余光書 林焱斌* 熊國勝 李杰輝 張壽雄 王海洋

1．廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院骨科，福建福州350007

2．福建中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，福建福州350122

3．廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院，福建廈門361102

骨性關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性變?yōu)橹饕±硖卣鞯穆怨顷P(guān)節(jié)疾病，其發(fā)生發(fā)展是多種原因?qū)е鲁晒羌?xì)胞與破骨細(xì)胞失衡所引起，但發(fā)病機(jī)制還不甚清楚［1-2］。目前，大多數(shù)研究表明軟骨細(xì)胞的凋亡在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，阻止或延緩軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡是防治骨性關(guān)節(jié)炎的一條有效途徑［3-4］。軟骨細(xì)胞的凋亡主要有外源性通路和內(nèi)源性通路，其中線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路越來越受到關(guān)注，而凋亡蛋白酶激活因子引起半胱天冬酶瀑布式活化和細(xì)胞凋亡是目前研究的熱點(diǎn)［5］。筆者在既往臨床觀察發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血中藥能夠有效預(yù)防膝骨性關(guān)節(jié)炎的基礎(chǔ)上，擬從體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究補(bǔ)腎活血中藥對細(xì)胞凋亡的影響，及其對Trx2信號通路的調(diào)控作用，以期為進(jìn)一步研究骨性關(guān)節(jié)炎的防治機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與材料

成年清潔型SD大鼠，體重在(180±20)g，雌雄各半，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(許可證號:SCXK 2016-0002)。膠原酶 II(編號:C8150)、Trx2(編 號:YT4752)、ASK1(編 號:YT0370)、Caspase3(編號:YC006)由北京市普京康利科技有限公司提供，DMEM培養(yǎng)基(編號:180-500)、0.25%胰蛋白酶(編號:TE2004Y)、胎牛血清(編號:TBD11HT)由北京孚博生物科技有限公司提供，PBS緩沖液(編號GT0060)由晶泰公司提供，凋亡試劑盒(編號KGA107)由南京凱基公司提供，中藥顆粒由廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院藥劑科提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 含藥血清的制備:成年SD大鼠10只，雌雄各半，體重在(180±20)g。隨機(jī)分為空白血清組和含藥血清組，每組5只。依據(jù)臨床常用量按實(shí)驗(yàn)動物與人體表面積折算的等效劑量比值換算，將補(bǔ)骨顆粒用生理鹽水加熱溶解，制成1 g/mL的水溶液。空白血清組予生理鹽水2 mL/kg灌胃，含藥血清組予3.08 g/kg灌胃，每日1次，連續(xù)14 d，末次給藥2 h后處死大鼠，并在無菌條件下腹主動脈采血5 mL，靜置2 h后低溫2 000 r/min，離心15 min后分離血清，于56℃恒溫水浴滅活30 min，－80℃冰箱保存。

