江 硯 胡軼娟

1 浙江省杭州市第一人民醫(yī)院 浙江 杭州 310006 2 浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007

骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）是一群存在于骨髓中的非造血干細胞，具有多向分化的潛能，在適宜的條件下能分化為成骨、軟骨、脂肪、肌腱、肌肉、神經(jīng)元和骨髓基質(zhì)細胞等，同時具有支持造血[1]和免疫調(diào)節(jié)功能[2]。MSCs作為骨髓基質(zhì)細胞的前體細胞，是骨髓內(nèi)造血微環(huán)境的重要組成部分。

三黃三仙湯是由生黃芪、黃芩、黃精、仙鶴草、仙靈脾、仙茅為主方藥物組成。其在臨床用于再生障礙性貧血（AA）已取得一定療效。前期研究證明，三黃三仙湯能加速恢復Se-137輻射小鼠的骨髓造血功能，故推測三黃三仙湯對MSCs有一定的干預作用。本文介紹三黃三仙湯對AA模型小鼠MSCs的干預作用研究，探討其改善AA小鼠骨髓MSCs向成骨細胞分化的作用。

1 材料與方法

1.1 材料：分述如下。

1.1.1 實驗藥品：三黃三仙湯：生黃芪、黃精、仙鶴草各30g，黃芩20g，淫羊藿、雞血藤各15g，仙茅18g，女貞子、當歸、白芍、麥冬各12g，煎煮濃縮后，分別配制成濃度為5.15g生藥/ml、2.58g生藥/ml和1.29g生藥/ml的溶液（相當于人用劑量的16倍、8倍、4倍）。PBS緩沖液（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司），胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司），青霉素、鏈霉素溶液，DMEM低糖、高糖培養(yǎng)液，胰蛋白酶-EDTA溶液，MCDB-201培養(yǎng)基均購于gibco公司；茜素紅（天津市天新精細化工開發(fā)中心）；MSC成骨誘導分化試劑盒（Biological Industries）。

1.1.2 儀器：五分類血細胞分析儀（sysmex XT-1800I），流式細胞儀（Flow Cytometer），離心機(Beckman Allegra X-15R)，倒置顯微鏡（Nikon）。

1.1.3 實驗動物：BALB/C小鼠，作為受體；DBA/2小鼠，作為供體。小鼠試驗前在動物房環(huán)境中適應(yīng)3d。

1.2 方法：分述如下。

1.2.1 動物分組及給藥：實驗共分6組，每組n=10只，其中包括正常對照組、模型對照組、陽性對照組（環(huán)孢菌素25mg/kg·d、1mg/ml）、三黃三仙湯低劑量組（簡稱低劑量組，濃度1.29g生藥/ml）、三黃三仙湯中劑量組（簡稱中劑量組，濃度2.58g生藥/ml）、三黃三仙湯高劑量組（簡稱高劑量組，濃度5.15g生藥/ml）。參照文獻[3]，建立AA小鼠模型。灌胃給藥，每日1次，共14d。模型組和正常組，灌胃給生理鹽水25ml/kg·d。

1.2.2 外周血常規(guī)檢測：處死觀察滿14d的小鼠，眼眶取血，檢測外周血紅細胞（RBC）、白細胞（WBC）、血紅蛋白（Hb）、血小板（PLT）。

1.2.3 骨髓有核細胞(BMNC)計數(shù)：取右側(cè)股骨中段7mm，用培養(yǎng)液反復沖洗出骨髓細胞。按常規(guī)WBC計數(shù)法計數(shù)BMNC。

1.2.4 各組MSCs的培養(yǎng)、傳代及鑒定：用處死后的各組小鼠的脛骨、股骨，用含肝素的DMEM培養(yǎng)液沖出骨髓，2000r/min離心5min，取單核細胞層，加入含60%DMEM，40%MCDB-201，2%FBS，10ng/ml FGF，10ng/ml PDGF-BB，10ng/ml EGF的培養(yǎng)基，計數(shù)后接種（細胞濃度為2×106/L），1d后換液，棄去未貼壁細胞，之后每3d換液一次。待細胞長至約80%～90%融合時，進行消化、傳代。每日觀察細胞形態(tài)。取第三代MSCs，用流式細胞儀測定其免疫表型。

