于冬冬 趙丹陽 姚嘯生 楊鶇祥 侯德才

1．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧沈陽110032

2．沈陽市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽110041

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopasal osteoporosis，PMOP)是最常見的原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥。PMOP導(dǎo)致骨質(zhì)疏松性骨折的風(fēng)險(xiǎn)增加［1］，是老年女性骨折的主要原因之一［2］。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡是維持骨穩(wěn)態(tài)的重要條件，在PMOP的發(fā)病過程中破骨細(xì)胞過度活化，同時(shí)伴隨著過度的骨吸收［3］。因此，抑制破骨細(xì)胞活性及分化仍然是目前PMOP防治的重要手段及方法。

葛根素作為葛根的活性成分，作用于機(jī)體發(fā)揮不同的藥理學(xué)作用，如抗氧化、抗應(yīng)激、抗感染、抗腫瘤等。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)葛根素能夠抑制成骨細(xì)胞的凋亡，繼而達(dá)到防治骨質(zhì)疏松癥的藥理學(xué)作用［4］。有研究發(fā)現(xiàn)葛根素能夠防治卵巢切除(OVX)大鼠的骨質(zhì)疏松、調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的形成，但是具體的潛在機(jī)制還不清楚［5］。

本實(shí)驗(yàn)的目的是研究葛根素對(duì)破骨細(xì)胞形成及分化的影響，探索其潛在的作用機(jī)制，為葛根素防治PMOP提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞:小鼠單核/巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞(ATCC，美國)。

1.1.2 試劑:葛根素(Puerarin，PUE縮寫，南京狄爾格醫(yī)藥科技公司。溶于 DMSO，儲(chǔ)存濃度10－5mol/L，－ 20 ℃ 保存);sRANKL(Peprotech，美國);M-CSF(Peprotech，美國);DMEM(Hychone，美國);進(jìn)口胎牛血清(Hychone，美國);TRAP染色試劑盒(Sigma，美國);Osteoassay surface Mltiple well plate(Corning，美國);NF-кB免疫熒光檢測(cè)試劑盒(Beyotime，上海)。

1.1.3 儀器:細(xì)胞孵箱(Thermo，美國);倒置相差顯微鏡(Olympus，日本);免疫熒光顯微鏡(Olympus，日本);AMR-100酶標(biāo)儀(杭州奧盛儀器有限公司，中國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠單核/巨噬細(xì)胞RAW 264.7培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化:小鼠單核/巨噬細(xì)胞RAW 264.7培養(yǎng)傳代，未分化培養(yǎng)基含(DMEM、10%胎牛血清、不含抗生素，37℃，5%CO2)。細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，細(xì)胞密度:1×104細(xì)胞/孔，24 h后換成誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液培含(DMEM、10%胎牛血清、15 ng/mL RANKL、15 ng/mLl M-CSF)繼續(xù)培養(yǎng)7 d。

1.2.2 WST-1檢測(cè)細(xì)胞增殖活性:分組:對(duì)照組、10－6～10－10mol/L 的 PUE 組。細(xì)胞平鋪(5×103細(xì)胞/孔)96孔平板中，24 h后更換分化培養(yǎng)基，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)7 d 后，細(xì)胞經(jīng) PUE 處理3、12、24、48、72 h后，每孔加 20 μL WST－1 檢測(cè)液。在 37°C、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h。490 nm讀取吸光度值。OD值=(處理后細(xì)胞OD值－對(duì)照組細(xì)胞OD值)/N，n＞3。

1.2.3 TRAP染色檢測(cè)破骨細(xì)胞分化:分組:A組(對(duì)照組)，B組(sRANKL+M-SCF組)，C組(PUE+sRANKL+M-SCF組)。RAW264.7細(xì)胞(5×104細(xì)胞/孔)在 24孔板內(nèi)培養(yǎng)，在含和不含 PUE(10－8mol/L)的條件下加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化7 d。細(xì)胞TRAP染色根據(jù)Sigma染色試劑盒進(jìn)行操作。

1.2.4 Osteoassay surface Mltiple well plate檢測(cè)破骨細(xì)胞吸收活性:分組:A組(對(duì)照組)，B組(sRANKL+M-SCF組)，C組(PUE+sRANKL+MSCF組)。RAW264.7細(xì)胞(5×104細(xì)胞/孔)在Osteoassay surface Mltiple well plate板內(nèi)培養(yǎng)(24孔)，在含和不含PUE(10－8mol/L)的條件下加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化7 d。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)進(jìn)行顯微鏡拍照，使用Image J軟件測(cè)量吸收面積。

1.2.5 免疫熒光檢測(cè) NF-кB核轉(zhuǎn)位:分組:A組(對(duì)照組)，B組(sRANKL+M-SCF組)，C組(PUE+sRANKL+M-SCF組)。細(xì)胞在蓋玻片上并培養(yǎng)過夜，在含和不含PUE(10－8mol/L)的條件下加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化7 d。免疫固定液將細(xì)胞固定(室溫15 min)，用免疫洗滌液(含0.1%的Triton X-100)洗滌。用p-p65抗體孵育細(xì)胞(以1∶400的比例稀釋)過夜，用DAPI(5 min)染色細(xì)胞核，免疫熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

