陳健敏

(莆田學(xué)院藥學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，藥物分析與檢驗醫(yī)學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗室，福建 莆田 351100)

黃瑋玥,葉雅玲, 黃子堯

(莆田學(xué)院藥學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，福建 莆田 351100)

阮志鵬

(莆田學(xué)院藥學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，藥物分析與檢驗醫(yī)學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗室，福建 莆田 351100)

甘草是我國最常用的十大宗藥材之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，甘草又稱國老、靈通、甜草根等，屬多年生草本植物，是豆科蝶形花亞科。據(jù)文獻(xiàn)報道，全球范圍內(nèi)甘草屬的多年生草本植物共29種，而我國范圍內(nèi)該屬植物共有18種[1],具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功效[2]。甘草提取物具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗免疫、抗?jié)兗氨８巫饔肹3]，其中主要的化學(xué)成分為甘草酸、甘草次酸、甘草素等，所具有的功效各有不同[4]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品[5]、化妝品等各個領(lǐng)域。近年來，研究發(fā)現(xiàn)甘草提取物具有抗氧化[6]及酪氨酸酶活性抑制作用[7～9]。然而，甘草提取物作為一種混合物，不同產(chǎn)地、不同品種的提取物中的成分含量差異較大[10]，單純研究甘草提取物的酪氨酸酶活性抑制及抗氧化作用，可能出現(xiàn)作用效果不一致的情況，不利于對甘草資源的開發(fā)利用。如能探明甘草提取物的功效與主要成分的對應(yīng)關(guān)系，探清其功效的作用機(jī)制，闡明主要成分的構(gòu)效關(guān)系，再將這些主要成分分離提純，將大大提高甘草提取物的藥用價值，有利于開發(fā)我國豐富的甘草資源。為此，筆者以甘草提取物中的主要成分槲皮素、光甘草定、異甘草素、刺芒柄花素、甘草酸和甘草次酸為研究對象，為了相互驗證這些成分的抗氧化能力大小，采用ABTS自由基清除法、DPPH自由基清除法以及FRAP(鐵離子還原能力)法等3種方法測定這6種成分的抗氧化能力，探究甘草提取物中表現(xiàn)出抗氧化作用和酪氨酸酶活性抑制作用的主要成分，探清其功效的內(nèi)在作用機(jī)制，并嘗試闡明其中的構(gòu)效關(guān)系。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

酪氨酸酶(比活力為2500 U/mL，Worthington)。L-多巴、L-酪氨酸、碳酸氫二鈉自由基十二水(分析純，99%)、碳酸二氫鈉·二水(分析純)、乙醇(ACS，≥99.5%)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)和奎諾二甲基丙烯酸酯(Trolox)均購自上海晶純生化科技股份有限公司。光甘草定(98%以上)、甘草酸(93%)、甘草次酸(98%以上)、異甘草素(98%以上)、刺芒柄花素(98%以上)和槲皮素(97%)購于合肥博美生物科技有限公司。試驗中的其他試劑均為分析純。

1.2 主要設(shè)備與儀器

UV2550 紫外可見分光光度計，日本島津；Milli-Q-Plus超純水發(fā)生器, 德國賽多利斯；BSM 分析天平，上海卓精科技有限公司；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州智博瑞儀器制造有限公司。

2 試驗方法

2.1 ABTS自由基清除能力的測定

ABTS經(jīng)活性氧氧化后生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽離子ABTS自由基，向其中加入被測物質(zhì)，如果該物質(zhì)中存在抗氧化成分，則該物質(zhì)會與ABTS自由基發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色[11]，被廣泛用于測試物質(zhì)的抗氧化能力。采用ABTS自由基清除法測定甘草提取物中的6種主要成分，參考文獻(xiàn)[12] 的方法并作修改。測定方法如下：分別取20μL不同濃度梯度的樣品溶液加到 2mL ABTS溶液中(初始吸光度在734nm處為0.70±0.02，記為A0min)，反應(yīng)3min后在 734nm處測定吸光度(記為A3min)，每個濃度樣品進(jìn)行3次平行試驗。根據(jù)以下公式計算每個樣品的ABTS自由基清除率(%):