1.2.2 軟骨細(xì)胞的分離與傳代:將大鼠浸泡于75%的乙醇中消毒3 min，取出處死后在無菌條件下解剖出關(guān)節(jié)軟骨，去盡其他組織后放入有雙抗的PBS液(含青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL)漂洗4～6次，然后將其放入消毒的青霉素小瓶并加入1.5 mg/mLⅡ型膠原酶溶液，在膠原酶小瓶中剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的碎片，封口于37℃水浴鍋內(nèi)消化30 min，期間不時(shí)用手搖瓶，棄去上懸酶液，用DMEM漂洗1～2次，吸盡上清后再加入10倍體積的0.2%Ⅱ型膠原酶，37℃水浴鍋內(nèi)消化30 min后收集上懸液，如此反復(fù)3次，集中所有上懸液，1 000 r/min離心5 min，倒去上清液，沉淀用PBS液洗滌3次，用4 mL含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)液混懸細(xì)胞，剩余軟骨片及絮狀膠樣物棄去。將分離好的軟骨細(xì)胞接種于25 cm2的培養(yǎng)皿中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后觀察細(xì)胞貼壁情況，以后每3 d更換1次培養(yǎng)液。待生長細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿70%～80%時(shí)，通過用0.25%胰蛋白酶在37℃溫育1 min將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中分離。加入完全培養(yǎng)基，通過3 000 r/min離心5 min收獲細(xì)胞，并重懸于培養(yǎng)基中以除去胰蛋白酶。將細(xì)胞接種在大培養(yǎng)皿中，4～5 d后獲得原代細(xì)胞。在隨后的傳代中每2 d更換培養(yǎng)基，經(jīng)歷2～5次傳代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡:取第3代軟骨細(xì)胞以1×105/cm2接種于培養(yǎng)板中，培養(yǎng)72 h細(xì)胞貼壁后“饑餓”培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步化。細(xì)胞隨機(jī)分組后，于A組加入空白血清、B組加入10%含藥血清、C組加入20%含藥血清、D組加入30%含藥血清，繼續(xù)培養(yǎng)96 h后收集細(xì)胞懸浮液，以PBS洗滌細(xì)胞2次后使用胰蛋白酶消化并收集于離心管。在4℃條件下以1 000 r/min離心5 min兩次，然后轉(zhuǎn)移到專用管，按Annexin V-FITC/PI試劑盒說明進(jìn)行操作，采用BD FACScalibur流式細(xì)胞儀定量細(xì)胞凋亡，CellQuest Pro軟件用于分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 電泳和蛋白質(zhì)印跡分析:將收集到的細(xì)胞通過無菌PBS清洗兩次后再加入適量PBS，用無菌刮刀收集細(xì)胞于1.5 mL EP管中，在冰上用含有1 mmol/L蛋白酶抑制劑苯基甲磺酰氟(PMSF)的RIPA緩沖液裂解30 min。在4℃下以12 000 r/min離心10 min，取上清用于蛋白濃度測定(BCA法)。蛋白濃度測定后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各個(gè)樣品的蛋白含量，再加入適量5×蛋白上樣緩沖液，調(diào)整各個(gè)樣品的最終濃度一致后將蛋白樣品煮沸5 min，以12 000 r/min離心1 min后取出上清液放入EP管中，按照SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說明書配制4%PAGE凝膠，上樣后先用電壓80 V，約30 min，待蛋白電泳至濃縮膠與分離膠交界處時(shí)改用電壓120 V，約60 min。將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，再將NC膜放入現(xiàn)配的5%的脫脂奶粉溶液(2 g脫脂奶粉溶于40 mL 1×TBST中)中室溫?fù)u床封閉2 h。洗膜后加入按稀釋液1∶1000的一抗中，4℃孵育過液。洗膜后放入按稀釋液1∶3000的二抗中，水平搖動，室溫孵育2 h。取出NC膜，TBST洗滌3次，每次10 min。洗膜后使用ECL發(fā)光試劑化學(xué)顯色后曝光并顯影，使用Image J圖象分析系統(tǒng)測定條帶灰度值，Actin作為內(nèi)參，取其余組與其比值進(jìn)行計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。各組間的細(xì)胞凋亡率比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 采用膠原酶消化法對軟骨細(xì)胞進(jìn)行分離并進(jìn)行原代軟骨細(xì)胞傳代

從SD大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中分離軟骨細(xì)胞，并使用光學(xué)顯微鏡觀察培養(yǎng)物。從培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)原代的軟骨細(xì)胞增殖速度緩慢，從第10天開始軟骨細(xì)胞的增殖速度才有所加快，約在第15天軟骨細(xì)胞才鋪滿80%～90%的培養(yǎng)皿。在原代軟骨細(xì)胞貼壁傳代后軟骨細(xì)胞貼壁和增殖的速率有所加快，傳代至第2、3代時(shí)細(xì)胞增殖速度最快，第4代后則呈“去分化”現(xiàn)象，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)過程中梭形狀細(xì)胞在逐漸增加。見圖1。

圖1 細(xì)胞多為梭形，少數(shù)為星形、橢圓形，符合軟骨細(xì)胞形態(tài) A:細(xì)胞未鋪滿;B:細(xì)胞鋪滿后。Fig．1 Most of the cells are fusiform，and a few are star-shaped and elliptical，which conform to the morphology of chondrocytes．A:Not covered by cells;B:Covered by cells．

2.2 使用凋亡檢測試劑盒檢測4組軟骨細(xì)胞的凋亡，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測第5天各組的凋亡能力

檢測結(jié)果顯示，空白血清組的細(xì)胞凋亡率為22.80%，明顯高于含藥血清組(P＜0.05)，而20%含藥血清組(15.91%)與30%含藥血清組(17.93%)的細(xì)胞凋亡率又明顯低于10%含藥血清組(21.58%)，各組間的比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2。

