于金婷

【摘 要】明膠空心膠囊主要用于藥物的包裝，對(duì)藥物質(zhì)量有著直接的影響。為了保證明膠膠囊符合藥典要求，需要我們進(jìn)行相應(yīng)的微生物限定檢查。我們主要對(duì)微生物檢查方法的可行性進(jìn)行研究，通過實(shí)際的試驗(yàn)測(cè)試，對(duì)明膠空心微生物的限定檢查方法的可行性進(jìn)行研究。根據(jù)實(shí)際的實(shí)驗(yàn)操作得知，該檢測(cè)方法可以用于明膠空心膠囊的微生物限定檢查。

【關(guān)鍵詞】明膠膠囊;微生物限定檢查;方法研究

中圖分類號(hào)： R927.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 2095-2457（2019）13-0180-003

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.13.086

Study on Microbial Limit Test Method for Gelatin Capsules

YU Jin-ting

（Sino-US Shanghai Squibb Pharmaceutical Co.，Ltd.Shanghai 200240，China）

【Abstract】Gelatin hollow capsules are mainly used for drug packaging， which has a direct impact on the quality of drugs. In order to ensure that gelatin capsules meet the requirements of the Pharmacopoeia，we need to carry out the corresponding microbial limit test. We mainly study the feasibility of microbial examination methods. Through the actual test， we study the feasibility of the limited examination methods of gelatin hollow microorganisms. According to the actual experimental operation， the method can be used for the microbial limit test of gelatin hollow capsules.

【Key words】Gelatin capsules; Microbial limit test; Methodological study

0 引言

明膠膠囊主要用于包裝藥物，需要通過微生物限定檢查，才能保證明膠膠囊沒有受到微生物的污染。我們制定了相應(yīng)的限定檢驗(yàn)方法，進(jìn)行明膠膠囊微生物限定的檢查工作。為了避免檢驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陰性，我們?cè)O(shè)置了相應(yīng)的陰性對(duì)照組，可以對(duì)照有菌生長(zhǎng)的情況。本文主要對(duì)明膠膠囊的微生物限定檢查方法進(jìn)行研究，并確定該限定檢查方法是否具符合檢查要求[1]，下面為具體的研究?jī)?nèi)容：

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和材料

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

我們?cè)谶M(jìn)行檢驗(yàn)方法的研究前，需要進(jìn)行合理的準(zhǔn)備工作，首先要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)備的準(zhǔn)備。我們對(duì)實(shí)驗(yàn)分析以后，需要準(zhǔn)備以下幾種試驗(yàn)設(shè)備：第一，生物安全柜。主要用于保護(hù)實(shí)驗(yàn)者、試驗(yàn)環(huán)境及材料，避免出現(xiàn)感染性氣溶膠和濺出物。第二，天平。主要用于實(shí)驗(yàn)稱量，我們選擇精準(zhǔn)度為±0.1g天平用于本次實(shí)驗(yàn)測(cè)量。第三，培養(yǎng)箱。主要用于菌落的培養(yǎng)工作，根據(jù)實(shí)際的試驗(yàn)需要我們選擇具有多個(gè)溫度調(diào)節(jié)檔位的培養(yǎng)箱。第四，冰箱。用于菌落的存放，溫度調(diào)控在2-8℃之間。第五，水浴鍋。主要用于實(shí)驗(yàn)中的蒸餾、干燥、濃縮等等需求。第六，恒溫?fù)u床。主要用于菌落的培養(yǎng)工作。第七，旋渦混合器。主要用于試驗(yàn)中的振蕩和渦旋要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)用品

接下來需要我們進(jìn)行試驗(yàn)用品的準(zhǔn)備工作，首先準(zhǔn)備接種環(huán)，用于微生物的接種需求。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，準(zhǔn)備各種型號(hào)的無菌容器、無菌管、無菌移液管、90mm無菌培養(yǎng)皿。

1.3 稀釋液和培養(yǎng)基

其次需要我們準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)需要的培養(yǎng)名和稀釋液，我們準(zhǔn)備的稀釋液為無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液和無菌磷酸緩沖液，前者PH值為7.0，后者PH值為7.2。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要我們準(zhǔn)備了較多的培養(yǎng)基，分別為（TSB）胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、（TSA）胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、（SDA）沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、（MCB）麥康凱液體培養(yǎng)基、（MCA）麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、（RVS）沙門菌增菌液體培養(yǎng)基、（XLD）木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基、（CAB）溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基。

1.4 檢測(cè)菌種

在完成實(shí)驗(yàn)用品的準(zhǔn)備工作后，我們最后進(jìn)行檢測(cè)菌種的準(zhǔn)備工作。根據(jù)實(shí)際的實(shí)驗(yàn)需求，我們選擇了多種檢驗(yàn)菌種，分別：ATCC9027銅綠假單胞菌、ATCC6538金黃色葡萄球菌、ATCC8739大腸埃希菌、ATCC6633枯草芽孢桿菌、ATCC10231白色念珠菌、ATCC16404巴西曲霉、ATCC14028乙型副傷寒沙門菌、現(xiàn)場(chǎng)菌[2]。

