范維江，唐佳佳，汪洋，賈旭妹

（山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品藥品學(xué)院，山東 濟(jì)南 250103）

銀杏葉茶是采用一定的工藝將銀杏葉制成的保健茶[1-2]。1994 年我國(guó)銀杏葉茶開(kāi)始興起，兩湖、江浙、山東等省份均生產(chǎn)銀杏葉茶[3]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全國(guó)范圍內(nèi)的銀杏葉茶加工廠大約有100 余家，其中山東省20 余家，所占比例最高，年產(chǎn)量最多的廠家不超過(guò)5 000 kg，最少的廠家僅500 kg[3]。銀杏葉茶廠雖不少，但因?yàn)椴蛔⒅劂y杏葉的特殊性，使得所制出來(lái)的茶葉外形不好看，香氣極淡，茶湯無(wú)色，滋味苦澀，有效成分損失嚴(yán)重，因此所制的茶葉適口性特別差。

銀杏葉中含有的水溶性化學(xué)成分大部分都對(duì)人體有較顯著的保健作用[4]，如果能時(shí)常飲用，能有效抗衰老和抗氧化，并且在治療和預(yù)防心腦血管疾病方面有一定的效果，譚志鑫的研究說(shuō)明銀杏葉茶具有保護(hù)缺血-再灌注損傷時(shí)心肌的收縮和舒張功能，從而有效地保護(hù)了心臟的舒縮活動(dòng)[5]。許秀舉等[6]通過(guò)測(cè)定實(shí)驗(yàn)小鼠胃組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），說(shuō)明銀杏茶對(duì)于酒精所引起的超氧化物歧化酶的損傷具有非常明顯的保護(hù)作用。

銀杏茶中的銀杏酚酸具有致敏性、致細(xì)胞毒性成分，讓廣大消費(fèi)者望而卻步[7]。未經(jīng)處理的銀杏葉中含有較高的銀杏酚酸[8]，銀杏酚酸具有獨(dú)特的藥理活性日益受到人們的廣泛關(guān)注[9]。但是銀杏酚酸對(duì)人體有毒副作用，會(huì)產(chǎn)生肌肉抽搐、瞳孔放大等癥狀[10]。有研究報(bào)道[11-13]，以利用超臨界CO2不僅可以選擇性地萃取出銀杏葉中的銀杏酚酸，而且對(duì)其中的有效成分黃酮和內(nèi)酯無(wú)影響，保持了銀杏葉茶良好的口感。廖賢軍等冷凍后發(fā)酵可降低銀杏葉中銀杏酚酸的含量，改善銀杏葉茶的口感和風(fēng)味[7]。

本研究以銀杏葉為研究對(duì)象，參照綠茶的加工工藝制備銀杏葉茶，制作過(guò)程中添加不同劑量的Ca（OH）2，以水浸出物含量、游離氨基酸含量、過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）活性、黃酮類化合物含量等主要功能成分以及感官評(píng)價(jià)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究Ca（OH）2的投入量對(duì)銀杏葉茶中銀杏葉酚酸的影響情況。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)原料

銀杏葉，葉長(zhǎng)約為5 cm～9 cm，淡黃色，無(wú)蟲(chóng)壞，采摘于山東商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院校園。

1.1.2 主要試劑

甲醇：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氯化亞錫、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉（均為分析純）：天津市廣成化學(xué)試劑有限公司；茚三酮、氫氧化鈣、95%乙醇（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；植物型POD試劑盒：南京建成生物工程研究所；銀杏酸C15∶1：中國(guó)藥品生物制品鑒檢定所。

1.1.3 主要儀器

UV754N 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；SHK-III 循環(huán)水式多用真空泵：鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ME204E/02 型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DZKW 電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；BGZ-30 電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；UPLC I-Class 高效液相色譜儀：美國(guó)waters 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

