魏冠棉，張軍偉，周 鵬*

（江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

腐乳在我國(guó)具有悠久的歷史，它是采用天然大豆經(jīng)加工發(fā)酵而成，具有風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富等優(yōu)點(diǎn)[1]。根據(jù)是否有微生物參與，腐乳可以分為腌制型腐乳和發(fā)酵型腐乳[2-3]：由于腌制型腐乳發(fā)酵周期長(zhǎng)、產(chǎn)品質(zhì)地粗糙、氨基酸含量低等弊端，所占比重很小；發(fā)酵型腐乳根據(jù)菌種的不同可以分為毛霉型腐乳、根霉型腐乳和細(xì)菌型腐乳[4-5]，由于毛霉具有豐富且有益的酶系，賦予了毛霉型腐乳柔糯細(xì)膩的口感，因此國(guó)內(nèi)90%～95%腐乳菌種為毛霉[6-8]。目前腐乳常用的毛霉菌種有總狀毛霉、雅致放射毛霉和五通橋毛霉[6,9]。3 種毛霉分布在不同的腐乳產(chǎn)地，目前尚鮮見(jiàn)對(duì)比其對(duì)腐乳的品質(zhì)、微觀結(jié)構(gòu)和流變性質(zhì)影響的研究報(bào)道。

油腐乳是云貴地區(qū)特色發(fā)酵食品。該地區(qū)特殊的地理氣候條件形成了利于油腐乳發(fā)酵的獨(dú)特微生物菌群，使得所生產(chǎn)的油腐乳品質(zhì)優(yōu)異而香氣濃郁。與其他地區(qū)腐乳不同的是，它采用乳酸菌作為豆腐的凝固劑；在腐乳的湯料中，用菜籽油代替水，賦予了油腐乳獨(dú)特的風(fēng)味和豐富的脂類營(yíng)養(yǎng)物。

本研究主要結(jié)合云貴地方特色油腐乳，采用不同毛霉菌種發(fā)酵油腐乳，并分析發(fā)酵過(guò)程中油腐乳的品質(zhì)、結(jié)構(gòu)和流變性質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化，研究不同毛霉菌種對(duì)油腐乳的影響，以期為油腐乳的研究和生產(chǎn)提供理論和實(shí)踐參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油腐乳生產(chǎn)過(guò)程中的原輔料取自云南牟定腐乳生產(chǎn)企業(yè)；篩選菌種為來(lái)自實(shí)驗(yàn)室前期篩選保存優(yōu)質(zhì)毛霉菌株（Mucor racemosus MD-102），保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 15264；生產(chǎn)用雅致放射毛霉（Actinomucor elegans）CICC 40701、總狀毛霉（M. racemosus）CICC 40491、五通橋毛霉（M. wutungkiao）CICC 40854來(lái)源于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

氫氧化鈉、硫氰酸鉀標(biāo)、硝酸銀甲醛、硫酸鐵銨、硼酸、溴甲酚綠、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸、無(wú)水硫酸銅、硫酸鉀、酪蛋白、鹽酸、三氯乙酸（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；戊二醛 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T10 basic分散機(jī)、IKA-RO10攪拌器 德國(guó)IKA儀器設(shè)備有限公司；S220 Seven Compact pH/離子計(jì) 瑞士梅特勒-托利多公司；BGZ-246電恒溫烘箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；電熱恒溫水浴鍋HWS-26 上海雙旭電子有限公司；X08A自動(dòng)消化裝置、K1302自動(dòng)定氮分析儀上海晟聲自動(dòng)化分析儀器有限公司；HAAKE MARSIII流變儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；LSM710激光共聚焦顯微鏡 德國(guó)卡爾·蔡司公司；Quanta 200掃描電子顯微鏡 美國(guó)FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 油腐乳的制備與采集

