安 彥，王 衛(wèi)

(天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津 300070)

醋酸環(huán)丙孕酮為一種抗雄激素藥物，可抑制雄激素的作用，并表現(xiàn)出孕激素和抗促性腺激素的作用。臨床中醋酸環(huán)丙孕酮常與炔雌醇制成復(fù)方制劑，或與鹽酸吡格列酮、醋酸亮丙瑞林等藥物聯(lián)合使用，適應(yīng)癥包括：自身免疫性孕酮皮炎、功能性子宮出血、多囊卵巢綜合癥及子宮內(nèi)膜異位等病癥的治療[1-4]。經(jīng)查詢，目前該品種尚未收入《中國藥典》，國內(nèi)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)》第90冊(cè)，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為WS1-(X-040)-2010Z(以下簡(jiǎn)稱國標(biāo))。現(xiàn)行國外藥典中，《美國藥典》第44版(USP 44版)未收載該品種，《英國藥典》2018版(BP 2018)及《歐洲藥典》9.4版(EP 9.4)均有收載。本次研究在比對(duì)國內(nèi)外現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和方法基礎(chǔ)上[5-7]，優(yōu)化試驗(yàn)條件，使有關(guān)物質(zhì)和含量測(cè)定方法更具合理性和有效性，增強(qiáng)方法的可控性。經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站查詢，我國醋酸環(huán)丙孕酮的生產(chǎn)企業(yè)有湖北葛店人福藥業(yè)有限公司、浙江仙琚制藥股份有限公司及上海創(chuàng)諾制藥有限公司，共三家企業(yè)，本次試驗(yàn)樣品來自前兩家企業(yè)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100色譜工作站；Waters e2695色譜工作站；METTLER XSE205DU天平；色譜柱：Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；Phenomenex C18柱(150 mm×4.6 mm,3 μm)；Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；Waters C18柱(125 mm×4.6 mm,3 μm)；乙腈為Merck色譜純；水為純化水；醋酸環(huán)丙孕酮對(duì)照品(批號(hào)10053-201602；純度99.7%)、醋酸甲羥孕酮對(duì)照品(批號(hào)100001-201305，純度99.6%)均來自中國食品藥品檢定研究院，醋酸環(huán)丙孕酮雜質(zhì)對(duì)照品(EP對(duì)照品，含雜質(zhì)F和雜質(zhì)I，批號(hào)Y0001223)、醋酸環(huán)丙孕酮雜質(zhì)定位對(duì)照品(EP對(duì)照品，批號(hào)Y0001390)、醋酸地馬孕酮對(duì)照品(進(jìn)口對(duì)照品，Trc-canada公司，批號(hào)1-CHG-104-2)；醋酸環(huán)丙孕酮樣品分別由浙江仙琚制藥股份有限公司(樣品編號(hào)1、2)和湖北葛店人福藥業(yè)有限公司(樣品3、4、5)提供。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 采用Phenomenex C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,3 μm)，以乙腈-水(45∶55)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣體積為20 μl。

2.2溶液制備

2.2.1有關(guān)物質(zhì)溶液 取本品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 ml中含2 mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取1 ml，置100 ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。

2.2.2含量測(cè)定溶液 精密稱定本品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 ml中約含0.2 mg的溶液，作為含量測(cè)定供試品溶液；另取醋酸環(huán)丙孕酮對(duì)照品適量，精密稱定，同法制備，作為對(duì)照品溶液。

2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 稱取醋酸地馬孕酮對(duì)照品約5 mg，置25 ml量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，量取5 ml，加流動(dòng)相稀釋至50 ml，搖勻，量取1 ml，加入已稱取醋酸環(huán)丙孕酮約20 mg的10 ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。色譜圖中醋酸環(huán)丙孕酮與醋酸地馬孕酮的分離度為2.5，見圖1。

1.醋酸地馬孕酮(雜質(zhì)Ⅴ) 2.醋酸環(huán)丙孕酮圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜圖

2.4線性試驗(yàn)

2.4.1有關(guān)物質(zhì)線性試驗(yàn) 精密稱取醋酸環(huán)丙孕酮對(duì)照品適量，加乙腈溶解并稀釋成每1 ml中含5 mg的溶液，作為對(duì)照品貯備溶液；精密量取對(duì)照品貯備溶液適量，分別加流動(dòng)相稀釋制成濃度為0.4、2.0、5.0、10.0、20.0、25.0和30.0 μg/ml的系列溶液，分別精密量取上述溶液20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；以醋酸環(huán)丙孕酮的濃度為橫坐標(biāo)(C)，以相對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(A)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明：醋酸環(huán)丙孕酮自身對(duì)照溶液在0.4～30.0 μg/ml的濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好線性關(guān)系，其線性方程為A=22.16C+0.227(r=0.999 99，n=7)。