2 檢查方法

2.1 氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)/霉菌及酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)檢測(cè)

2.1.1 供試液制備

在完成所有準(zhǔn)備工作以后，我們就可以進(jìn)行正式的實(shí)驗(yàn)，首先進(jìn)行供試液的制備工作。先將90ml磷酸緩沖液存放在2-8℃環(huán)境下1h，在達(dá)到存放時(shí)間以后取10g樣品放入預(yù)制的緩沖液中，放入以后需要進(jìn)行人工振搖的操作，將樣品膠囊的表明完全潤(rùn)濕在緩沖液中，在全部潤(rùn)濕以后，將膠囊放在剛才用于存放緩沖液的環(huán)境中，并等待1h。將樣品取出放置在恒溫?fù)u床中，并將溫度調(diào)節(jié)值45℃左右，并制成1：10均勻的供試液。在完成上述工作以后，需要進(jìn)行供試液PH值的測(cè)量工作，正常情況下供試液的PH值應(yīng)該在6-8之間，如果測(cè)量的PH值沒有達(dá)到上述要求，需要我們使用NaOH或HCL進(jìn)行PH值的合理調(diào)整，直到達(dá)到需要的PH值，這就得到了我們需要的檢測(cè)供試液，用于TAMC和TYMC的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 試驗(yàn)組

我們先進(jìn)行需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)操作，將制備出的供試液進(jìn)行防治在無菌試管中，總共選擇6份9.9ml的供試液，在每個(gè)試管加入供試液之后，分別加入試驗(yàn)菌懸液，加入的菌懸液為ATCC6538金黃色葡萄球菌，ATCC6633枯草芽孢桿菌，ATCC9027銅綠假單胞菌菌懸液，ATCC10231白色念珠菌菌懸液，ATCC16404巴西曲霉菌懸液，現(xiàn)場(chǎng)菌，總共可以得到六分含菌溶液，我們?cè)诤芤旱恼{(diào)配時(shí)，需要對(duì)含菌量進(jìn)行和控制，將含菌量控制在100CFU/ml以內(nèi)。得到需要的含菌容易以后，取1mml防治在無菌平皿中，最后加入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基。接下來進(jìn)行霉菌及酵母菌總數(shù)的計(jì)數(shù)操作，跟上述實(shí)驗(yàn)步驟基本相同，但是采用的試驗(yàn)菌懸液不同，主要選擇ATCC10231白色念珠菌菌懸液、ATCC16404巴西曲霉菌懸液，在制備含菌溶液以后，同樣對(duì)含菌量進(jìn)行合理的控制，要注意的是最后我們將制備的含菌溶液加入到沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基[3]。

2.1.3 稀釋劑對(duì)照組

稀釋劑對(duì)照組使用的緩沖液為無菌磷酸緩沖液，PH值為7.2，菌懸液的添加方式參照實(shí)驗(yàn)組。如果在試驗(yàn)過程中，不需要使用中和劑，我們可以取消稀釋劑對(duì)照組這一試驗(yàn)步驟。

2.1.4 菌液對(duì)照組

進(jìn)行菌液對(duì)照組的操作時(shí)，與稀釋劑對(duì)照組基本相同，只是選擇的緩沖液類型不同，菌液對(duì)照組選擇無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，PH值為7.0。

2.1.5 供試品對(duì)照組

按照上述試驗(yàn)組的操作方式，將菌液換成無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，使用供試液進(jìn)行試驗(yàn)操作。

2.1.6 稀釋劑陰性對(duì)照

先準(zhǔn)備好4個(gè)無菌平皿，然后在兩個(gè)平皿中放入1mlpH7.2無菌磷酸緩沖液，并放入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，另外兩個(gè)加入同樣的緩沖液，加入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。

2.1.7 培養(yǎng)基陰性對(duì)照

跟稀釋劑陰性對(duì)照操作基本一致，但是不需要加入緩沖劑，直接按照上述試驗(yàn)進(jìn)行培養(yǎng)基的加入。

2.1.8 培養(yǎng)與觀察

在完成上述實(shí)驗(yàn)操作以后，我們就可以進(jìn)行菌落數(shù)量的計(jì)數(shù)工作，為了方便菌落數(shù)量的觀察，我們需要對(duì)培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行合理的把控。將TSA平皿控制在3天以內(nèi)，溫度控制在30-35℃，SDA平皿控制在5天以內(nèi)，溫度控制在20-25℃。在觀察結(jié)束以后，將數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄工作。

