黃 芬，王 波，盧彥達(dá)，曾江正，桑圣剛

（1.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，海南 ?？?570102； 2.海南省人民醫(yī)院，海南 ?？?570102）

川芎主要成分為川芎嗪，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛功效，臨床多用于治療瘀血阻滯的各種病癥，稱為“血中氣藥”[1]。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷（CIK）細(xì)胞是新型免疫活性細(xì)胞，增殖能力強，細(xì)胞毒作用強，具有一定的免疫特性，擬用于心血管、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)疾病的治療[2-3]。本研究中分析了川芎嗪聯(lián)合CIK細(xì)胞對裸鼠肝癌HepG2細(xì)胞的影響。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、細(xì)胞、儀器與試藥

動物：裸鼠 46 只，雄性，（5.5±0.67）周齡，體質(zhì)量175～225 g，由南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）2004-0009。在無特殊病原菌條件下分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，適宜溫度、濕度，人工黑暗和光照交替。

細(xì)胞：HepG2細(xì)胞（上海紀(jì)寧實業(yè)有限公司）；PB003F-C單個核細(xì)胞（美國Allcells公司）。

儀器：HN-25S型CO2恒溫培養(yǎng)箱（青島聚創(chuàng)世紀(jì)環(huán)保科技有限公司）；IN Cell Analyzer 2500HS型高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)（美國 Molecular Devices公司）；xCELLigence RTCA SP型實時無標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀（美國 ACEA Biosciences公司）；LWD300-38LT型倒置生物顯微鏡（西安測維光電技術(shù)有限公司）。

試藥：鹽酸川芎嗪氯化鈉注射液（湖南康都制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20041437，規(guī)格為每100 mL含鹽酸川芎嗪40 mg）；細(xì)胞遷移分析試劑盒（美國Biovision公司，貨號為K906-100）；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶及胎牛血清（美國Gibco公司）；4%多聚甲醛（美國Sigma公司）；注射用氨西林鈉（湖南科倫制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H43022217，規(guī)格為每支1.0g）；其余試劑均為分析純。

1.2 方法

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)：將HepG2細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，壁貼，放置2～3 d。

CIK細(xì)胞培養(yǎng)：用完全培養(yǎng)液（100 mL／L胎牛血清，50 mg／L 注射用氨西林鈉，10 mmol／L Hepes緩沖液，50 μmol／L 2-疏基乙醇）將外周血單個核細(xì)胞（PBMC）密度調(diào)至 1.5 ×109／L，在 CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，即得CIK細(xì)胞。

模型建立及分組、給藥：取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞進(jìn)行試驗。將HepG2細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后接種于裸鼠皮下，其消化過程為將無血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并接種于事先預(yù)備的孔板上，再將培養(yǎng)板置其上作用30 min后注入裸鼠皮下。建模成功后，按隨機數(shù)字表法分為川芎嗪50 mg／L聯(lián)合CIK細(xì)胞組（A組）、川芎嗪100 mg／L聯(lián)合CIK細(xì)胞組（B組）和川芎嗪200 mg／L聯(lián)合CIK細(xì)胞組（C組），各12只，灌胃給藥3次，間隔8 h；經(jīng)尾靜脈一次性輸注1.5×107個CIK細(xì)胞。另將10只建模成功裸鼠設(shè)為模型組（D組）。

1.3 觀察指標(biāo)

細(xì)胞侵襲和遷移能力：采用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度后再次加入細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，重復(fù)2次，加4%多聚甲醛固定15 min，染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況，并計算遷移抑制率。細(xì)胞遷移抑制率=（D組遷移或侵襲細(xì)胞數(shù)-用藥組遷移或侵襲細(xì)胞數(shù)）／D組遷移或侵襲細(xì)胞數(shù)×100%。

基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2（TIMP-2）蛋白水平：采用流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長為488 nm，采用Expo 32 ADC系統(tǒng)分析免疫熒光數(shù)據(jù)，結(jié)果均取平均值[4]。

細(xì)胞骨架蛋白-肌動蛋白微絲：采用IN Cell Analyzer 2500HS高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)檢測，取消毒后的鈦板，置一次性培養(yǎng)皿中，接種細(xì)胞懸液8 mL，培養(yǎng)后轉(zhuǎn)至一次性培養(yǎng)皿中用PBS清洗，清洗2次后采用封閉液封閉60 min后染色，采用顯微鏡觀察，采用Leica TCS軟件測量視野中細(xì)胞的鋪展面積。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。計量資料以表示，行t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，行 χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞侵襲和遷移能力