然后以樣品的濃度為橫坐標(biāo)，以ABTS自由基清除率為縱坐標(biāo)，繪制曲線。

2.2 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基在乙醇溶液中是一種穩(wěn)定的自由基，對波長517nm處的光有強(qiáng)吸收。當(dāng)反應(yīng)體系中加入自由基清除劑時，DPPH自由基的單電子被配對，在最大吸收波長處(517nm)處吸光度變小，加入的自由基清除劑抗氧化能力越強(qiáng)，吸光度下降越大[13]，也常用于物質(zhì)抗氧化能力的測定。采用DPPH自由基清除法測定甘草提取物中的6種主要成分，參考文獻(xiàn)[14] 的方法并略作修改。測定方法如下：分別取100 μL不同濃度梯度的樣品溶液及 2mL DPPH 溶液加入到同一試管混勻，室溫下暗處靜置 30min后測定其517nm處的吸光度(記為Asample)；將100 μL溶劑(無水乙醇或者相應(yīng)的緩沖溶液)與2mL DPPH溶液混勻，暗處靜置30min后測定其517nm處的吸光度 (記為Acontrol)；將100 μL測試樣品溶液與2mL無水乙醇混勻，暗處靜置 30min后測定其517nm處的吸光度(記為Ablank)。每個待測樣品進(jìn)行3次平行試驗，根據(jù)以下公式計算每個樣品的DPPH自由基清除率(%):

然后以樣品的濃度為橫坐標(biāo)，以DPPH自由基清除率為縱坐標(biāo)，繪制曲線。

2.3 FRAP(鐵離子還原能力)抗氧化能力的測定

在酸性條件下，F(xiàn)e3+-TPTZ可被樣品中還原性物質(zhì)還原為Fe2+-TPTZ形式，并呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色，于593nm處具有最大吸光度，在Fe3+-TPTZ過量的情況下，檢測藍(lán)色物質(zhì)的生成量可以反映待測樣品的還原能力，即樣品的抗氧化能力(FRAP)[15]。采用FRAP法測定甘草提取物中的6種主要成分，參考文獻(xiàn)[16] 的方法并略作修改。測定方法如下：取一試管，加入3.3mL的醋酸鹽緩沖液(pH值為3.6)，加入330 μL的20mmol/L FeCl3溶液，加入330μL的10mmol/L TPTZ溶液，振蕩使其混勻，在37℃恒溫孵育5 min，形成Fe3+-TPTZ；再在其中加入330μL不同濃度梯度的樣品溶液，在37℃恒溫反應(yīng)15min后，在波長593nm處測定其吸光度。每個待測樣品進(jìn)行3次平行試驗，以樣品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制曲線，根據(jù)曲線的斜率及同濃度下吸光度的大小來比較樣品的抗氧化能力。

2.4 酪氨酸酶活性抑制試驗

酪氨酸酶在機(jī)體內(nèi)能將L-酪氨酸羥化，產(chǎn)生鄰位二羥基苯丙氨酸(L-多巴)，再將多巴氧化成多巴醌，進(jìn)而生成一系列引起褐化的色素類物質(zhì)[17]。酪氨酸酶抑制劑可以抑制酶的活性，在醫(yī)藥、化妝品和食品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[18]。采用酪氨酸酶活性抑制試驗測定甘草提取物6種成分的酶抑制能力，參考文獻(xiàn)[19] 的方法并做修改。以0.5 mmol/L的多巴為底物，用0.05mol/L的磷酸緩沖液(pH值為6.8)配制。取3支試管a、b、c分別加入2.8mL底物溶液，32℃預(yù)熱10 min后， b和c加入100μL不同濃度的樣品溶液，a加入等體積無水乙醇。混勻后，a，b加入100μL酪氨酸酶溶液(酶濃度為400U/mL)，c加入100μL磷酸緩沖溶液，搖勻，反應(yīng)10min后分別測定波長475nm處的吸光度，平行測定3次。試管a的溶液所測的吸光度記為A1，試管b的溶液所測的吸光度記為A2，試管c的溶液所測的吸光度記為A3。根據(jù)公式：