1.2.5 MSCs向成骨細胞分化培養(yǎng)：收集第三代MSCs，用MSCs成骨誘導分化試劑盒進行培養(yǎng)2周后，加入0.1%茜素紅染色，在顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)，并記錄鈣結(jié)節(jié)數(shù)。

1.2.6 統(tǒng)計學方法：試驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0處理，采用單因素方差分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較方差齊時采用LSD檢驗，若方差不齊則采用Dunnett’s T3檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血常規(guī)檢測：與正常對照組比較，造模后各組的RBC、Hb、WBC、PLT計數(shù)明顯降低（P＜0.05），表明造模后小鼠的造血功能受到損害，造模成功。給藥后，各劑量組和陽性藥組的RBC、Hb、WBC、PLT計數(shù)均有所回升，與模型組相比，中、高劑量組的RBC、WBC計數(shù)顯著升高（P＜0.05），低、中、高劑量組的PLT計數(shù)顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠外周血常規(guī)比較（±s）

表1 各組小鼠外周血常規(guī)比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，△P＜0.05。

組別正常對照組模型對照組陽性對照組低劑量組中劑量組高劑量組PLT（×109/L）636.00±47.86△166.59±38.56*553.27±70.84*△346.50±35.81*△351.39±42.83*△409.44±50.05*△例數(shù)10 10 10 10 10 10 RBC（×1012/L）7.49±0.79△4.42±0.68*5.71±0.82*△4.62±0.72*5.39±0.76*△5.69±0.82*△Hb（g/L）156.84± 9.10△114.89±10.53*120.15±12.30*117.57±13.37*117.99±12.66*131.88±20.83 WBC（×109/L）4.90±1.49 1.97±0.84*2.64±0.59*2.68±0.67*3.01±0.67*△3.42±0.68*△

2.2 對小鼠BMNC計數(shù)的影響：造模后，各組小鼠BMNC計數(shù)均較正常組顯著減少（P＜0.05）。給藥后，各組的BMNC計數(shù)均有所增加，與模型對照組相比，高劑量組的BMNC計數(shù)顯著增加（P＜0.05）。見表2。

表2 三黃三仙湯對小鼠BMNC計數(shù)的影響（±s）

表2 三黃三仙湯對小鼠BMNC計數(shù)的影響（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，△P＜0.05。

BMNC計數(shù)（×104）2.21±0.71△0.88±0.45*1.38±0.51*1.11±0.60*1.17±0.59*1.49±0.71*△組別正常對照組模型對照組陽性對照組低劑量組中劑量組高劑量組例數(shù)10 10 10 10 10 10

2.3 各實驗組MSCs的培養(yǎng)、傳代及鑒定：各實驗組小鼠的骨髓單個核細胞種入培養(yǎng)瓶培養(yǎng)7d后，倒置顯微鏡觀察。正?？瞻捉MMSCs大小均勻，呈長梭形，排列規(guī)則生長；模型對照組有較多的類圓形細胞，MSCs大小不一，性狀不規(guī)則，邊緣不整齊，且較正?？瞻捉M少而稀。各給藥組與模型對照組相比，細胞較規(guī)則，數(shù)量較多且密。傳代細胞形態(tài)較均一，以梭形為主，見圖1。各組小鼠的第三代MSCs細胞高表達CD29（78.7%～86.9%）和CD44（27.9%～36.9%），不表達造血細胞標志CD34（陰性表達），表明小鼠MSCs非小鼠骨髓中的造血細胞，見圖2。