油腐乳制備：取優(yōu)質(zhì)大豆浸泡后磨漿，過(guò)濾后煮漿，冷卻后加入凝固劑制成豆腐，切成小塊；噴灑105CFU/mL霉菌孢子懸浮液到豆腐上，28 ℃培養(yǎng)3 d，制得毛坯；毛坯經(jīng)晾曬和鹽漬，制得鹽坯；加入調(diào)料至鹽坯，裝瓶，常溫發(fā)酵3 個(gè)月，即得到油腐乳成品。

樣品采集：在前發(fā)酵0 d、前發(fā)酵4 d、晾曬、鹽漬、后發(fā)酵0 d、后發(fā)酵30 d和后發(fā)酵90 d時(shí)，隨機(jī)收集油腐乳（篩選菌種、總狀毛霉、雅致放射毛霉、五通橋毛霉）各5 瓶。

1.3.2 油腐乳理化指標(biāo)的測(cè)定

水分含量：采用直接干燥法，參照GB 5009.3—2010《食品中水分的測(cè)定》[9]；總酸含量：采用酸堿滴定法，參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》[10]；氨基態(tài)氮含量：采用甲醛值法，參照GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[11]；水溶性蛋白含量：參照NY/T 1205—2006《大豆水溶性蛋白含量的測(cè)定》[12]；氯化鈉含量：采用間接沉淀法，參照GB/T 12457—2008《食品中氯化鈉的測(cè)定》[13]；蛋白酶活性：參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》[14]。

1.3.3 油腐乳微觀結(jié)構(gòu)的測(cè)定

參考Peng Xingyun等[15]的方法進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察。將油腐乳樣品切成1 mm×10 mm×10 mm的薄片，加入2.5%戊二醛溶液，4 ℃固定12 h；磷酸緩沖液（pH 7.2）漂洗3 次，每次15 min；依次采用30%、50%、70%、90%、95%和100%乙醇溶液梯度脫水，時(shí)間各為15 min；樣品經(jīng)二氧化碳臨界點(diǎn)干燥，并通過(guò)離子濺射噴金；然后進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察，電壓為12.5 kV，放大倍數(shù)為2 000 倍。

1.3.4 油腐乳涂抹性的測(cè)定

涂抹性測(cè)定參考Daubert[16]和Tárrega[17]等的實(shí)驗(yàn)方法。腐乳樣品瀝干油并去除表面的菌絲膜，用研缽研磨均勻，取約1 g樣品至流變儀進(jìn)行分析。采用P35 TiL平板，間隙為1 mm，剪切速率1～100 s-1，時(shí)間為300 s，每個(gè)樣品在25 ℃重復(fù)3 次。

1.3.5 感官評(píng)價(jià)

油腐乳的感官評(píng)價(jià)通過(guò)形、色、香、滋、質(zhì)地5 個(gè)方面制定感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[18-19]，選定15 名感官評(píng)價(jià)人員，按照表1進(jìn)行評(píng)分。

表1 油腐乳感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of oil sufu

2 結(jié)果與分析

2.1 毛霉生長(zhǎng)狀況

如圖1所示，經(jīng)4 d培養(yǎng)后，篩選菌種和總狀毛霉的菌絲短小、致密且潔白；雅致放射狀毛霉和五通橋毛霉的菌絲相對(duì)較稀疏，但二者的菌絲較長(zhǎng)，利于油腐乳毛坯外層菌膜的形成，即利于維持腐乳的塊形。

圖1 4 種毛霉菌種在PDA培養(yǎng)基及油腐乳白坯上培養(yǎng)4 d的外觀Fig. 1 Appearance of four Mucor strains cultured on PDA medium and tofu for 4 days