計算出不同樣品濃度下的酶抑制率。然后以樣品濃度為橫坐標(biāo)，以酶抑制率為縱坐標(biāo)，繪制曲線，進(jìn)而比較樣品的酶抑制能力。

2.5 分子對接試驗

采用AutoDock軟件分析甘草提取物與酪氨酸酶之間的相互作用，參考文獻(xiàn)[20] 和[21] 的方法稍加修改。首先從https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)站上下載蘑菇酪氨酸酶(PDB ID: 2Y9X)及甘草提取物(槲皮素、光甘草定、異甘草素、刺芒柄花素和甘草次酸)的3D結(jié)構(gòu)文件(甘草酸因手性原子數(shù)量較多而3D結(jié)構(gòu)難以確認(rèn)，尚無3D結(jié)構(gòu)圖)，然后用Chem 3D軟件轉(zhuǎn)化成PDB格式。利用AutoDockTools 1.5.4對酪氨酸酶大分子(受體)進(jìn)行處理(包括去除水，加氫等)，并保存為pdbqt文件；甘草提取物的5個主要成分(配體)也使用同樣方法保存為pdbqt文件；設(shè)置X、Y、Z軸值為4.827、28.489、92.878，使盒子(Grid box)處于分子中心，整個大分子均在盒子之內(nèi)，盒子大小為88、76、106，一個網(wǎng)格的間距是0.375?。利用Autogrid計算格點(diǎn)的能量分?jǐn)?shù)，采用拉馬克遺傳算法(Lamarckian genetic algorithm)進(jìn)行對接運(yùn)算，并設(shè)定運(yùn)算次數(shù)為100次。一般結(jié)合能量最低時的對接結(jié)果就是大分子與配體結(jié)合最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，將對接結(jié)果保存為PDB格式，利用PyMoL軟件查看最佳構(gòu)象并制圖。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次(n=3),采用Microsoft Office Excel 2007 數(shù)據(jù)分析工具進(jìn)行處理，并用Duncan 多重比較(SSR 法)檢驗各處理平均數(shù)之間的差異顯著性(P<0.05)。試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,采用Origin Pro 8.5 軟件作圖。

3 結(jié)果與討論

3.1 甘草提取物主要成分的結(jié)構(gòu)式

為了在一定程度闡明甘草提取物中6種主要成分(槲皮素、光甘草定、異甘草素、刺芒柄花素、甘草酸和甘草次酸)的構(gòu)效關(guān)系，從https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/上獲取了6種主要成分的結(jié)構(gòu)式，如圖1所示。

3.2 ABTS自由基清除能力的測定

以樣品的濃度為橫坐標(biāo)，以ABTS自由基清除率為縱坐標(biāo)，繪制曲線如圖2所示。由于其余3種成分的ABTS自由基清除能力不明顯，檢測結(jié)果過小，即無抗氧化能力，因此圖2只顯示槲皮素IC50、光甘草定、異甘草素的ABTS自由基清除率與樣品濃度的關(guān)系。從圖2可看出，ABTS自由基清除能力大小順序依次為：槲皮素>光甘草定>異甘草素；根據(jù)其各自的曲線方程得出槲皮素和光甘草定清除率的IC50(ABTS自由基清除率達(dá)到50%時的濃度)分別為(20.82 ± 2.11)和(35.92 ± 1.44)μmol/mL，異甘草素未能檢測到其IC50，IC50越小清除能力越強(qiáng)。槲皮素、光甘草定、異甘草素均為甘草黃酮類化合物[22]，結(jié)構(gòu)中含酚羥基；酚羥基可以與自由基反應(yīng)生成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，使自由基鏈反應(yīng)終止[23]，酚羥基的數(shù)量以及酚羥基的位置決定了甘草提取物是否具有自由基清除能力。槲皮素具有4個酚羥基，分別構(gòu)成間苯二酚結(jié)構(gòu)和鄰苯二酚結(jié)構(gòu)；光甘草定有2個酚羥基構(gòu)成間苯二酚結(jié)構(gòu)；異甘草素具有3個酚羥基，其中2個構(gòu)成間苯二酚結(jié)構(gòu)，另一個為對位酚羥基；而刺芒柄花素只有1個酚羥基，甘草酸和甘草次酸沒有酚羥基；由此可以推斷3種成分的自由基清除能力與酚羥基的數(shù)量呈現(xiàn)正相關(guān)[24]。因此，槲皮素、光甘草定與異甘草素有較高的自由基清除能力，是甘草提取物表現(xiàn)出抗氧化功效的主要成分。

