劉 慧 朱延濤 王國軍#

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖州中醫(yī)院 浙江 湖州 313000 2 浙江省金華市中醫(yī)醫(yī)院 浙江 金華 321000

功能性消化不良（FD）是臨床上最為常見的一種消化性疾病，研究表明，半夏瀉心湯治療FD效果良好。本研究通過觀察半夏瀉心湯對FD大鼠胃腸激素水平，胃排空、小腸推進(jìn)監(jiān)測，及胃竇組織C-kit、降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）蛋白表達(dá)水平，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物和飼料：選擇體重約為（200±20）g成年SD大鼠60只，雌雄各半，SPF級，購于上海西普爾-必凱實(shí)驗動物有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2013-0016。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗研究中心，許可證：SYXK（浙）2016-0115。

1.2 主要試劑和設(shè)備：半夏瀉心湯（半夏、大棗各12g，黃芩、人參、干姜、炙甘草各10g，黃連5g）由金華市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科提供，上述藥物浸泡30min，煎煮2次，每次30min，紗布過濾，合并過濾液配制成1g/ml生藥的水煎液；嗎丁啉（多潘立酮片）：海南制藥廠有限公司制藥一廠，批號171101；硫酸阿托品注射液：天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司，批號：1706302；大鼠MOT、SP檢測試劑盒：武漢酶免生物科技有限公司，批號MM-0491R1、MM-0495R3；酶 標(biāo) 儀 ：ThermoScientific，型 號 ：CMax Plus；生化培養(yǎng)箱：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司，型號：LRH-150；熒光顯微鏡：Leica，型號：DM3000。

1.3 模型誘導(dǎo)：36只SD大鼠按體重隨機(jī)分成6組，分別為：正常對照組、模型組、半夏瀉心湯低、中、高劑量組、多潘立酮陽性組，每組6只。除正常對照組外，其余組按“不規(guī)則喂養(yǎng)法配合夾尾刺激法”造模14d，具體方法：正常飲水，單日喂食，雙日禁食；用長海綿鉗夾大鼠尾巴末端1/3處，以令其尖叫掙扎但不破皮為度，使它發(fā)怒并和其他大鼠廝打（若有抓傷，予碘伏消毒傷口，以防感染），每次刺激30min，每日刺激2次。

1.4 分組與給藥：正常對照組和模型組灌胃生理鹽水，半夏瀉心湯低劑量組（1g/kg）、中劑量組（2g/kg）、高劑量組（4g/kg）分別灌胃相應(yīng)的半夏瀉心湯煎劑，陽性組灌胃多潘立酮（0.01g/kg），每日1次，連續(xù)14d。

1.5 一般情況觀察：每天早晨9點(diǎn)觀察記錄各組大鼠狀態(tài)：豎毛、拱背、激惹反應(yīng)能力、排便、精神情況等。

1.6 血清胃動素（MOT）、P物質(zhì)（SP）含量檢測：末次給藥后，各組大鼠禁食（12h）不禁水，采用心臟取血方式，3000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上清液，采用酶聯(lián)免疫法（Elisa）檢測MOT、SP水平，具體操作嚴(yán)格按照Elisa試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 胃排空和小腸推進(jìn)率檢測：實(shí)驗第14d時禁食不禁水16h，末次給藥20min后，正常對照組注射等溶劑的生理鹽水，其余組均皮下注射硫酸阿托品注射液（2mg/kg）。20min后，灌胃半固體營養(yǎng)糊2g/只，20min后，脫頸椎處死，取出完整的胃，稱量完整的胃重量，把胃打開，將胃內(nèi)容物沖洗干凈，再用濾紙將胃粘膜表層的水分吸掉，稱量胃的凈重，逐一記錄并保留標(biāo)本。胃排空率=[灌胃量-（胃重-胃凈重）]/灌胃量×100%。將幽門至回盲部的小腸，平鋪于玻璃板上，測量葡聚糖藍(lán)2000在腸管內(nèi)的移動距離和小腸全長。小腸推進(jìn)率%=（葡聚糖藍(lán)2000前端與幽門的距離/小腸全長）×100%。

1.8 胃竇組織中C-kit、CGRP蛋白表達(dá)及分布情況：各組大鼠解剖后用生理鹽水清洗胃后迅速取1.0cm×1.0cm組織置于中性福爾馬林緩沖液中固定24h，石蠟包埋切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精至水，熱修復(fù)抗原，雙氧水室溫避光下孵育10min，5% BSA 25℃封閉20min，1:100Ⅰ抗4℃過夜，生物素化Ⅱ抗37℃ 20min，SABC 37℃ 20min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染1min，酒精脫水，二甲苯透明，中性膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察。標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)可見棕黃色顆粒為c-kit、CGRP陽性，并計算陽性面積值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS19.0軟件統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示。計量資料若方差齊，則采用LSD檢驗兩兩比較；若方差不齊，其差異性則采用H-G檢驗，P＜0.05表示差異有顯著性，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 半夏瀉心湯對FD大鼠一般情況的影響：造模前，各組大鼠的一般狀態(tài)比較穩(wěn)定；造模后，與正常對照組相比，造模組大鼠毛發(fā)由順澤逐漸轉(zhuǎn)為凌亂干結(jié)，活動慢慢減少，出現(xiàn)倦怠、乏力，情緒變得易怒低落，大便逐漸變軟、欠成形、甚至溏?。桓鹘o藥組FD大鼠精神狀態(tài)均有一定程度的恢復(fù)。