2.2 油腐乳發(fā)酵過(guò)程中蛋白酶活性的分析

由圖2可知，蛋白酶活性隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì)，這與文獻(xiàn)[20-21]的研究結(jié)果相一致。在前發(fā)酵過(guò)程中，霉菌不斷生長(zhǎng)繁殖并分泌和累積蛋白酶，故使得油腐乳白坯中蛋白酶活性的升高。在前發(fā)酵4 d后，雅致放射毛霉和五通橋毛霉的蛋白酶活性大于20 U/g，明顯高于總狀毛霉和篩選菌株（15 U/g和7.5 U/g）。經(jīng)晾曬后樣品中蛋白酶活性降低，可能是因?yàn)榈鞍酌鸽S著水分而流失，且水分的缺失使得霉菌分泌蛋白酶受限；與其他3 組樣品不同的是篩選菌種的酶活性進(jìn)一步升高，表明篩選菌在水分降低時(shí)仍可以生長(zhǎng)和分泌蛋白酶。在鹽漬和后發(fā)酵過(guò)程中，由于鹽對(duì)蛋白酶的抑制作用，使得油腐乳中的蛋白酶活性進(jìn)一步降低。由于篩選菌種與總狀毛霉均親緣關(guān)系較近，故二者蛋白酶的變化幅度相一致；而五通橋毛霉發(fā)酵油腐乳的蛋白酶活性在后發(fā)酵過(guò)程中呈上升趨勢(shì)，表明五通橋毛霉在后發(fā)酵過(guò)程中耐高鹽性優(yōu)于前三者。

圖2 油腐乳發(fā)酵過(guò)程中蛋白酶活性的變化Fig. 2 Change in protease activity of oil sufu during fermentation

2.3 油腐乳發(fā)酵過(guò)程中理化性質(zhì)的分析

通過(guò)測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)期腐乳的總酸、氨基態(tài)氮和水溶性蛋白等理化指標(biāo)表征腐乳發(fā)酵過(guò)程的成熟度，并用以檢測(cè)腐乳品質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化[22-23]，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 油腐乳發(fā)酵過(guò)程中理化性質(zhì)的變化Fig. 3 Changes in physicochemical properties of oil sufu during fermentation

水溶性蛋白質(zhì)是腐乳中重要的風(fēng)味前體物質(zhì)，與腐乳品質(zhì)有密切關(guān)系[23-25]。從圖3可知，隨著后發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，水溶性蛋白含量逐漸增加，且符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)成品腐乳的氨基態(tài)氮含量的要求。后發(fā)酵過(guò)程中，篩選菌種的水溶性蛋白含量最高，其余依次為總狀毛霉、雅致放射毛霉和五通橋毛霉，表明了篩選菌種在油腐乳水解蛋白能力最強(qiáng)，這與后發(fā)酵過(guò)程中蛋白酶活性變化相一致。

氨基態(tài)氮是判斷腐乳發(fā)酵程度的特性指標(biāo)之一；氨基態(tài)氮含量越高，則氨基酸含量越高，腐乳的鮮味越好[23-24]。從圖3可知，隨著后發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，氨基態(tài)氮含量逐漸增加，且符合腐乳成熟標(biāo)準(zhǔn)要求。篩選菌種組氨基態(tài)氮含量增長(zhǎng)最快，總狀毛霉和雅致放射毛霉次之，五通橋毛霉組最小。該研究結(jié)果表明篩選菌種在油腐乳后發(fā)酵過(guò)程中的蛋白分解代謝優(yōu)勢(shì)優(yōu)于其他3 種毛霉，總狀毛霉和雅致放射毛霉分解代謝蛋白能力相近，五通橋毛霉代謝生成氨基態(tài)氮的能力低于其他3 種毛霉。

總酸是衡量腐乳質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，同時(shí)也可以反映腐乳的發(fā)酵程度[25]。在腐乳發(fā)酵過(guò)程中，蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物在酶的作用下生成游離氨基酸、游離脂肪酸和有機(jī)酸，它們形成了油腐乳的酸度。從圖3可知，油腐乳在后發(fā)酵過(guò)程中，總酸含量隨時(shí)間延長(zhǎng)而上升，且符合標(biāo)準(zhǔn)對(duì)成品腐乳的總酸含量的要求。在后發(fā)酵90 d時(shí)，4 組油腐乳總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為篩選菌種（2.18%）＞總狀毛霉（2.08%）＞雅致放射毛霉（2.05%）＞五通橋毛霉（1.98%），表明篩選菌種在油腐乳分解代謝生成游離氨基酸、游離脂肪酸和有機(jī)酸的優(yōu)勢(shì)大于其他3 種毛霉。