1.2.6 Western blot檢測(cè):細(xì)胞分 sRANKL+MSCF、PUE+sRANKL+M-SCF組。細(xì)胞加入裂解液提取蛋白、定量、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗過夜、二抗孵育、ECL發(fā)光法曝光成像，掃描入電腦，n＞3。Image J軟件測(cè)定平均灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用ANOVA方法，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 葛根素抑制破骨細(xì)胞增殖活性

WST－1法檢測(cè)PUE對(duì)破骨細(xì)胞增殖活性的影響(圖1)。結(jié)果顯示，各個(gè)濃度的PUE均能抑制破骨細(xì)胞的增殖活性(其中PUE 10－8mol/L，預(yù)處理3 h，與對(duì)照組比較，P＜0.05，n＞3)，PUE(10－8mol/L)作用3 h后具有較大的增殖活性抑制作用。因此，PUE(10－8mol/L)預(yù)處理3 h作為實(shí)驗(yàn)用藥濃度及作用時(shí)間。

2.2 破骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)(圖2)，未誘導(dǎo)分化的RAW264.7細(xì)胞呈圓形，透光度好，邊界清晰，無觸角或少量觸角。加入誘導(dǎo)液后，細(xì)胞觸角略增多，細(xì)胞略呈短梭形，細(xì)胞透光度下降，細(xì)胞融合成巨大的多核破骨細(xì)胞(破骨細(xì)胞的數(shù)量=細(xì)胞核≥3個(gè)細(xì)胞的數(shù)量/總的細(xì)胞數(shù)量，誘導(dǎo)分化組P＜0.01，與對(duì)照組比較，n＞3);加入 PUE后，破骨細(xì)胞的分化受到抑制(P＜0.05，與非PUE處理組比較，n＞3)。

圖1 葛根素抑制破骨細(xì)胞增殖Fig．1 Puerarin inhibits osteoclast proliferation

圖2 形態(tài)學(xué)觀PUE抑制破骨細(xì)胞形成 A:對(duì)照組;B:誘導(dǎo)分化組(sRANKL+M-SCF誘導(dǎo)分化7 d);C:PUE+sRANKL+M-SCF(PUE 10－8mol/L 預(yù)處理 3 h后，sRANKL+M-SCF誘導(dǎo)分化7 d)。Fig．2 Morphologicalobservation ofPUE inhibiting osteoclastformation．A: Controlgroup; B: Induced differentiation group (sRANKL + M-SCF induced differentiation for 7 days);C:PUE+sRANKL+M-SCF(3 hours after PUE 10－8mol/L pretreatment，sRANKL+MSCF induced differentiation for 7 days)．

2.3 TRAP染色檢測(cè)破骨細(xì)胞分化

TRAP檢測(cè)PUE(10－8mol/L)對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響(圖3)，筆者前期研究發(fā)現(xiàn)濃度為15 ng/mL的sRANKL+M-CSF誘導(dǎo)分化7 d具有明顯的誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化的效果［5］。在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中加入PUE(10－8mol/L)預(yù)處理3 h后，RAW264.7細(xì)胞誘導(dǎo)分化7 d，結(jié)果顯示未加PUE組的破骨細(xì)胞分化明顯(P＜0.01，與對(duì)照組比較，n＞3)，PUE能夠明顯抑制破骨細(xì)胞的分化(P＜0.05，與非PUE處理組比較，n＞3)。

圖3 PUE抑制破骨細(xì)胞的分化 A:對(duì)照組;B:誘導(dǎo)分化組(sRANKL+M-SCF誘導(dǎo)分化7 d);C:PUE+sRANKL+M-SCF(PUE 10－8mol/L預(yù)處理 3 h后，sRANKL+MSCF誘導(dǎo)分化7 d)。Fig．3 PUE inhibits osteoclast differentiation．A:Control group;B:Induced differentiation group(sRANKL+M-SCF induced differentiation for 7 days);C:PUE+sRANKL+M-SCF(3 hours after PUE 10－8mol/L pretreatment，sRANKL+M-SCF induced differentiation for 7 days)．

2.4 Osteo Assay Surface檢測(cè)破骨細(xì)胞吸收活性

破骨細(xì)胞分化后，會(huì)吞噬Osteoassay plate的仿生物的骨組織，進(jìn)而形成吸收池(absorb pit)，吸收池的大小與破骨細(xì)胞的吸收活性呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示(圖4)，誘導(dǎo)分化組形成明顯的吸收池，達(dá)到視野的30%以上(P＜0.01，與對(duì)照組比較，n＞3)，加入PUE后，吸收池縮小，提示破骨細(xì)胞的吸收活性受到抑制(P＜0.05，與非PUE處理組比較，n＞3)。