工藝流程：原料處理→萎凋→漂燙殺青→揉捻→干燥→分揀包裝。

1.2.1 樣品的制備

處理鮮葉時(shí)，應(yīng)先將病蟲(chóng)葉、雜質(zhì)等剔除，然后剪去葉柄。銀杏葉清洗2 次～3 次，瀝干水分，均勻攤在桌上晾曬，使葉子完全枯萎，再進(jìn)行殺青、揉捻。

取萎凋處理好的銀杏葉50 g，分別添加0.32、0.4、0.48 g 的 Ca（OH）2，在設(shè)置溫度為 90 ℃的水浴鍋里殺青4 min，取出后清洗3 次以除去葉面上的Ca（OH）2殘留。然后攤涼，揉捻，干燥。攤晾入袋后分別貼上標(biāo)簽 D1，D2，D3。

1.2.2 銀杏葉茶的感官評(píng)價(jià)

取成茶3 g，分別用150 mL 的沸水沖泡5 min，將編號(hào)遮擋，請(qǐng)10 位同學(xué)品評(píng)后，對(duì)茶的外形、湯色、香氣、滋味進(jìn)行打分，每項(xiàng)滿分為10 分，然后使用加權(quán)法計(jì)算總分（總分=外形×0.1+湯色×0.3+香氣×0.3+滋味×0.3），最后取平均值。銀杏葉茶成茶感官評(píng)定細(xì)則見(jiàn)表1。

表1 銀杏葉茶成茶感官評(píng)定細(xì)則Table 1 Rules for sensory evaluation of ginkgo leaf tea

1.2.3 水浸出物含量的測(cè)定

將瓷坩堝連同15 cm 的定性快速濾紙置于（120±2）℃的恒溫干燥箱中烘干1 h，干燥器中冷卻至25 ℃，直至恒重（前后兩次稱重之差小于0.2 mg）。稱量2.000 g 磨碎試樣，加沸蒸餾水300 mL，沸水浴中浸提45 min（每10 min 搖動(dòng)一次），浸提完畢后趁熱減壓過(guò)濾，用約150 mL 的沸蒸餾水洗滌茶渣數(shù)次。茶渣和濾紙移入坩堝置于120 ℃烘干1 h。取出后，冷卻1 h 后再烘干，冷卻至室溫后稱重，直至恒重后，可求得水浸出物含量[14]。

式中：m1為干燥后茶渣質(zhì)量，g；m0為試樣質(zhì)量，g；w 為試樣干物質(zhì)含量，%。

1.2.4 游離氨基酸含量的測(cè)定

稱取2 g 茚三酮、80 mg 氯化亞錫溶于50 mL 蒸餾水中，分次加少量水溶解，于暗處?kù)o置24 h，過(guò)濾后定容至100 mL 待用。在比色管中加入0.5 mL，pH8.0 的磷酸緩沖液，0.5 mL 茚三酮和1 mL 試樣，沸水浴5 min，冷卻后定容至25 mL，放置10 min 后，用3 mm 的玻璃比色皿于570 nm 處測(cè)定吸光度，用試樣空白溶液作為參比[15]。

式中：C 為所測(cè)得的吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的谷氨酸的毫克數(shù)，mg；V1為試液總量，mL；V2表示測(cè)定用試液量，mL；m 為試樣用量，g；w 為試樣干物質(zhì)含量，g。

1.2.5 POD 酶活性的測(cè)定

采用過(guò)氧化物酶（POD）試劑盒測(cè)定銀杏葉茶中的POD 酶活性。其測(cè)定原理是利用過(guò)氧化物酶（POD）催化過(guò)氧化氫反應(yīng)的原理，通過(guò)測(cè)定420 nm 處吸光度的變化得出其活性。

稱取銀杏葉茶1.0 g 放入研缽中，加入勻漿介質(zhì)9 mL（0.1 mol/L pH 7.0～7.4 的磷酸鹽緩沖液），冰水浴條件下制備成10%的組織勻漿液，然后轉(zhuǎn)入15 mL 離心管中，使用離心機(jī)3 500 r/min 離心10 min，取上清液。具體操作見(jiàn)表2。