水分含量反映網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的空間大小和完整性[26-27]，這將影響油腐乳的微觀結(jié)構(gòu)和質(zhì)構(gòu)特性。由圖3可知，不同毛霉發(fā)酵油腐乳在后發(fā)酵過(guò)程中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本相同，穩(wěn)定在60%左右，表明發(fā)酵菌種與油腐乳后發(fā)酵水分含量相關(guān)性小。

鹽在油腐乳發(fā)酵過(guò)程中的作用主要是賦予油腐乳咸味，降低水分含量，抑制后發(fā)酵過(guò)程中酶活性，防止過(guò)度發(fā)酵而引起質(zhì)量問(wèn)題，抑制毛霉等有益微生物過(guò)度生長(zhǎng)，尤其是抑制和防止雜菌和致病菌的生長(zhǎng)[4,28]。由圖3可知，隨著油腐乳后發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在10%左右并符合標(biāo)準(zhǔn)的要求。

2.4 油腐乳發(fā)酵過(guò)程中微觀結(jié)構(gòu)的分析

食品的微觀結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)之間具有顯著相關(guān)性，蛋白質(zhì)水解會(huì)改變蛋白聚集狀態(tài)和凝膠結(jié)構(gòu)[29-31]，因此會(huì)引起腐乳微觀結(jié)構(gòu)的變化。此外，食品的微觀結(jié)構(gòu)與食品的功能性和消費(fèi)者的接受度息息相關(guān)[32]。

圖4 油腐乳發(fā)酵過(guò)程中微觀結(jié)構(gòu)的變化Fig. 4 Scanning electron microscopic images of oil sufu during fermentation

由圖4可知，在前發(fā)酵0 d，4 種油腐乳內(nèi)部均為孔洞大小不一的蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。這主要是因?yàn)槊咕唤臃N到豆腐白坯上，其未分泌蛋白酶以破壞蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。前發(fā)酵4 d，蛋白凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)孔隙在一定程度上縮小，蛋白聚集體減小。這主要是由于前發(fā)酵過(guò)程中毛霉在豆腐白坯上生長(zhǎng)繁殖并分泌蛋白酶，部分大豆蛋白經(jīng)水解作用后被分解。由圖4可知，雅致放射毛霉和五通橋毛霉組的微觀結(jié)構(gòu)變化比篩選菌種和總狀毛霉組的明顯，這主要是前兩者的蛋白酶活性和蛋白水解程度大于后兩者（圖2）引起。油腐乳毛坯在晾曬與鹽漬過(guò)程中經(jīng)環(huán)境條件和鹽的滲透作用析出大量水分，使得坯體收縮且蛋白凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)孔隙進(jìn)一步縮小；因蛋白酶活性受到不同程度的抑制使得蛋白水解程度不同，從而使得毛坯的微觀結(jié)構(gòu)變化程度不同。在后發(fā)酵過(guò)程中，蛋白的聚集體被進(jìn)一步降解，蛋白凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更致密。由于鹽對(duì)蛋白酶、微生物生長(zhǎng)和分泌酶的抑制作用，后發(fā)酵過(guò)程中蛋白水解速率降低，油腐乳微觀結(jié)構(gòu)的變化變緩。篩選菌種、總狀毛霉和雅致放射毛霉的酶活性相一致，故三者的微觀結(jié)構(gòu)類似；后發(fā)酵前期五通橋毛霉的酶活性小于前三者，故其微觀結(jié)構(gòu)在后發(fā)酵0～30 d時(shí)變化緩慢且仍可觀察到小的蛋白聚集體，隨著蛋白酶活性的增加凝膠結(jié)構(gòu)變得致密；此變化與水溶性蛋白和氨基態(tài)氮含量的變化相一致。

2.5 油腐乳發(fā)酵過(guò)程中涂抹性的變化

圖5 油腐乳發(fā)酵過(guò)程中涂抹性的變化Fig. 5 Changes in spreadability of oil sufu during fermentation