2.4.2含量測(cè)定線性試驗(yàn) 精密稱取醋酸環(huán)丙孕酮對(duì)照品約20 mg，加流動(dòng)相溶解并稀釋至50 ml，作為對(duì)照品貯備溶液；精密量取對(duì)照品貯備溶液適量，分別加流動(dòng)相稀釋制成濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30和0.40 mg/ml的系列溶液，分別精密量取上述溶液20 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；以醋酸環(huán)丙孕酮的濃度為橫坐標(biāo)(C)，以相對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(A)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明：醋酸環(huán)丙孕酮供試液在0.05～0.40 mg/ml的濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好線性關(guān)系，其線性方程為A=22.43C-45.16(r=0.999 99，n=7)。

2.5最低檢出限(靈敏度試驗(yàn)) 精密量取對(duì)照溶液適量，采取逐步稀釋法測(cè)定，在與有關(guān)物質(zhì)供試品溶液及對(duì)照溶液相同的標(biāo)尺下記錄色譜圖，經(jīng)試驗(yàn)，溶液濃度稀釋至自身對(duì)照溶液濃度的0.02倍時(shí)，主峰可清晰分辨，主峰信噪比為12。

2.6精密度試驗(yàn)

2.6.1有關(guān)物質(zhì)精密度 取供試液和對(duì)照溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算連續(xù)6針對(duì)照溶液主峰、供試液主峰、單雜及總雜的RSD，結(jié)果依次為0.77%、0.27%、0.96%和1.16%，表明精密度良好。

2.6.2含量測(cè)定精密度 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試液和對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算連續(xù)6針供試液和對(duì)照品溶液主峰的RSD，結(jié)果分別為0.3%和0.1%，表明精密度良好。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

2.7.1有關(guān)物質(zhì)重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)醋酸環(huán)丙孕酮樣品分別稱取6份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試液，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算6份供試液中雜質(zhì)Ⅰ、單雜及總雜結(jié)果的RSD依次為7.3%、0.9%和1.9%，表明重復(fù)性良好。

2.7.2含量測(cè)定重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)醋酸環(huán)丙孕酮樣品分別稱取6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試液，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算6份供試液含量的RSD，結(jié)果為0.3%，表明重復(fù)性良好。

2.8溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn) 取有關(guān)物質(zhì)對(duì)照溶液及供試品溶液在室溫下分別放置44和32 h，期間分別測(cè)定5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的溶液穩(wěn)定性，計(jì)算對(duì)照溶液主峰面積、供試液主峰面積、單雜峰面積及總雜峰面積的RSD，試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照溶液在44 h內(nèi)、供試品溶液在32 h內(nèi)穩(wěn)定。另取含量測(cè)定對(duì)照品溶液及供試品溶液在室溫下放置27 h，期間分別測(cè)定5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的溶液穩(wěn)定性，計(jì)算對(duì)照品溶液主峰面積和供試液主峰面積的RSD，試驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)照品溶液和供試品溶液在27 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取5批醋酸環(huán)丙孕酮樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試液，按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算含量。再取上述樣品按照現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(國標(biāo))進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)比較，兩種方法的測(cè)定結(jié)果一致，方法準(zhǔn)確，結(jié)果見表1。

表1 方法準(zhǔn)確度結(jié)果

2.10破壞試驗(yàn)

2.10.1酸破壞 精密稱取本品約0.2 g，加乙腈15 ml使溶解，加入1 mol/L鹽酸溶液15 ml回流1 h，放冷，滴加1 mol/L氫氧化鈉溶液至中性，轉(zhuǎn)移并加流動(dòng)相至100 ml。經(jīng)與醋酸環(huán)丙孕酮混合雜質(zhì)對(duì)照品及醋酸環(huán)丙孕酮雜質(zhì)定位對(duì)照品比對(duì)，主要降解產(chǎn)物的保留時(shí)間與雜質(zhì)Ⅲ和雜質(zhì)Ⅵ一致，見圖2。

2.10.2堿破壞 精密稱取本品約0.2 g，加乙腈15 ml使溶解，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液15 ml常溫放置過夜，經(jīng)比對(duì)，主要降解產(chǎn)物的保留時(shí)間及光譜圖與雜質(zhì)Ⅲ一致，見圖2。

2.10.3氧化破壞 精密稱取本品約0.2 g，置100 ml量瓶中，加乙腈15 ml使溶解，加入過氧化氫濃溶液15 ml，放置過夜，加流動(dòng)相至刻度，結(jié)果表明主峰可降解出未知雜質(zhì)，見圖2。

2.10.4光照破壞 精密稱取本品約0.1 g，加流動(dòng)相溶解并稀釋至50 ml，經(jīng)4 500 lx光照72 h后測(cè)定，未發(fā)生明顯變化，見圖2。