圖1 倒置顯微鏡下各組第三代MSCs的形態(tài)（100×）

2.4 三黃三仙湯對骨髓MSC向成骨細胞的分化影響：與正常對照組相比，各組鈣結(jié)節(jié)數(shù)目明顯減少；給藥后，各組的鈣結(jié)節(jié)數(shù)有所增加，各劑量組相差不大。見圖3。表明三黃三仙湯能促進骨髓MSCs向成骨細胞分化。

圖2 第三代小鼠MSCs表面分子的表達流式細胞儀檢測（正常對照組）

圖3 各組小鼠MSCs成骨細胞培養(yǎng)鈣結(jié)節(jié)數(shù)（n=3）

3 討論

AA是骨髓造血組織減少及造血功能衰竭的一組綜合征。原發(fā)性AA目前病因不明；繼發(fā)性AA多由病毒感染、化學藥物（如氨基比林等）及電離輻射等引起。目前AA的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。AA仍然是醫(yī)療行業(yè)的一個“艱難的挑戰(zhàn)”[4-5]。中醫(yī)藥在治療AA方面起了很重要的作用。如周曄敏等[6]運用減障湯聯(lián)合西藥治療AA取得較好療效。本文采用的三黃三仙湯為我院中醫(yī)專家的自擬經(jīng)驗方，方中黃芪益氣補中，仙茅、淫羊藿補腎陽、強筋骨；黃精益氣養(yǎng)陰、滋補脾腎；女貞子、麥冬補腎養(yǎng)陰；當歸、雞血藤、白芍養(yǎng)血活血；黃芩、仙鶴草清熱涼血。全方具有益氣養(yǎng)陰、補腎生血之功效。

本研究發(fā)現(xiàn)，在AA小鼠造模后應(yīng)用三黃三仙湯進行干預，發(fā)現(xiàn)模型對照組及各治療組自第2天起開始出現(xiàn)皮毛稀疏、散亂，飲食減少，大便干結(jié)，喜倦臥，活動少，體重明顯下降，但是隨著治療時間的延長，各治療組的上述癥狀均有不同程度的恢復。治療后，三黃三仙湯組小鼠外周血的紅細胞、白細胞、血紅蛋白及血小板水平均明顯高于模型組小鼠，BMNC計數(shù)也明顯高于模型組。證實了三黃三仙湯能促進AA造血的恢復。

骨髓的正常造血依賴于造血干細胞與其微環(huán)境的相互作用，造血細胞的生長發(fā)育依賴造血微環(huán)境的結(jié)構(gòu)和功能的完整性。造血微環(huán)境是機體的造血干細胞賴以生存的場所。來源于間充質(zhì)干細胞的成骨細胞、血竇內(nèi)皮細胞和竇間網(wǎng)狀細胞，以及其細胞外基質(zhì)共同構(gòu)成造血微環(huán)境的主體。它們通過生成細胞因子、黏附因子和細胞表面受體，與造血干細胞相互作用，調(diào)節(jié)造血干細胞的增殖分化和遷移，以及成熟血細胞釋放[7]。因此，促進MSCs向成骨細胞轉(zhuǎn)化，有利于改善骨髓微環(huán)境，促進骨髓造血。研究表明，本方中的淫羊藿能促進MSCs向成骨細胞分化增殖，并能抑制MSCs向脂肪細胞轉(zhuǎn)化[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn)，造模后模型對照組的MSCs形態(tài)不規(guī)則，數(shù)量變少，向成骨細胞分化的能力減弱；治療后，三黃三仙湯各組的MSCs與模型對照組相比，細胞較規(guī)則，數(shù)量較多且密，且向成骨細胞轉(zhuǎn)化的能力增強，表明三黃三仙湯能改善AA小鼠骨髓微環(huán)境。

綜上所述，三黃三仙湯對免疫介導再生障礙性貧血模型小鼠的療效確切，能改善其骨髓造血微環(huán)境。此結(jié)果進一步完善了三黃三仙湯治療AA的作用機理。