涂抹性是油腐乳結(jié)構(gòu)的最重要組成部分之一，它很大程度上影響消費(fèi)者的接受度；涂抹性可以通過(guò)屈服應(yīng)力來(lái)表示，樣品的屈服應(yīng)力越小代表其涂抹性越好[33-34]。屈服應(yīng)力是指樣品發(fā)生最初流動(dòng)時(shí)所需的最小剪應(yīng)力[35-36]，這是液體和固體材料的物理和流變特性[37]。如圖5所示，隨著油腐乳后發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，屈服應(yīng)力逐漸降低，涂抹性逐漸提高；表明隨著蛋白水解程度的增大，在一定剪切速率下所需的破壞蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的剪切力減小，產(chǎn)品變得更加柔軟且涂抹性增強(qiáng)。在后發(fā)酵過(guò)程中4 組油腐乳屈服應(yīng)力為篩選菌種（1 060.33 Pa）＞總狀毛霉（866.60 Pa）＞五通橋毛霉（855.90 Pa）＞雅致放射毛霉（740.57 Pa），表明雅致放射毛霉組油腐乳涂抹性最好，其余依次為五通橋毛霉、總狀毛霉和篩選菌種。

2.6 油腐乳的感官評(píng)價(jià)

圖6 油腐乳的感官評(píng)價(jià)Fig. 6 Sensory evaluation of oil sufu

由圖6可知，油腐乳樣品的塊形無(wú)較大差異，這主要是由于篩選菌種和總狀毛霉的菌絲致密，可以形成良好的菌絲膜包被腐乳塊；而雅致放射毛霉和五通橋毛霉菌絲雖稀疏但菌絲長(zhǎng)，亦可以形成菌絲膜以確保油腐乳的完整塊形。雅致放射毛霉和總狀毛霉發(fā)酵油腐乳樣品的香氣略優(yōu)于篩選菌種和五通橋毛霉發(fā)酵的油腐乳，這是由于前兩者的酶系較為豐富。雅致放射毛霉和五通橋毛霉發(fā)酵油腐乳樣品的色澤略優(yōu)于另外兩組，主要是由于篩選菌種和總狀毛霉發(fā)酵的油腐乳在空氣中放置一段時(shí)間后，表皮略微變暗，這可能是油腐乳中的還原性物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)所引起的?？偁蠲?、雅致放射毛霉和篩選菌株組的滋味評(píng)分高于五通橋毛霉組，這主要因?yàn)槠穱L后者樣品時(shí)舌尖有輕微的灼痛感，這可能是五通橋毛霉在代謝過(guò)程中產(chǎn)生了某種物質(zhì)所引起的?？偁蠲?、雅致放射毛霉和五通橋毛霉的質(zhì)地優(yōu)于篩選菌株組毛霉，與涂抹性的結(jié)果相一致，這主要因?yàn)闃悠返馁|(zhì)地主要取決于樣品的成分含量以及蛋白、脂肪和水分之間的相互作用，表明篩選菌株的綜合代謝作用略低于其他三者，為混合發(fā)酵以提高油腐乳質(zhì)地提供依據(jù)。

3 結(jié) 論

通過(guò)研究云貴地區(qū)特色發(fā)酵油腐乳在發(fā)酵過(guò)程中霉菌的表觀性狀、蛋白酶活性、成熟度、微觀結(jié)構(gòu)、涂抹性和感官性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)不同毛霉發(fā)酵的油腐乳成熟度、結(jié)構(gòu)、流變和感官性質(zhì)各有優(yōu)勢(shì)。綜合考慮菌種發(fā)酵油腐乳的優(yōu)點(diǎn)，后期可以圍繞毛霉混合發(fā)酵油腐乳及其對(duì)生產(chǎn)周期的影響開(kāi)展深入的研究，以期得到優(yōu)化的油腐乳，為油腐乳實(shí)際生產(chǎn)的品質(zhì)和工藝提供一定的理論依據(jù)。