2.2 半夏瀉心湯對FD大鼠血清MOT、SP含量和胃排空率、小腸推進(jìn)率的影響：見表1。

2.3 半夏瀉心湯對FD大鼠胃竇組織C-kit和CGRP蛋白表達(dá)及分布的影響：光鏡下可見各組大鼠胃竇組織均有C-kit和CGRP陽性表達(dá)。見表2和圖1。

表1 半夏瀉心湯對FD大鼠血清MOT、SP含量的影響（±s，n=6）

表1 半夏瀉心湯對FD大鼠血清MOT、SP含量的影響（±s，n=6）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別正常對照組模型組多潘立酮組半夏瀉心湯低劑量組半夏瀉心湯中劑量組半夏瀉心湯高劑量組小腸推進(jìn)率66.16±1.94 43.60±8.51**60.37±6.19##55.72±6.55#57.29±9.52#67.61±4.28##SP（pg/ml）4.91±0.79 1.99±0.58**4.82±0.66##2.60±0.32#2.65±0.36#3.98±0.73##MOT（pg/ml）33.28±6.38 13.85±4.5**25.88±4.34##20.57±4.83#22.33±6.85#29.60±7.99##胃排空率70.69±9.89 48.55±7.51**64.33±9.52##61.63±7.21##64.00±6.79##70.48±6.21##

表2 半夏瀉心湯對FD大鼠胃竇組織中C-kit和CGRP表達(dá)的影響（±s，n=3）

表2 半夏瀉心湯對FD大鼠胃竇組織中C-kit和CGRP表達(dá)的影響（±s，n=3）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別正常對照組模型組多潘立酮組半夏瀉心湯低劑量組半夏瀉心湯中劑量組半夏瀉心湯高劑量組IOD（CGRP）7819.1±1173.9 49252.9±14158.3**14782.7±2694.4##32120.2±6702.1#26701.2±2874.5##17322.6±1648.2##Area（C-kit）326914.7±34759.0 64048.7±7684.6**209944.2±28227.3##83375.0±15760.7#86696.2±14256.7#191709.2±23542.3##IOD（C-kit）68948.2±7637.4 10705.4±1988.1**42432.5±6019.7##14814.2±3495.4#15383.8±3055.1#38718.1±5193.7##Area（CGRP）48931.8±5986.3 251774.8±70628.9**81071.5±11641.6##166839.3±32694.6#140187.2±13826.3##91762.8±9009.8##

圖1 半夏瀉心湯對FD大鼠胃竇組織中C-kit（左圖）和CGRP（右圖）表達(dá)的影響（×200）

3 討論

中醫(yī)學(xué)將FD歸于“痞滿”“胃脘痛”等范疇，病位在胃，與肝脾密切相關(guān)，胃失和降，腑氣不通，導(dǎo)致患者出現(xiàn)胃氣上逆、脾胃運(yùn)化、氣機(jī)不暢，久則痰濕內(nèi)停，痰阻氣逆等一系列臨床表現(xiàn)及體征。半夏瀉心湯中，半夏辛溫散痞，降逆止嘔；黃芩、黃連苦寒瀉熱，干姜辛熱散寒，降胃氣之逆；黨參、大棗健脾益氣；炙甘草調(diào)和諸藥。寒熱并用以和陰陽，辛苦同施以調(diào)升降，補(bǔ)瀉共進(jìn)以理虛實(shí)，使脾胃氣機(jī)升降歸于正常，對FD患者具有良好的效果。胃腸激素對胃腸功能具有調(diào)節(jié)作用，在維持正常消化功能中發(fā)揮重要作用。MOT和SP是其中重要的兩個指標(biāo)，均能促進(jìn)平滑肌收縮，加速胃排空。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)D大鼠血清MOT、SP含量顯著降低，胃排空率和小腸推進(jìn)率降低明顯。半夏瀉心湯干預(yù)后，MOT、SP含量顯著上調(diào)，且胃排空率和小腸推進(jìn)率均明顯提高，提示半夏瀉心湯對功能性消化不良具有顯著的干預(yù)和治療作用。C-kit蛋白是一種特異性跨膜糖蛋白，研究發(fā)現(xiàn)其在調(diào)節(jié)胃腸道節(jié)律穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用。此外，有報道FD患者胃粘膜CGRP濃度明顯高于健康對照組[1]，提示CGRP可能與胃機(jī)械感覺過敏密切相關(guān)。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)FD大鼠胃竇組織C-kit蛋白水平較正常組顯著降低，CGRP蛋白水平增加。半夏瀉心湯干預(yù)后，較模型組C-kit蛋白水平顯著增加，CGRP蛋白明顯降低，且有統(tǒng)計學(xué)差異?？梢?，半夏瀉心湯能促進(jìn)FD模型大鼠胃排空和小腸推進(jìn)率，這可能與上調(diào)血清MOT、SP水平，上調(diào)胃竇組織C-kit蛋白水平，下調(diào)CGRP蛋白表達(dá)水平有關(guān)。