與D組比較，B組和C組遷移和侵襲細(xì)胞顯著減少，抑制率顯著升高（P＜0.05）。詳見表 1。隨著時間的增加，A組、B組和C組細(xì)胞遷移數(shù)均明顯低于D組，且C組＜B組＜A組，遷移率與時間及劑量呈正相關(guān)。詳見圖 1 和表 2。

表1 各組細(xì)胞侵襲和遷移能力比較（±s）

表1 各組細(xì)胞侵襲和遷移能力比較（±s）

注：與D組比較，#P＜0.05。下表同。

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表2 各組細(xì)胞侵襲情況比較（ ± s，個／視野）

表2 各組細(xì)胞侵襲情況比較（ ± s，個／視野）

組別A組B組C組D組質(zhì)量濃度（mg／L）50 100 200 24 h 0.47±0.11 0.44±0.09 0.45±0.13 0.36±0.13 48 h 1.69±0.15#1.69±0.14#1.71±0.16#1.24±0.16 72 h 2.39±0.19#2.41±0.20#2.40±0.21#1.51±0.20

2.2 MMP-2和TIMP-2蛋白表達(dá)水平

與D組比較，A組、B組、C組細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)顯著降低，TIMP-2蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。詳見表 3。

2.3 細(xì)胞骨架蛋白-肌動蛋白微絲

與D組比較，A組、B組、C組細(xì)胞骨架蛋白-肌動蛋白微絲面積顯著縮?。≒＜0.05）。詳見表 3。

3 討論

侵襲與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤發(fā)展過程中的危險階段，一旦出現(xiàn)將對預(yù)后造成嚴(yán)重影響[5]。細(xì)胞黏附性喪失及細(xì)胞骨架重建均會導(dǎo)致細(xì)胞運動和遷移[6-7]。川芎為無色針狀結(jié)晶，對心臟、血管（尤其是冠狀動脈）及腦部等部位病變有一定改善作用[8]。川芎嗪能抑制乳腺癌、肺癌細(xì)胞的體外增殖，作用機制為抑制腫瘤新生血管形成、抑制腫瘤細(xì)胞繁殖及逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性等[9]。CIK細(xì)胞是影響腫瘤的歸巢能力及異常腫瘤微環(huán)境的重要因素[10]。

表3 各組細(xì)胞MMP-2蛋白和TIMP-2蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞骨架蛋白-肌動蛋白微絲面積比較（±s）

表3 各組細(xì)胞MMP-2蛋白和TIMP-2蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞骨架蛋白-肌動蛋白微絲面積比較（±s）

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本研究結(jié)果顯示，隨川芎嗪質(zhì)量濃度的增加，HepG2細(xì)胞侵襲和遷移能力逐漸降低，且川芎嗪聯(lián)合CIK細(xì)胞作用72 h后抑制細(xì)胞侵襲能力明顯強于24 h后，說明川芎嗪可抑制HepG2細(xì)胞的遷移及侵襲，進(jìn)而具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。A組、B組、C組的MMP-2蛋白表達(dá)水平均明顯低于D組，但TIMP-2蛋白表達(dá)水平均明顯高于D組，顯示MMP-2表達(dá)量降低時，TIMP-2表達(dá)量會隨之升高。細(xì)胞骨架是由蛋白纖維交織而成的立體網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，并充滿整個細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞骨架與細(xì)胞膜及核膜存在結(jié)構(gòu)聯(lián)系，能保持細(xì)胞形狀，且細(xì)胞骨架與細(xì)胞運動具有一定聯(lián)系；微管、微絲和纖維是組成細(xì)胞骨架主要結(jié)構(gòu)，微絲在腫瘤細(xì)胞中被修飾，與腫瘤細(xì)胞生長特點相關(guān)，而肌動蛋白是構(gòu)成微絲的主要成分，在細(xì)胞遷移及侵襲中起至關(guān)重要的作用[11]。本研究中，A組、B組、C組裸鼠的細(xì)胞骨架蛋白-肌動蛋白微絲面積明顯小于D組，川芎嗪聯(lián)合CIK細(xì)胞能降低肝癌HepG2細(xì)胞骨架面積，可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞松弛素達(dá)到減少微絲形成的目的，但川芎嗪聯(lián)合CIK細(xì)胞是否可以獲得新的間質(zhì)表型仍有待研究。

綜上所述，川芎嗪聯(lián)合CIK細(xì)胞能抑制裸鼠HepG2細(xì)胞遷移及侵襲，作用機制可能與下調(diào)細(xì)胞MMP-2和上調(diào)TIMP2蛋白表達(dá)，以及抑制骨架微絲重排有關(guān)。