王麗君 朱書強(qiáng) 周佳

摘要 [目的]建立一種簡單、快捷測定調(diào)味油中工業(yè)染料羅丹明B的方法。[方法]樣品經(jīng)甲醇超聲提取，高速離心，上清液經(jīng)0.22 μm膜過濾后進(jìn)高效液相色譜C18柱分離，熒光檢測器檢測。[結(jié)果]羅丹明B在5～500 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（相關(guān)系數(shù)R2為0.999 9），檢出限為5 μg/kg，回收率為89.2%～93.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%（n=6）。[結(jié)論]該法操作簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于調(diào)味油中非法添加物羅丹明B含量的測定。

關(guān)鍵詞 羅丹明B;調(diào)味油;高效液相色譜;C18柱;熒光檢測

中圖分類號(hào) TS 207.5 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）12-0210-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.12.058

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract [Objective] The study established a simple and quick determination method of the industrial dye rhodamine B in flavoring oil. [Method] The sample was extracted with methanol ultrasonic and high speed centrifugation. The upper cleaning liquid was filtered by 0.22 μm membrane and then separated by high performance liquid chromatography C18 column， and the fluorescence detector was detected. [Result] The results showed that rhodamine B had good relationship between 5-500 ng/mL （correlation coefficient R2=0.999 9）， and the detection limit was 5 μg/kg， and the recovery rate was 89.2%-93.5%. The relative standard deviation was 1.7%（n=6）. [Conclusion] The method is simple， accurate and reproducible， and can be used for the determination of the content of illegally added rhodamine B in flavoring oil.

Key words Rhodamine B;Seasoning oil;HPLC;C18 column;Fluorescence detection

羅丹明B（Rhodamine B）又稱玫瑰紅B或堿性玫瑰精，俗稱花粉紅，是一種具有鮮桃紅色的人工合成染料，易溶于水、乙醇[1]。羅丹明B具有價(jià)格低廉、色澤紅艷、穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，常用作增加顏色的食品添加劑，但后來試驗(yàn)證明羅丹明B會(huì)致癌，已被禁止用作食品染色[2-5]。經(jīng)市場走訪調(diào)查，一些商販為了節(jié)約成本，低價(jià)收購一些劣質(zhì)的辣椒、花椒、芥末等原料加工成花椒油、辣椒油、芥末油，為了改變產(chǎn)品的賣相，往往添加羅丹明B來提高其紅艷度，以次充好欺騙消費(fèi)者。羅丹明B的檢測常用中性氧化鋁固相萃取小柱進(jìn)行前處理凈化，但要控制中性氧化鋁小柱的活性，操作步驟比較繁瑣，回收率也無法保證。當(dāng)前檢測食品中羅丹明B的方法只有SN2430—2010，該方法需要過凝膠固相色譜，前處理消耗有機(jī)溶劑量比較大，分析時(shí)間長，試驗(yàn)成本高，不能被廣泛應(yīng)用。筆者對(duì)調(diào)味油中的羅丹明B采用純甲醇提取，高效液相色譜分離，熒光檢測器檢測，方法簡便，特異性和回收率高，適合調(diào)味油的定量分析[6-12]。

1 材料與方法

1.1 材料

供試樣品為市售辣椒油、芥末油、花椒油等。試劑：甲醇，色譜純，純度>99.99%，賽默飛世爾科技有限公司;羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀配2475熒光檢測器，美國沃特世公司;湘儀1200型離心機(jī)，德國BECKMAN COULTER公司;電子天平，感量為0.1 g和0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器（中國）有限公司;YQ-1002C型超聲波清洗器，上海易凈超聲波儀器有限公司;MT/VORTEX型旋渦混勻器，上海五相儀器儀表有限公司;容量瓶：規(guī)格10、25 mL等，泰州市和順玻璃制品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理方法。稱取2.0 g樣品（精確至0.01 g）于25 mL容量瓶中，加入20 mL甲醇，超聲提取15 min后，用甲醇定容。高速離心5 min，取上清液過 0.22 μm 微孔濾膜后經(jīng)高效液相色譜分析。

