單蕊，高妍，杜蘭威，張弘

（天津市食品研究所有限公司，天津 301609）

色素按其來源分為天然色素和食用合成色素。合成色素[1]是人工合成的色素，其優(yōu)點(diǎn)不少，如色澤鮮艷，著色力強(qiáng)，色調(diào)多樣，但它有一個(gè)大缺點(diǎn)，具有毒性（包括毒性、致瀉性和致癌性）。

目前國標(biāo)測(cè)定色素的方法主要是GB 5009.35-2016《食品國家安全標(biāo)準(zhǔn)食品中合成著色劑的測(cè)定》[2]和SN/T 1743-2006《食品中的誘惑紅、酸性紅、亮藍(lán)、日落黃的含量檢測(cè)高效液相色譜法》[3]，兩個(gè)方法均采用聚酰胺粉吸附法，但是聚酰胺粉吸附法，操作過程繁瑣、耗費(fèi)時(shí)間長，不利于批量檢測(cè)[4]。本試驗(yàn)在創(chuàng)建同時(shí)檢測(cè)食品中常見9 種色素的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，提高日常檢測(cè)工作效率，對(duì)國家監(jiān)管合成色素批量檢測(cè)有著重要意義[5]。高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）是現(xiàn)在檢測(cè)合成著色劑最常用的檢測(cè)方法。由于食品種類繁多，基質(zhì)種類多、成分復(fù)雜同時(shí)多種著色劑同時(shí)添加，使得同時(shí)快速檢測(cè)多種合成著色劑變得尤為重要[6]。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器

UltiMate 3000 高效液相色譜儀（配備VWD3100紫外檢測(cè)器）、LP Vorter Mixer 旋渦振蕩器、thermo Hypersil GOLD C18 液相色譜柱（5 μm×4.6 mm×250 mm）：賽默飛世爾科技有限公司；AB265-S 電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；TGL-16M 型離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SCI-NT2800D 型超聲波清洗儀：天津市圣信唯儀器有限公司；Milli-Q 超純水機(jī)：美國密理博公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；CNWPoly-sery 150 mg/6 mL 固相萃取柱：上海安譜實(shí)驗(yàn)技術(shù)股份有限公司SPE 固相萃取柱150 mg/6 mL：博納艾杰爾。

1.2 試劑

甲醇（色譜級(jí)）、氨水（分析純）：德國默克公司；甲酸（分析純）：天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；乙酸銨溶液（色譜級(jí)）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán)、赤蘚紅、誘惑紅、0.5 mg/mL 8 色素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（CDHWBW0724-1，4 ℃冰箱保存）；1.0 mg/mL 靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液（CDHW-BW0726-1，4 ℃冰箱保存）：中國計(jì)量科學(xué)研究院。

標(biāo)準(zhǔn)使用液的配置：分別取1.0 mL 8 種色素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和靛藍(lán)標(biāo)液0.5 mL 混合，用純水稀釋10 倍，配置成 50 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng) 0.22 μm 微孔濾膜過濾（4 ℃冰箱保存）。

1.4 樣品處理

1.4.1 液體樣品

稱取1 g 試樣于50 mL 離心管中，加入6 mL 去離子水，漩渦 30 s，超聲振蕩 15 min 提取，4 000 r/min 離心6 min，取上清液，殘?jiān)偌尤? mL 去離子水，重復(fù)操作1 次，合并兩次上清液。用檸檬酸溶液（稱取20 g檸檬酸，加水至100 mL，溶解混勻）調(diào)節(jié)pH 值至3～4（普通基質(zhì)約需要250 μL，強(qiáng)酸強(qiáng)堿不參考此值）待固相萃取柱凈化。

1.4.2 固體樣品

稱取1 g 試樣于50 mL 離心管中，加入氨水∶70%甲醇溶液（甲醇和水體積比 70∶30）=（體積比 1∶99）10 mL 作為提取劑提取，漩渦15 s，超聲提取15 min，4 000 r/min 離心6 min，再加入10 mL 提取液，重復(fù)提取2 次，合并上清液離心，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約5 mL。用檸檬酸溶液（稱取20 g 檸檬酸，加水至100 mL，溶解混勻）調(diào)節(jié)pH 值至3～4，待固相萃取柱凈化。

1.4.3 凈化

上樣：全部待凈化液過柱，流速不能超過1 滴/s；淋洗用 5mL 甲醇∶甲酸∶水（體積比 4∶2∶4）；洗脫：10 %氨水甲醇3mL，重復(fù)1 次。氮吹近干，約200 μL左右，50%流動(dòng)相A+50%流動(dòng)相B 定容至1.0 mL，漩渦。過 0.45 μm 親水性聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）濾膜過濾，待上機(jī)。避免用純水定容，導(dǎo)致赤蘚紅不能完全溶解導(dǎo)致回收率降低。同時(shí)避免用尼龍過濾器，吸附色素。

1.5 色譜條件

色譜柱：thermoHypersilGOLD（金柱）C18 柱（5μm×4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：甲醇（A）+乙酸銨（B）0.02 mol/L 梯度洗脫；流速：1.0 mL/min ；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10.0 μL；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；波長：254 nm。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

試驗(yàn)采用的色譜柱thermo Hypersil GOLD（金柱）C18 柱（5 μm×4.6 mm×250 mm），對(duì) 9 種合成色素都具有較好的分離效果，分別采用甲醇-0.01 mol/L 乙酸銨和甲醇-0.02 mol/L 乙酸銨對(duì)樣品進(jìn)行梯度洗脫。混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖1。

