高 飛 姬東生 劉 平 陳娜娜 張夢(mèng)瀟 趙 靜 肖玉良#

1.藥學(xué)院，山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)科院) ，山東 泰安 271000； 2.山東省泰山療養(yǎng)院，山東 泰安 271000

阿霉素(Doxorubicin，Dox)又名多柔比星，是一種蒽環(huán)類糖苷化合物，臨床上多用其鹽酸鹽。阿霉素主要通過嵌入DNA抑制核酸的合成，起到殺滅細(xì)胞的效果[1-2]。Dox是一類廣譜的抗腫瘤藥物，臨床上被廣泛用于治療急性白血病[3]、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤[4]、乳腺癌[5]、肺癌[6]、卵巢癌[7]、胃癌[8]、肝癌等多種惡性腫瘤[9]。Dox的主要不良反應(yīng)常表現(xiàn)為心臟毒性、骨髓毒性、抑制免疫功能以及惡心、嘔吐等[10-11]。因其不良反應(yīng)較大，臨床上多將其作為二線藥物。硫酸軟骨素(CS)具有抗氧化[12]、抗炎[13]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[14]、抗腫瘤[15]等藥理活性，目前用于防治心腦血管疾病、骨關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)保護(hù)等。我們采用CS修飾Dox可以賦予Dox良好的腫瘤靶向性，提高Dox的靶向性和生物利用度，在降低其不良反應(yīng)的同時(shí)增強(qiáng)了Dox的抗腫瘤效果。藥典中Dox的測(cè)量采用高效液相色譜法[16]，硫酸軟骨素是一種自然界中存在的粘性多糖，脂溶性差，采用液相色譜法測(cè)定硫酸軟骨素-阿霉素(CS-Dox)可能會(huì)造成液相色譜柱的堵塞，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此如何建立一種能夠快速且準(zhǔn)確的測(cè)定血液中Dox及CS-Dox含量的方法是研究考察Dox和CS-Dox藥代動(dòng)力學(xué)及組織分布等相關(guān)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵所在。 Dox自身具有較強(qiáng)的熒光，而且其熒光特性比較穩(wěn)定，本研究采用熒光分光光度法測(cè)定大鼠血漿中的Dox及CS-Dox，建立了一種快速、簡便、靈敏的定量測(cè)定大鼠血漿中Dox及CS-Dox含量的方法。

1 材料與儀器

1.1材料

豬CS 111014-01(Mw=17.5 kDa，華懋雙匯實(shí)業(yè)(集團(tuán))有限公司生物化學(xué)制藥廠)；低分子量豬(Mw=4.1 kDa，自制)；Dox·HCl(97%，北京偶合試劑有限公司)，CS-Dox(自制)，乙二胺四乙酸二鈉(分析純，國藥試劑有限公司)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)(美國Varian公司)，TF-FD-1冷凍干燥機(jī)(上海田楓實(shí)業(yè)有限公司)，Vortex QL-902渦旋儀(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠(雄性，200±20 g)，購買于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。(許可證號(hào)：SCXK(魯)2014-0007)

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1檢測(cè)條件的選擇

選用熒光分光光度法測(cè)量血漿中Dox的含量。Ex 480 nm，Em 500～800 nm掃描，可以得到在Em 593 nm處有較高峰，故本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)條件選用Ex 480 nm，Em 593 nm，激發(fā)與發(fā)射狹縫均設(shè)定為10 nm。

2.2空白血漿樣品的采集

實(shí)驗(yàn)前SD大鼠禁食不禁水12 h，實(shí)驗(yàn)大鼠乙醚麻醉，眼內(nèi)眥取血，采集的空白血液標(biāo)本放入到裝有EDTA二鈉的離心管中，3000 r/min離心10 min，取上清，即得空白血漿樣品。

2.3Dox溶液的配制

精密稱取Dox·HCl 1.25 mg加水定容到25 ml的容量瓶中，配制50 μg/ml的Dox溶液作為儲(chǔ)備液。精密吸取儲(chǔ)備液(0.04 ml、0.10 ml、0.20 ml、0.40 ml、1.00 ml、2.00 ml、4.00 ml、6.00 ml)放入10 ml容量瓶中加水定容，配制相應(yīng)濃度(0.2 μg/ml、0.5 μg/ml、1、2 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml)的Dox溶液，4 ℃避光保存待用。