表2 POD 酶活性測(cè)定操作表Table 2 Operation table for determination of POD enzyme activity

混勻后，再使用離心機(jī)3 500 r/min 離心10 min，取上清液于波長(zhǎng)420 nm 處，1 cm 光徑，調(diào)零后測(cè)定各吸光度。

1.2.6 黃酮類化合物和銀杏葉酚酸的測(cè)定

取10 mg 銀杏酸標(biāo)準(zhǔn)品用色譜純甲醇溶解定容至100 mL，得濃度為 100 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液[16]。

稱取5.0 g 樣品，粉碎后溶于50%的乙醇，然后在80 ℃條件下水浴5 h，水浴過(guò)程中需要不停攪拌[17]。將水浴后的樣液抽濾后濾渣用50%的乙醇再提取1 h，重復(fù)兩次。將3 次抽濾所得的提取液混合后旋轉(zhuǎn)蒸干至3 mL～5 mL，真空冷凍干燥機(jī)凍干，備用。取0.2g 凍干樣品，加入 10 mL 甲醇，渦旋 1 min，超聲 5 min 后，取100 μL 加入 900 μL 甲醇水稀釋，用 0.22 μm 濾膜過(guò)濾，取0.5 mL 濾液加入0.5 mL 1%甲醇水[18]。使用高效液相色譜儀測(cè)定銀杏葉茶中銀杏酸和蘆丁含量[19-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同Ca（OH）2投入量對(duì)銀杏葉茶的感官影響

不同Ca（OH）2投入量時(shí)銀杏葉茶的感官評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同Ca（OH）2 投入量時(shí)銀杏葉茶的感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 3 Sensory evaluation of different addition of Ca（OH）2 in Ginkgo biloba leaf tea

由表3可知，漂燙殺青時(shí)Ca（OH）2投入量不同對(duì)銀杏葉茶的顏色、質(zhì)地、氣味均有影響。當(dāng)Ca（OH）2的投入量為0.32 g 時(shí)，成茶的質(zhì)地、氣味效果較差，而當(dāng)Ca（OH）2投入量為 0.4 g 時(shí)，成茶的顏色、質(zhì)地、氣味均是最佳，銀杏葉成茶的感官評(píng)價(jià)分值最高。

2.2 對(duì)水浸出物含量的影響

浸出物含量的高低反映了茶葉中可溶性物質(zhì)的多少，標(biāo)志著茶湯的厚薄、滋味的濃強(qiáng)程度，從而在一定程度上還反映茶葉品質(zhì)的優(yōu)劣。不同Ca（OH）2投入量對(duì)銀杏葉茶水浸出物含量的影響如圖1所示。

圖1 Ca（OH）2 投入量變化對(duì)水浸出物含量的影響Fig.1 Effect of different levels of Ca（OH）2 for the content of water extract

當(dāng)Ca（OH）2的投入量增加時(shí)，銀杏葉茶的水浸出物含量也相應(yīng)增加，說(shuō)明Ca（OH）2投入量增加引起水浸出物含量的增加，并呈一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系。當(dāng)Ca（OH）2投入量為0.48 g 時(shí)，水浸出物含量值最高。

2.3 對(duì)游離氨基酸含量的影響

茶葉中氨基酸的組成、含量以及組分間的含量變化直接影響到茶葉的香氣和滋味，對(duì)銀杏葉成茶的品質(zhì)具有重要作用。不同Ca（OH）2投入量對(duì)銀杏葉茶游離氨基酸的影響如圖2所示。

圖2 Ca（OH）2 投入量變化對(duì)銀杏葉茶游離氨基酸的影響Fig.2 Effect of different levels of Ca（OH）2 for free amino acids in ginkgo leaf tea