圖1 甘草提取物中6種主要成分的結(jié)構(gòu)式

3.3 DPPH自由基清除能力的測定

以樣品的濃度為橫坐標(biāo)，以DPPH自由基清除率為縱坐標(biāo)，繪制曲線如圖3所示。甘草酸、甘草次酸及刺芒柄花素測定結(jié)果過小，即自由基清除能力不明顯，因此圖3只顯示槲皮素、光甘草定和異甘草素的DPPH自由基清除率。

圖2 3種待測成分的ABTS 自由基清除能力 圖3 3種待測成分的DPPH自由基清除能力

從圖3可看出，槲皮素DPPH自由基清除能力顯著高于光甘草定和異甘草素；根據(jù)曲線方程得出槲皮素DPPH自由基清除率IC50(DPPH自由基清除率達(dá)到50%時的濃度)為(7.50 ± 0.05)μmol/mL。光甘草定和異甘草素的DPPH自由基清除能力有限，同濃度下光甘草定比異甘草素具有更強(qiáng)的清除能力。研究表明,槲皮素可提供活潑氫使自由基滅活，而本身被氧化形成新的自由基，因其含鄰苯二酚結(jié)構(gòu)而具有較高的穩(wěn)定性[25]。DPPH與ABTS雖反應(yīng)機(jī)制不同，但均是通過消除溶液中生成的自由基而達(dá)到抗氧化的作用，因此與ABTS法測定結(jié)果一致，自由基清除能力與甘草提取物結(jié)構(gòu)中的酚羥基有密不可分的關(guān)系，如上述ABTS法中所分析。

3.4 FRAP(鐵離子還原能力)的測定

以樣品濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制曲線如圖4所示。甘草酸、甘草次酸及刺芒柄花素?zé)o明顯作用，因此圖4只顯示槲皮素、光甘草定和異甘草素在FRAP測定中所呈現(xiàn)的吸光度值。比較圖4中直線的斜率可知，槲皮素抗氧化能力(還原能力)強(qiáng)于光甘草定和異甘草素，其能力也與酚羥基的數(shù)量呈現(xiàn)正比。該試驗結(jié)果表明在酸性條件下，槲皮素、光甘草定和異甘草素三者具有還原鐵離子的能力，還原能力也與其結(jié)構(gòu)中的酚羥基數(shù)量有關(guān)。

3.5 酪氨酸酶活性抑制試驗

以樣品濃度為橫坐標(biāo)，以酶抑制率為縱坐標(biāo)，繪制曲線如圖5所示，顯示 6種成分對酪氨酸酶活性抑制的影響。槲皮素高濃度時對酪氨酸酶具有抑制作用(可能是其苯環(huán)上的間酚結(jié)構(gòu)起作用)，前人研究表明槲皮素以競爭性抑制形式抑制酪氨酸酶活性[26]，起到抑制作用的可能是其具有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)，能夠作為酪氨酸酶的底物與多巴競爭；槲皮素低濃度表現(xiàn)為激活作用，主要原因可能是槲皮素結(jié)構(gòu)(見圖1)中有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)(類似多巴)，可能作為酪氨酸酶底物被氧化，而使溶液475nm處的吸光度增加，從而表觀呈現(xiàn)出酶的激活作用。光甘草定的抑制作用較明顯，隨著濃度的增大，抑制作用逐漸增強(qiáng)，酶抑制IC50(酶抑制率達(dá)到50%時的濃度)為(0.90±0.02)μmol/mL，抑制作用主要是其苯環(huán)上的間酚結(jié)構(gòu)[27]。異甘草素以及刺芒柄花素表現(xiàn)出一定的激活作用，可能是因為具有酚羥基結(jié)構(gòu)(類似酪氨酸)[28]，是一種酪氨酸酶的底物，因此酪氨酸酶將其氧化后，形成的產(chǎn)物在475nm處有吸收，結(jié)果表現(xiàn)為激活酪氨酸酶活性。

圖4 3種待測成分的FRAP抗氧化能力 圖5 6種待測成分對酪氨酸酶活性的影響

3.6 分子對接結(jié)果

表1 最佳構(gòu)型的相關(guān)參數(shù)