2.5 免疫熒光檢測(cè)NF－кB核轉(zhuǎn)位

NF-κB未被激活時(shí)被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)促進(jìn)NF-κB依賴的基因轉(zhuǎn)錄。通過免疫染色檢測(cè)NF-κB的主要亞基p65是否被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，就可以判斷NF-κB是否被激活。本研究結(jié)果顯示(圖5)，破骨細(xì)胞分化后，p65向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位，PUE能夠抑制其向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位。

2.6 Westerm blot結(jié)果檢測(cè)

進(jìn)一步分析PUE抑制成骨細(xì)胞分化的潛在機(jī)制(圖6)，免疫印跡檢測(cè)通路蛋白顯示，sRANKL+M-CSF促進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)p65的磷酸化，其中加入誘導(dǎo)液30 min時(shí)p65的磷酸化明顯增多，而60 min時(shí)其磷酸化降低。加入PUE后第30 min，p65的磷酸化受到抑制，說明PUE發(fā)揮其抑制破骨細(xì)胞分化的藥效學(xué)機(jī)制通過抑制NF-κB信號(hào)通路完成(P＜0.01，與PUE+sRANKL+M-CSF作用組比較，n＞3)。

圖4 PUE抑制破骨細(xì)胞的吸收活性 A:對(duì)照組;B:誘導(dǎo)分化組(sRANKL+M-SCF誘導(dǎo)分化7 d);C:PUE+sRANKL+M-SCF(PUE 10－8mol/L 預(yù)處理 3 h后，sRANKL+M-SCF誘導(dǎo)分化7 d)。Fig．4 PUE inhibits the absorptive activity of osteoclasts．A: Controlgroup; B: Induced differentiation group(sRANKL+M-SCF induced differentiation for 7 days);C:PUE+sRANKL+M-SCF(3 hours after PUE 10－8mol/L pretreatment，sRANKL+M-SCF induced differentiation for 7 days)．

3 討論

PMOP導(dǎo)致骨質(zhì)疏松性骨折的風(fēng)險(xiǎn)增加［6-7］。在PMOP的發(fā)病過程中，破骨細(xì)胞過度形成及分化，因此，抑制破骨細(xì)胞形成及分化仍然是PMOP治療的重要策略［3］。

目前臨床使用的抗PMOP的藥物，長期使用都有一些局限性。例如，長期使用雙膦酸鹽治療會(huì)引起相關(guān)的心房顫動(dòng)、頜骨壞死和嚴(yán)重抑制骨轉(zhuǎn)換［8］。此外，長期使用SRMS藥物(雷洛昔芬)導(dǎo)致靜脈血栓栓塞和致命中風(fēng)已被報(bào)道［9］。因此，需要一種不僅可以提高骨密度、而且還可以促進(jìn)新骨的形成、長期用藥沒有有嚴(yán)重副作用的新藥。

圖5 PUE抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位 A:對(duì)照組;B:誘導(dǎo)分化組(sRANKL+M-SCF誘導(dǎo)分化7 d);C:PUE+sRANKL+M-SCF(PUE 10－8mol/L預(yù)處理3 h后，sRANKL+M-SCF誘導(dǎo)分化7 d)。Fig．5 PUE inhibits nuclear translocation of NF－κB．A:Control group;B:Induced differentiation group(sRANKL+M-SCF induced differentiation for 7 days);C:PUE+sRANKL+M-SCF(3 hours after PUE 10－8mol/L pretreatment，sRANKL+MSCF induced differentiation for 7 days)．

圖6 PUE抑制P65磷酸化Fig．6 PUE inhibits P65 phosphorylation

葛根素作為葛根的活性成分，抵抗機(jī)體各種疾病，如心血管系統(tǒng)疾病、腦部疾病、腫瘤、及炎癥等。葛根素具有抗骨質(zhì)疏松的藥效學(xué)作用，能夠預(yù)防去卵巢(OVX)大鼠的骨丟失，提高骨量，而且不增加雌激素樣的作用。最近的研究報(bào)道，葛根素能夠抑制破骨細(xì)胞形成，抑制骨丟失［4］，但潛在的還不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，葛根素能夠抑制破骨細(xì)胞的分化，加入葛根素后破骨細(xì)胞不僅數(shù)量減少。同時(shí)吸收池實(shí)驗(yàn)顯示，加入葛根素后破骨細(xì)胞的吸收能力明顯下降，說明破骨細(xì)胞的活性受到抑制，這對(duì)于防治PMOP來說，具有非常重要的意義。

NF-κB信號(hào)通路在調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的形成及分化中發(fā)揮重要作用［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，葛根素抑制NF-κB的核心蛋白p65的磷酸化，抑制其從細(xì)胞漿向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而防止破骨細(xì)胞形成。因此，葛根素通過NF-κB信號(hào)通路抑制破骨細(xì)胞的分化，進(jìn)而達(dá)到防治PMOP的藥理學(xué)作用。

目前研究骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)理雖然較多，但是基于NF-κB信號(hào)通路，從破骨細(xì)胞分化為研究的切入點(diǎn)，探索中醫(yī)藥活性成分葛根素對(duì)破骨細(xì)胞分化機(jī)制的相關(guān)研究較少。因此，本研究對(duì)于中醫(yī)藥臨床防PMOP具有一定的意義。