2.2 控制菌檢查

2.2.1 大腸埃希菌檢查

我們先進(jìn)行大腸埃希菌的檢查工作，將TSB放置在2-8℃環(huán)境下存放1h，將10g樣品放置在準(zhǔn)備好的TSB中，并進(jìn)行膠囊表面的潤(rùn)濕操作，放置在2-8℃環(huán)境下存放1h。取出放入45℃左右的恒溫?fù)u床中，并加入大腸埃希菌，并進(jìn)行搖勻處理，上述操作為實(shí)試驗(yàn)組操作。接下來去100mlTSB加入0.1ml大腸埃希菌，并進(jìn)行合理的搖勻處理，得到陽性對(duì)照。按照試驗(yàn)組操作進(jìn)行制備，但不添加大腸埃希菌，作為供試品對(duì)照組。將100TSB取出放置在指定的位置上，作為陰性對(duì)照。完成上述操作以后，我們就可以進(jìn)行培養(yǎng)與觀察，將TSB放置在30-35℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，在18h后取出1mlTSB放置在麥康凱液體培養(yǎng)基中，并進(jìn)行搖勻處理。將培養(yǎng)箱的溫度調(diào)節(jié)值42-44℃，培養(yǎng)24h。在增殖肉湯中使用接種環(huán)挑出樣品，并將樣品涂勻在培養(yǎng)基上，將溫度調(diào)節(jié)到30-35℃培養(yǎng)18h，進(jìn)行數(shù)據(jù)結(jié)果的記錄工作。將接種的菌落和試驗(yàn)組的菌落分別放置在平皿中，并加入TSA培養(yǎng)基，使用30-35℃進(jìn)行培養(yǎng)，將培養(yǎng)時(shí)間控制在3天。

2.2.2 銅綠假單胞菌檢查

在進(jìn)行銅綠假單胞菌檢查時(shí)，與大腸埃希菌的檢查步驟基本一致，在試驗(yàn)組階段，所有操作相同，將加入的菌落替換為銅綠假單胞菌即可。在進(jìn)行陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)時(shí)，將加入的菌落替換為銅綠假單胞菌。供試品對(duì)照組和陰性對(duì)照與大腸埃希菌一致。最后進(jìn)行培養(yǎng)和計(jì)數(shù)工作，與上述相同。

2.2.3 沙門氏菌檢查

在進(jìn)行沙門氏菌檢查時(shí)，與大腸埃希菌的檢查步驟基本一致，在試驗(yàn)組階段，所有操作相同，將加入的菌落替換為沙門氏菌即可。在進(jìn)行陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)時(shí)，將加入的菌落替換為沙門氏菌。供試品對(duì)照組和陰性對(duì)照與大腸埃希菌一致。最后進(jìn)行培養(yǎng)和計(jì)數(shù)工作，與上述相同[4]。

3 方法適用性檢查記錄

3.1 TYMC方法適用性檢查記錄

3.2 控制菌方法適用性檢查記錄

根據(jù)表1和表2的檢查記錄可知，每次試驗(yàn)均符合要求，可以用于明膠空心膠囊的微生物限定檢查工作。

4 結(jié)論

本文先進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作的研究，將實(shí)驗(yàn)中需要的設(shè)備、菌種、用品、稀釋液及培養(yǎng)基，對(duì)每種實(shí)驗(yàn)用品的功能進(jìn)行了大體的介紹。然后我們進(jìn)行了氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)/霉菌及酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)檢測(cè)工作，按照設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)進(jìn)行操作，保證實(shí)驗(yàn)的規(guī)范性。接下來我們對(duì)控制菌進(jìn)行檢查，主要選擇三種控制菌，分別為大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌檢查。通過實(shí)驗(yàn)的方式進(jìn)行三種菌種的觀察和記錄工作。最后根據(jù)上述試驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制出檢查表格。根據(jù)表格上的數(shù)據(jù)可知，三次試驗(yàn)結(jié)果均符合要求，說明該方法可以用于明膠空心膠囊的微生物限定檢查，希望可以為明膠膠囊今后的限定檢查提供參考[5]。

【參考文獻(xiàn)】

[1]石晶萍，梁元太，徐開祥.明膠空心膠囊鉻元素AAS法測(cè)定不確定度評(píng)定研究[J].中國(guó)藥事，2017，31（1）：37-42.

[2]呂東巖，王瑩，包懿，等.GC/MS測(cè)定明膠空心膠囊中17種塑化劑[J].吉林蔬菜，2017（9）：30-32.

[3]王發(fā)英，吳查青.明膠空心膠囊中7種元素含量測(cè)定方法的建立與應(yīng)用[J].中國(guó)藥房，2017，28（28）：3992-3995.

[4]陳豐農(nóng)，陳浦蘭，謝亞平，等.基于高光譜成像技術(shù)的藥用膠囊鉻含量快速檢測(cè)方法研究[J].計(jì)量學(xué)報(bào)，2017（6）：769.

[5]宋薇，高俊海，宋桂雪， et al.石墨化碳黑凈化-分光光度法測(cè)定明膠空心膠囊中的六價(jià)鉻[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2017，8（3）：761-766.