圖6 酪氨酸酶與光甘草定的分子對接結(jié)果

分子對接是將已知3D結(jié)構(gòu)的配體分子逐一放在靶標(biāo)受體分子的活性位點(diǎn)處，通過不斷優(yōu)化受體化合物的位置、構(gòu)象、分子內(nèi)部可旋轉(zhuǎn)鍵的二面角和受體的氨基酸殘基側(cè)鏈和骨架，尋找受體小分子化合物與靶標(biāo)大分子作用的最佳構(gòu)象，并預(yù)測其結(jié)合模式、親和力和通過打分函數(shù)挑選出接近天然構(gòu)象的與受體親和力最佳的配體的一種理論模擬分子間作用的方法[29]。采用Autodock研究甘草提取物5種成分(配體)與酪氨酸酶(受體)的相互作用，得到配體與受體對接后的最佳構(gòu)象的結(jié)合能和氫鍵數(shù)量，見表1。由表1可知,光甘草定結(jié)合能最低，氫鍵數(shù)量較多，與酶結(jié)合能力最穩(wěn)定，故抑制能力較好，這與前面的酪氨酸酶抑制試驗結(jié)果一致，最佳構(gòu)象下光甘草定作用在酪氨酸酶活性位點(diǎn)附近(見圖6)；甘草次酸結(jié)合能較高，且結(jié)構(gòu)中氫鍵數(shù)量較少，說明甘草次酸與酪氨酸酶結(jié)合能力弱，沒有酪氨酸酶抑制作用，這也與酪氨酸酶抑制試驗結(jié)果一致。槲皮素、異甘草素和刺芒柄花素與酪氨酸酶結(jié)合能也較低，但在最佳構(gòu)象下，這幾種藥物與酪氨酸酶的結(jié)合位點(diǎn)偏離活性中心較遠(yuǎn)，因此對酶的活性影響不明顯(在此不予討論)。

由于光甘草定對酪氨酸酶的抑制能力強(qiáng)，因此用PyMoL軟件查看光甘草定與酪氨酸酶的相互作用，從分子水平闡述其抑制作用機(jī)制，結(jié)果如圖6所示。圖6(a)中灰色區(qū)域代表的是整個酪氨酸酶大分子，含有2個銅原子(Cu)的空腔為酪氨酸酶的活性中心，其中藍(lán)色區(qū)域為活性中心的6個組氨酸殘基配體(His)；紅色的棍狀結(jié)構(gòu)為光甘草定分子，并沒有占據(jù)活性中心，而是與部分組氨酸殘基和其他氨基酸殘基結(jié)合。為了更加清楚地看出光甘草定與酪氨酸酶的氫鍵作用，將活性中心和結(jié)合位點(diǎn)用球棍模型顯示，如圖6(b)所示，黃色虛線代表光甘草定與酪氨酸酶的氫鍵作用(6個)。這些結(jié)果說明，光甘草定主要是通過氫鍵作用影響酪氨酸酶活性中心及其附近的氨基酸殘基，從而影響了活性中心的構(gòu)型，進(jìn)而影響了底物與酪氨酸酶的結(jié)合，表現(xiàn)出非競爭性的抑制。

4 結(jié)論

1)3種抗氧化能力測試方法測定的結(jié)果一致，抗氧化能力最強(qiáng)的是槲皮素，其次是光甘草定，然后是異甘草素，抗氧化能力的大小與酚羥基的數(shù)量成正相關(guān)；甘草酸、甘草次酸和刺芒柄花素的測定結(jié)果過小，不能排除儀器等系統(tǒng)誤差的干擾，但其自由基清除能力作用不明顯。

2)酪氨酸酶活性抑制試驗結(jié)果表明，光甘草定具有較強(qiáng)的酪氨酸酶抑制作用，槲皮素低濃度時主要表現(xiàn)為酪氨酸酶的底物，而高濃度能夠?qū)野彼崦府a(chǎn)生抑制作用；異甘草素和刺芒柄花素因具有1個酚羥基，可能是一種酪氨酸酶底物，表現(xiàn)為激活作用；甘草酸和甘草次酸對酪氨酸酶活性沒有顯著影響。

3)分子對接結(jié)果進(jìn)一步表明光甘草定的結(jié)合能最低，與酪氨酸酶的親和力最強(qiáng)，能夠與酶活性中心附近的氨基酸殘基結(jié)合，從而影響活性中心的構(gòu)象，起到非競爭性抑制作用。

4)甘草提取物中的6種主要成分起到抗氧化和酪氨酸酶抑制作用的主要成分分別為槲皮素和光甘草定。