptor protein kinase gene. The expression levels ofandonwas determined by using RLM-5'RACE. The DNA sequence and CDS sequence ofwere cloned by PCR and the structure and function of SCLRRK1 were predicted by bioinformatics analysis. The expression levels of/【】 The results of RT-qPCR showed that the expression ofwas induced by low temperature, while the expression ofwas inhibited. There was a negative correlation between the expression of ScmiR390-5p and scrrk1 under low temperature stress. The result of RLM-5′RACE indicated that cleavage site ofonwas ATTCCT// CCTGAGTT, and potato/regulatory module was respond to low temperature. The cloning results indicated that the CDS ofwas 2 685 bp in length, encoding 894 amino acids, and the gene sequence was 3 549 bp containing 1 intron, 2 exons, 3' non-coding region and 5' non-coding region.target site was located atCDS (960-981 bp, GGAACTATTCCTCCTGAGTTT). Bioinformatics analysis showed that theencoded a leucine-richrepeat (LRR)-like receptor protein kinase, belonging transmembrane secreted protein. RT-qPCR analysis of potato tissue expression pattern showed that the expression level of thewas highest in the leaves, followed by roots, and relatively lowers in stem (terrestrial stem, tuber and stolon). Differently, the expression level ofwas the lowest in leaves and the highest in stems. The results under various abiotic stresses showed thatthe expression ofandwas negatively correlated, andwas induced by NaCl stress. Compared with the control, the expression ofwas decreased and then increased slightly after treatment with ABA and 6-BA. Thelevel increased continuously under 6-BA treatment, while the expression ofincreased first and then decreased under ABA treatment. The expression ofreached the peak after treatment with GA3, PEG and IAA for 8 h. The expression ofwas induced by GA3, PEG and IAA, but the change trend was not correlated to. 【】had the amino acid sequence and structural basis of nucleic acid to encode LRR-like receptor protein kinase, which was the target gene of;/regulatory module had a significant role in potato tissues;responded to low temperature stress by inhibiting the expression of potatoat the post-transcriptional level, while/regulated module played a role in salt and 6-BA stress response. The/regulatory module did not respond to ABA, GA3, IAA and PEG stress, and theandwere regulated by the above signals at the transcriptional level, respectively.

potato;;;quantitative real-time PCR; RLM-5′RACE

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.13.009

2019-01-03；

2019-05-13

國家自然科學(xué)基金（31371683）

謝潔，Tel：0731-84618171；E-mail：358562505@ qq.com。

秦玉芝，Tel：0731-84618171；E-mail：qyuz@163.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）