結(jié)果表明：甲醇-0.02mol/L 乙酸銨靈敏度高且分離效果更好。C18 色譜柱thermo Hypersil GOLD （金柱）（5 μm×4.6 mm×250 mm）較普通 C18 柱具有更高的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，能夠更好的分離檸檬黃和新紅，使用普通C18 柱經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)檸檬黃和新紅不分離的現(xiàn)象。集國際先進(jìn)的高純硅膠技術(shù)、鍵合技術(shù)和烷基鍵合相的封尾技術(shù)于一身，thermo Hypersil GOLD C18色譜柱成為新一代高柱效硅膠基質(zhì)色譜柱的代表，色譜柱適應(yīng)pH 值的范圍寬，在酸性條件和堿性條件下仍具有很長的壽命。在較高的鹽濃度的條件下仍不會(huì)影響其使用壽命。采用甲醇-0.02 mol/L 乙酸銨進(jìn)行梯度洗脫，在21 min 內(nèi)均有良好的靈敏度和分離度。

圖1 9 種合成色素混合標(biāo)液色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution for 9 synthetic pigments

2.2 固相萃取柱的選擇

固相萃取[7]技術(shù)是目前常用的一種提取手段，能夠更為有效的提取目標(biāo)物，棄去雜質(zhì)干擾進(jìn)行分離，在檢測(cè)領(lǐng)域使用廣泛。國標(biāo)中常采用聚酰胺粉吸附法凈化，該方法前處理過程復(fù)雜，對(duì)pH 值要求嚴(yán)格，淋洗時(shí)，赤蘚紅損失較大，回收率低。故采用常用的兩種固相萃取柱進(jìn)行比較，分別是柱Oasis WAP HLB 為弱陰離子交換柱和CNW Poly-sery 為混合型弱陰離子交換柱，CNW Poly-sery 與傳統(tǒng)的硅膠基質(zhì)的小柱不同，PWAX 是改性的苯乙烯-二乙烯苯共聚物，其聚合物表面有親水性和疏水性基團(tuán)，pH 值在1～14 的范圍內(nèi)都非常穩(wěn)定，并具有良好的水浸潤性。

2.3 赤蘚紅凈化方法改進(jìn)

赤蘚紅為苯甲酸鈉結(jié)構(gòu)相對(duì)其他苯磺酸鈉結(jié)構(gòu)的合成著色劑，在CNWPoly-sery 固相萃取柱上的保留相對(duì)較弱，故要對(duì)凈化方法進(jìn)行優(yōu)化，如按照1.4.3的方法淋洗，赤蘚紅不能全部被洗脫下來，通過方法優(yōu)化最終的淋洗方法為6 mL 水（pH=6）、6 mL 甲醇選用CNWPoly-sery 固相萃取柱，其他條件不變。

2.4 線性范圍及檢出限

按照 1.3 配置濃度為 1.0、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/mL的9 種色素混合標(biāo)液，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)得到線性方程、回歸方程、線性范圍及檢出限。9 種色素濃度與峰面積呈良好線性，可進(jìn)行準(zhǔn)確定量。以3 倍噪音極限確定檢出限，結(jié)果為0.05 μg/mL。9 種合成色素的檢出限、回歸方程和線性范圍見表2。

表2 9 種色素檢出限及線性范圍Table 2 Detection limits and linear ranges of 9 pigments

2.5 準(zhǔn)確度及回收率試驗(yàn)

采用已知濃度樣品加標(biāo)方法計(jì)算回收率的方法，取紅酒樣品和固體基質(zhì)，按照1.4.1 處理后進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算9 種合成色素的精密度及回收率，測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 9 種色素不同濃度加標(biāo)回收率和精密度Table 3 Standard recovery and precision of 9 pigments at different concentrations

該方法測(cè)定不同加標(biāo)濃度下的回收率為92.0%～97.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.05%～2.52。實(shí)際檢驗(yàn)結(jié)果證明，各組分濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

對(duì)市場(chǎng)上的商品（糖果、果汁[8]、肉制品、葡萄酒[9]、固體飲料）進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果Table 4 Results of actual sample determination

所測(cè)定的結(jié)果均符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[10]中所規(guī)定限量標(biāo)準(zhǔn)要求。糖果樣品色譜圖見圖2，果汁樣品色譜圖見圖3，固體飲料色譜圖見圖4。

通過對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)，運(yùn)用文中1.4 的樣品處理方法，能夠更快更全面提取食品中的色素，方法簡(jiǎn)便、縮短了檢測(cè)周期，在實(shí)際樣品檢測(cè)中取得了良好的效果。

圖2 糖果樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of candy samples

圖3 果汁樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of juice samples

圖4 固體飲料色譜圖Fig.4 Chromatogram of solid beverage

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了固相萃取-高壓液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中9 種合成色素的方法。該方法通過對(duì)樣品前處理方法的優(yōu)化、固相萃取柱的選擇和色譜柱的選擇，確定最優(yōu)的色譜條件。所優(yōu)化的液相色譜條件可同時(shí)測(cè)定9 種食品中色素，各種合成色素得到有效的分離。通過實(shí)際樣品檢測(cè)，得到了較好的試驗(yàn)效果。能夠滿足在日常工作檢測(cè)要求，提高了檢測(cè)效率，改善了傳統(tǒng)檢測(cè)，避免檢測(cè)色素較少的會(huì)有遺漏的情況。