2.11已知雜質(zhì)的命名和定位 按照EP 9.4(BP 2018)，有關(guān)物質(zhì)混合雜質(zhì)對(duì)照品中含有雜質(zhì)F和雜質(zhì)I，雜質(zhì)定位對(duì)照品中含有雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)E和雜質(zhì)G，本次研究工作制備了醋酸環(huán)丙孕酮及6個(gè)已知雜質(zhì)對(duì)照品的混合溶液，采集圖譜(見圖3)并重新計(jì)算了已知雜質(zhì)的相對(duì)保留時(shí)間，根據(jù)《中國藥典》的命名習(xí)慣，按雜質(zhì)出峰順序依次命名為雜質(zhì)Ⅰ～雜質(zhì)Ⅵ，詳見表2。

表2 已知雜質(zhì)對(duì)照表

1.未知雜質(zhì) 2.雜質(zhì)Ⅲ 3. 醋酸環(huán)丙孕酮 4.雜質(zhì)Ⅵ圖2 酸破壞(A)堿破壞(B)氧化破壞(C)光照破壞(D)未破壞樣品(E)HPLC色譜圖

2.12樣品測(cè)定和耐用性試驗(yàn) 取5批樣品分別采用Agilent 1100色譜工作站、Phenomenex C18(150 mm×4.6 mm，3 μm)色譜柱和Waters e2695色譜工作站、Agilent C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱照“2.1”項(xiàng)下方法試驗(yàn)測(cè)定有關(guān)物質(zhì)和含量，5批樣品采用不同儀器、不同類型色譜柱試驗(yàn)，結(jié)果基本一致，結(jié)果見表3和表4。

1. 雜質(zhì)Ⅰ 2. 雜質(zhì)Ⅱ 3. 雜質(zhì)Ⅲ 4. 雜質(zhì)Ⅳ 5. 雜質(zhì)Ⅴ 6.雜質(zhì)Ⅵ圖3 醋酸環(huán)丙孕酮及已知雜質(zhì)Ⅰ～雜質(zhì)Ⅵ混合溶液色譜圖表3 樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定及耐用性試驗(yàn)結(jié)果

樣品編號(hào)有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果(%)雜質(zhì)Ⅰ單雜總雜耐用性試驗(yàn)結(jié)果(%)雜質(zhì)Ⅰ單雜總雜10.0130.080.110.0180.070.1120.0150.080.120.0180.070.1230.110.060.330.110.050.3440.090.030.230.100.020.2250.090.030.230.090.030.22

表4 樣品含量測(cè)定及耐用性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1本次醋酸環(huán)丙孕酮質(zhì)量研究工作主要是在國標(biāo)和《歐洲藥典》的方法基礎(chǔ)上對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化。其中國標(biāo)方法系統(tǒng)適用性試驗(yàn)醋酸甲羥孕酮與醋酸環(huán)丙孕酮的分離度應(yīng)大于3.0，僅控制雜質(zhì)總量；而EP 9.4(BP 2018)有關(guān)物質(zhì)方法分別采用了混合雜質(zhì)對(duì)照品(含有雜質(zhì)F和雜質(zhì)I)和雜質(zhì)定位對(duì)照品(含有雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)E和雜質(zhì)G)，對(duì)上述已知雜質(zhì)的定位采用了兩種混合雜質(zhì)對(duì)照品結(jié)合相對(duì)保留時(shí)間的方式。國標(biāo)方法的分離度較差，無法將已知雜質(zhì)完全分離。EP 9.4的測(cè)定方法可將6個(gè)已知雜質(zhì)與主峰完全分離，但需要使用特殊型號(hào)色譜柱(C18，125 mm×4.6 mm，3 μm)且分析時(shí)間過長(zhǎng)；而本品的已知雜質(zhì)對(duì)照品國內(nèi)尚無法生產(chǎn)，購買周期長(zhǎng)，價(jià)格極其昂貴，不適用于常規(guī)檢驗(yàn)。經(jīng)修訂后的色譜系統(tǒng)僅用普通C18柱即可實(shí)現(xiàn)醋酸環(huán)丙孕酮及6個(gè)已知雜質(zhì)對(duì)照品的完全分離，通過所采集的主峰和已知雜質(zhì)對(duì)照品色譜圖及相對(duì)保留時(shí)間實(shí)現(xiàn)對(duì)已知雜質(zhì)的定位。

3.2在進(jìn)行堿破壞試驗(yàn)中，首先選擇精密稱取本品約0.2 g，加乙腈15 ml使溶解，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液15 ml回流1 h，放冷，滴加1 mol/L鹽酸溶液至中性，轉(zhuǎn)移并加流動(dòng)相至100 ml，結(jié)果主峰被完全降解。在多次調(diào)整破壞條件后發(fā)現(xiàn)，本品在堿性條件下極不穩(wěn)定，常溫放置5 min即可發(fā)生降解，經(jīng)比對(duì)，主要降解產(chǎn)物的保留時(shí)間及光譜圖與雜質(zhì)Ⅲ一致，提示本品對(duì)堿性條件極不穩(wěn)定。