2.3 Western印跡法檢測不同劑量補(bǔ)骨顆粒含藥血清對軟骨細(xì)胞Trx2信號通路的影響

通過條帶分析可以觀察到含藥血清組Trx2的表達(dá)量都明顯增多，以10%含藥血清組的表達(dá)量最多;空白組與10%含藥血清組的ASK1與Caspase3的表達(dá)量比20%與30%含藥血清組多。見圖3。通過與Actin內(nèi)參蛋白比值的統(tǒng)計(jì)，可以得到如表1所示的值。

表1 與Actin內(nèi)參蛋白的比值Table 1 Ratio to Actin of internal reference protein

3 討論

圖2 細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖 A:圈定細(xì)胞;B:空白血清組;C:10%含藥血清組;D:20%含藥血清;E:30%含藥血清組。Fig．2 Apoptosis scatter plot．A:Delineate cells;B:Blank serum group;C:10%drug-containing serum group;D:20%drug-containing serum group;E:30%drug-containing serum group．

圖3 Western印跡圖Fig．3 Western blot

膝關(guān)節(jié)軟骨組織內(nèi)并無血管、神經(jīng)及淋巴液等供應(yīng)，因此不能通過自我更新補(bǔ)償丟失的細(xì)胞，而是通過增殖來維持成骨與破骨的平衡狀態(tài)，但是軟骨細(xì)胞的增殖分化速度較慢。筆者在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)10 d左右才開始逐漸聚集形成軟骨細(xì)胞團(tuán)集落，而在培養(yǎng)的15 d左右才鋪滿80%～90%的培養(yǎng)皿。因此，研究如何預(yù)防軟骨細(xì)胞的凋亡具有重要的意義。而軟骨細(xì)胞的凋亡由多個(gè)基因參與調(diào)控，其中線粒體介導(dǎo)的凋亡通路主要是通過呼吸電子漏途徑，引起線粒體跨膜電位降低，導(dǎo)致凋亡蛋白酶激活因子釋放到胞漿，隨之引起半胱天冬酶瀑布式活化和細(xì)胞凋亡［6］。其中硫氧還蛋白2(Trx2)是特異位于線粒體的小分子蛋白，它在抗氧化應(yīng)激、阻止線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮著不可忽略的作用［7-8］。

補(bǔ)骨顆粒由骨碎補(bǔ)、鹿銜草、淫羊藿、黨參、茯苓、三七、川牛膝、當(dāng)歸、川芎、女貞子、枸杞及生地等藥物組成?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，骨碎補(bǔ)、淫羊藿、鹿銜草等補(bǔ)益肝腎中藥可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，抑制破骨細(xì)胞的吸收，從而達(dá)到預(yù)防退行性改變的作用［9-10］。黨參、茯苓等補(bǔ)氣健脾中藥可以提高抗氧化酶的活性，抑制脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，增強(qiáng)運(yùn)動能力［11］。三七、當(dāng)歸等活血藥物可以通過調(diào)控線粒體信號通路而控制細(xì)胞的凋亡［12-13］。由上述可知，補(bǔ)骨顆粒通過“補(bǔ)腎健脾，活血化瘀”的方法可以起到促進(jìn)細(xì)胞增殖與抑制細(xì)胞凋亡的功效。本課題研究過程也證實(shí)了補(bǔ)骨顆?？梢砸种栖浌羌?xì)胞凋亡的作用。

硫氧還蛋白2(Trx2)是特異位于線粒體的小分子蛋白，可以與凋亡信號調(diào)節(jié)激酶-1(ASK1)結(jié)合并抑制ASK1的活性，從而抑制凋亡前因子Caspase3所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［14-15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明補(bǔ)骨顆?？梢源龠M(jìn)Trx 2的表達(dá)，但是濃度較低時(shí)不利于Trx2/ASK1復(fù)合物的形成。因此，10%含藥血清組的Trx2與ASK1都明顯高于20%與30%含藥血清組，而ASK1可以激活Caspase 3的表達(dá)及其活性，所以空白血清組與10%含藥血清組的Caspase 3表達(dá)量明顯多于20%與30%含藥血清組。筆者從流式細(xì)胞分析技術(shù)中也發(fā)現(xiàn)了空白血清組與10%含藥血清組的細(xì)胞凋亡率高于20%與30%含藥血清組。因此，筆者認(rèn)為補(bǔ)骨顆粒含藥血清可以通過調(diào)控Trx2-ASK1-caspase 3信號途徑以控制軟骨細(xì)胞的凋亡，但是含藥血清需要達(dá)到一定合適的濃度，否則不利于Trx 2/ASK 1復(fù)合物的形成。