1.3.2 色譜條件。色譜柱：C18柱4.6 mm×250 mm，5 μm;流動(dòng)相：甲醇+水（70∶30，V/V）;流速：1.0 mL/min;柱溫：35 ℃;進(jìn)樣量：10 μL;激發(fā)波長（Ex）550 nm，發(fā)射波長（Em）580 nm[13]。

1.3.3 羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取10.0 mg羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品至100 mL的容量瓶中，用甲醇配制成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，0～4 ℃避光保存。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：用甲醇稀釋成5.0、10.0、20.0、50.0、500.0 ng/mL備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取溶劑對(duì)樣品檢測的影響

文獻(xiàn)[14-20]報(bào)道，調(diào)味品大多采用乙酸乙酯和環(huán)己烷提取。筆者采取水、甲醇、乙腈、乙酸乙酯-環(huán)己烷（體積比1∶1）作為提取溶劑，在辣椒油中分別加入0.5、1.0、4.0 mL 50 ng/mL 的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.3.1”的方法進(jìn)行提取并測定其含量，計(jì)算回收率。由表1可知，當(dāng)采用甲醇作為提取溶劑時(shí)，回收率最高。因此，該試驗(yàn)采用甲醇作為提取溶劑。

2.2 流動(dòng)相及檢測波長的選擇

比較了水-甲醇及水和乙腈體系不同配比對(duì)羅丹明B測定的影響，結(jié)果表明，當(dāng)采用甲醇-水（30∶70，V/V）作為流動(dòng)相時(shí)，羅丹明B峰形尖銳，不拖尾（圖1），且流動(dòng)相配比簡單，方便快捷。根據(jù)《進(jìn)出口食品中羅丹明B的檢測方法》確定了羅丹明B的激發(fā)波長Ex=550 nm，發(fā)射波長Em=580 nm。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用上述優(yōu)化的色譜條件對(duì)羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行分析檢測，以羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，羅丹明B的線性回歸方程為y=32.467 x+0.096，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999 9，檢出限為5 μg/kg，RSD為1.7%。

羅丹明B在5～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。說明該方法線性范圍寬，適合不同濃度樣品的分析。按3倍的信噪比計(jì)算得出，該方法的檢出限為5.0 μg/kg。

2.4 精密度試驗(yàn)

取10 ng/mL 羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品，按上述優(yōu)化的方法平行測定6次，結(jié)果分別為9.73、9.68、9.66、9.98、9.80、9.77 ng/mL，RSD為1.7%。

羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品的RSD<3%，符合方法驗(yàn)證精密度要求。

2.5 回收率及重現(xiàn)性試驗(yàn)

將空白辣椒油、花椒油、芥末油按照上述的方法處理后，分別添加一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加濃度為0.2、0.5、2.0 mg/kg，每個(gè)樣同一濃度做6個(gè)平行樣，結(jié)果見表2～4。由表2～4可見，該方法具有較高的準(zhǔn)確度和可靠性。

2.6 實(shí)際樣品的測定

按照上述方法對(duì)在本地區(qū)購買的150批次的辣椒油、芥末油、花椒油進(jìn)行提取，并采用高效液相色譜-熒光法測定，均未發(fā)現(xiàn)陽性樣品。

3 結(jié)論

建立了一種快速、簡便的測定調(diào)味油中羅丹明B的方法。樣品經(jīng)純甲醇超聲提取后，高速渦旋、離心，有機(jī)膜過濾，用高效液相色譜C18柱分離，熒光檢測器檢測。實(shí)際測定結(jié)果表明，該方法前處理步驟簡單，提取率高，重現(xiàn)性好，適用于調(diào)味油中羅丹明B的定量分析。

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