2.4Dox標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取8份大鼠空白血漿200 μl放入1.5 ml離心管中，每個(gè)離心管中分別加入不同濃度的鹽Dox溶液200 μl，渦旋混勻，使得血漿中Dox的濃度分別為0.1 μg/ml、0.25 μg/ml、0.50 μg/ml、1.00 μg/ml、2.00 μg/ml、5.00 μg/ml、10.00 μg/ml、15.00 μg/ml。在2.1中的檢測(cè)條件下測(cè)定熒光強(qiáng)度值。以溶液濃度為橫坐標(biāo)，最終熒光強(qiáng)度值(Y)為縱坐標(biāo)，繪出其熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線并求得工作曲線的回歸方程。

2.5精密度實(shí)驗(yàn)

取大鼠空白血漿200 μl，1∶1加入低、中、高三種濃度的Dox溶液，配制Dox濃度分別為0.25 μg/ml、5.00 μg/ml、15.00 μg/ml的血漿樣品。將血漿樣品按2.4中的處理方法處理測(cè)定其熒光強(qiáng)度，每3 h測(cè)定1次，測(cè)3次,計(jì)算日內(nèi)精密度，連續(xù)測(cè)量三天，計(jì)算日間精密度。

2.6專屬性實(shí)驗(yàn)

分別取大鼠空白血漿、Dox水溶液和Dox血漿溶液進(jìn)行在激發(fā)波長540 nm下，掃描400～500 nm的發(fā)射波長圖譜。比較三者間的大小關(guān)系。

2.7回收率實(shí)驗(yàn)

在大鼠空白血漿中分別加入低、中、高三個(gè)濃度的Dox儲(chǔ)備液,使血漿中藥物濃度分別為0.25 μg/ml、5.00 μg/ml、15.00 μg/ml,按2.4中的處理方法處理血樣并進(jìn)行熒光測(cè)定。將Dox儲(chǔ)備液經(jīng)適當(dāng)稀釋后作對(duì)照進(jìn)行測(cè)定,將二者結(jié)果進(jìn)行比較計(jì)算提取回收率。

3 結(jié)果與討論

3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液放入熒光分光光度計(jì)中測(cè)量得到593 nm處的熒光強(qiáng)度值，以溶液濃度為橫坐標(biāo)，最終熒光強(qiáng)度值(Y)為縱坐標(biāo)，繪出其熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)，并求得工作曲線的回歸方程：Y=16.944X+0.6796(R2=0.9997)。結(jié)果表明，Dox在0.1～15 μg/ml的濃度范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度值與濃度線性關(guān)系良好。

圖1 Dox血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2精密度試驗(yàn)

3.2.1日內(nèi)精密度 Dox的日內(nèi)精密度見表1。從表中可知阿霉素血漿溶液日內(nèi)RSD值小于3%，表示該檢測(cè)方法測(cè)定的日內(nèi)精密度良好。

表1 Dox血漿溶液日內(nèi)精密度

3.2.2日間精密度 Dox的日間精密度見表2。從表中可知，Dox血漿溶液日間RSD值小于3%，表示該檢測(cè)方法測(cè)定的日間精密度良好。

表2 Dox血漿溶液日間精密度

3.3專屬性實(shí)驗(yàn)

對(duì)空白血漿、Dox水溶液和Dox血漿溶液進(jìn)行熒光發(fā)射圖譜掃描，掃描結(jié)果如圖2，從圖中我們可以看出，5 μg/ml Dox血漿溶液的熒光發(fā)射圖譜與5μg/ml Dox血漿溶液水溶液的熒光發(fā)射圖譜，基本重合，說明方法可行。血漿中Dox穩(wěn)定存在，熒光圖譜為Dox專屬。

圖 2 Dox專屬性實(shí)驗(yàn)

3.4回收率實(shí)驗(yàn)

Dox回收率見表3，從表中可知，Dox的提取回收率均大于84%，RSD小于2.5%，表明該檢測(cè)方法回收率良好，符合要求。

表3 Dox血漿溶液回收率

3.5CS-Dox回收率實(shí)驗(yàn)

CS-Dox回收率見表4，從表中可知，CS-Dox的提取回收率均大于84%，RSD小于1.2%，表明該檢測(cè)方法回收率良好，符合要求。

表4 CS-Dox血漿溶液回收率

本實(shí)驗(yàn)所建立的大鼠血漿中Dox的測(cè)定方法，經(jīng)過方法學(xué)確證，在0.1～15.0 μg/ml的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9997。該方法的日內(nèi)精密度和日間精密度的 RSD 均小于2.5%，專屬性良好，Dox和CS-Dox提取回收率均大于84%，回收率較高；基本滿足Dox和CS-Dox在大鼠血漿中藥物濃度檢測(cè)的需要，同時(shí)為Dox和CS-Dox大鼠藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了可靠的分析方法。