Ca（OH）2投入量與銀杏葉成茶的游離氨基酸含量成反向關(guān)系，并呈一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系。加入的Ca（OH）2質(zhì)量增加時(shí)，銀杏葉茶游離氨基酸含量就相應(yīng)降低。當(dāng)加入的 Ca（OH）2含量為 0.4 g 及 0.48 g 時(shí)，二者游離氨基酸含量差別不大。

2.4 對(duì)POD酶活性的影響

制茶工藝的高溫破壞鮮葉中過(guò)氧化物酶的活性，抑制多酚類物質(zhì)的氧化，直接影響風(fēng)味的形成。不同Ca（OH）2投入量對(duì)銀杏葉茶POD 酶活性的影響如圖3所示。

圖3 Ca（OH）2 投入量變化對(duì)銀杏葉茶POD 酶活性的影響Fig.3 Effect of different addition amounts of Ca（OH）2 for POD activity in ginkgo leaf tea

當(dāng)Ca（OH）2的投入量為0.32 g 時(shí)，銀杏葉茶的POD 酶活性最高，即銀杏葉茶POD 酶的活性較另兩種條件而言，沒(méi)有被明顯抑制，對(duì)銀杏葉茶的香氣滋味有不利的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，Ca（OH）2投入量的增加可以降低銀杏葉茶的POD 酶活性。

2.5 對(duì)黃酮類化合物的影響

圖4為銀杏酸及蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的色譜分析結(jié)果。

D1的色譜分析圖見(jiàn)圖5。

圖4 銀杏酸及蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的色譜分析圖Fig.4 Chromatographic assayof ginkgolic acid and rutin trihydrate standard

圖5 D1 的色譜分析圖Fig.5 D1 Chromatographic analysis

制茶過(guò)程中，添加 0.32 g Ca（OH）2時(shí)，蘆丁含量為0.003 mg/mL，銀杏酸未檢出。

D2的色譜分析圖見(jiàn)圖6。

當(dāng) Ca（OH）2的投入量為 0.40 g 時(shí)，蘆丁含量為0.001 mg/mL，銀杏酸含量為0.002 mg/mL。

D3的色譜分析見(jiàn)圖7。

圖6 D2 的色譜分析圖Fig.6 D2 Chromatographic analysis

圖7 D3 的色譜分析圖Fig.7 D3 Chromatographic analysis

當(dāng) Ca（OH）2的投入量為 0.40 g 時(shí)，蘆丁含量小于0.001 mg/mL，銀杏酚酸未檢出。

綜上試驗(yàn)結(jié)果表明，在制茶過(guò)程中加入Ca（OH）2后，銀杏葉茶的蘆丁含量結(jié)果相差不大，其含量范圍在 0.001 mg/mL～0.006 mg/mL 之間。而加入 Ca（OH）2后，銀杏葉茶中銀杏酸含量均≤0.006 mg/mL，小于規(guī)定限量，可能是銀杏葉酚酸與Ca（OH）2生成了對(duì)人體有益的銀杏葉酚酸鈣。

3 結(jié)論

本研究在制作銀杏葉茶過(guò)程中，加入Ca（OH）2對(duì)銀杏葉茶的滋味、香氣、湯色、外形均有影響，加入Ca（OH）2所制得的成茶感官評(píng)價(jià)的分值比未加Ca（OH）2的分值高，當(dāng)加入的Ca（OH）2含量為0.4 g 時(shí)，銀杏葉成茶的感官評(píng)價(jià)分值最高；但是加入Ca（OH）2對(duì)銀杏葉茶的蘆丁含量影響不大，其含量范圍在0.001～0.006 之間；與此同時(shí)，加入Ca（OH）2的銀杏葉茶中銀杏葉酚酸均為未檢出，我們推測(cè)銀杏葉酚酸與Ca（OH）2發(fā)生反應(yīng)生成了對(duì)人體有益的銀杏葉酚酸鈣，這也是加入Ca（OH）2所制得成茶感官評(píng)價(jià)較高的原因之一，這一結(jié)果有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。