張敏

【摘要】目的：研究湘西山莓葉揮發(fā)油化學(xué)成分，及其抗氧化活性、抑菌作用，為山莓葉揮發(fā)油的進(jìn)一步開發(fā)利用提供基礎(chǔ)依據(jù)。方法：采用水蒸氣蒸餾法提取山莓葉揮發(fā)油，通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)確定其中化學(xué)成分與相對(duì)百分含量。運(yùn)用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法評(píng)價(jià)山莓葉揮發(fā)油清除自由基能力，刃天青96孔板微量稀釋法測試五種供試菌的抑菌作用。結(jié)果：鑒定山莓葉揮發(fā)油19種成分，占揮發(fā)油總質(zhì)量的87.54%，其中酚類及含氧衍生物63.55%，烴類19.79%，酯類2.54%，醛類1.66%。山莓葉揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基的清除呈量效關(guān)系，但效果弱于蘆丁和Vc，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蘇云金桿菌、沙門氏菌、痢疾志賀氏菌等五種供試菌均有抑菌作用，其中對(duì)痢疾志賀桿菌MIC為15.6μg/mL，效果明顯好于卡拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品。結(jié)論：山莓葉揮發(fā)油體外抗氧化能力相對(duì)較弱，對(duì)痢疾志賀桿菌抑制作用顯著。

【關(guān)鍵詞】山莓葉;揮發(fā)油;氣相色譜-質(zhì)譜;抗氧化活性;抑菌活性

【中圖分類號(hào)】R285.5【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號(hào)】1007-8517（2019）8-0040-04

Abstract：ObjectThechemicalcomposition，antioxidantandantimicrobialactivitiesofthevolatileoilofRubuscorchorifoliusL.f.leaveswereinvestigated.MethodThevolatileoilwasextractedbysteamdistillation，identifiedbyGC/MSanddeterminedbypeakareanormalizationmethod.Theantioxidantactivityoftheoilwastestedby1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl（DPPH）method，theantibacterialactivitywasevaluatedbyrenzurinmicroplateassay.ResultAtotalof19componentswereidentified，themainconstituentswerephenolderivatives（63.55%），alkanes（19.79%），esters（2.54%），aldehydes（1.66%）andetc.ThevolatileoilrevealedacertainscavengingeffectonDPPHfreeradical，theclearanceeffectwasweakerthanrutinandVc.Thevolatileoilhadacertainantibacterialeffectonescherichiacoli，staphylococcusaureus，bacillusthuring-iensis，salmonella，shigelladusenterlea.Minimuminhibitoryconcentrationtoshigelladusenterleawas15.6μg/mL，thatislowerthanconcentrationofkalafunginstandard.ConclusionvolatileoilfromRubuscorchorifoliusL.f.leavesshowedweakantioxidantandcertaininhibitioneffectonshigelladusenterlea.

Keywords：RubuscorchorifoliusL.f.leaves;VolatileOil;GasChromatography-massSpectrometry;Antioxidant;Antibacterial

山莓（RubuscorchorifoliusL.f.），又名三月泡，系薔薇科Rosaceae，薔薇亞科懸鉤子屬RubusL.中的一種落葉灌木[1-2]。山莓根、莖、葉、果實(shí)均可入藥。根性味微苦、辛、平，具有活血化瘀、祛風(fēng)除濕、解毒斂瘡的功效，主治痢疾、遺精、濕疹、毒蛇咬傷、閉經(jīng)痛經(jīng)、風(fēng)濕腰痛、小兒疳積等癥[3-4]，未成熟果實(shí)性味微甘、酸、溫，具有化痰解郁、醒酒止渴、澀精益腎、助陽明目之功效，常用于替代覆盆子入藥做引[5-6]，主治腎虛、遺精、醉酒、丹毒等癥。葉性微苦，具有解毒、消腫、斂瘡、清熱利咽等作用，主治咽喉腫痛、多發(fā)性膿腫、乳腺炎等癥[7]。在湖南湘西山莓作為苗族藥治療腹瀉，療效確切[8]。目前湘西山莓葉及其揮發(fā)油的化學(xué)成分及抑菌活性雖見報(bào)道[9-10]，但考慮到生態(tài)環(huán)境的多樣性，意味著二次代謝產(chǎn)物的多樣性，本實(shí)驗(yàn)對(duì)湘西張家界山莓葉提取揮發(fā)油，GC-MS鑒定化學(xué)成分，DPPH法評(píng)價(jià)自由基清除能力[11-12]，刃天青96孔板微量稀釋法測定抑菌活性[13]，試圖更詳細(xì)探明山莓葉揮發(fā)油其醫(yī)藥和保健作用的內(nèi)在本質(zhì)，以期更好地綜合開發(fā)利用湘西山莓資源，提供重要的參考依據(jù)。

1材料

山莓葉采自吉首大學(xué)張家界校區(qū)后山，由吉首大學(xué)廖博儒教授鑒定為薔薇科懸鉤子屬植物山莓R.corchorifoius的葉，陰干，粉碎后備用石油醚（沸程30～60℃）、無水硫酸鈉、氯化鈉、蒸餾水、DPPH自由基、無水乙醇、VC、蘆丁、卡拉霉素、刃天青（Resazurin）、甲醇以上試劑均為分析純ThermoDSQ-IIGC-MS聯(lián)用儀（美國賽默飛科技公司）、紫外分光光度計(jì)、MultiskanFC酶標(biāo)儀（美國賽默飛科技公司）、pH酸度計(jì)（HM-205日本TOA公司）、烘箱（DN-63日本yamato公司）、培養(yǎng)箱（PW/10-002重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）、超凈工作臺(tái)（CCV-1311日本日立公司）、冰箱、高壓蒸汽滅菌器（SM-52、日本）1/萬天平（AEG-220日本島津）、水蒸氣蒸餾裝置、電子天平、真空干燥箱、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、真空干燥器、FD-1冷凍干燥機(jī)。

2方法

2.1山莓葉揮發(fā)油的提取稱取600.00g山莓葉粉于揮發(fā)油提取器中，加3000mL蒸餾水加熱提取，收集蒸出液，再加入NaCl直至蒸出液飽和，然后用30～60℃的石油醚萃取，無水硫酸鈉脫水，石油醚萃取液于37℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，即得山莓葉揮發(fā)油。

2.2GC-MS檢測條件色譜條件：石英毛細(xì)管柱BP×5（25m×0·22mm×0·25μm）;起始溫度40℃，保持3min，以5.0℃/min的升溫速率升到220℃，保持5min;進(jìn)樣溫度230℃，分流比30∶

1，進(jìn)樣量1μL，載氣為氦氣，流速為1.0mL/min;質(zhì)譜條件：離子源EI，離子源溫度250℃，電子能量70eV，發(fā)射電流：120μA，掃描范圍30～500amu。定性分析：Mainlib譜庫檢索，確定成分，峰面積歸一化法確定相對(duì)含量。

2.3山莓葉揮發(fā)油清除DPPH自由基準(zhǔn)確稱取12.5mgDPPH·無水乙醇溶解定容，配制成50μg/mL儲(chǔ)備液（現(xiàn)用現(xiàn)配），即為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別取0、2、4、6、8mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液在25mL容量瓶中定容，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度依次為：0、4、8、12、16μg/mL。在517nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取0.2325g山莓葉揮發(fā)油于25mL容量瓶中，無水乙醇溶解定容，再分別取0、0.1、0.25、0.5、1mL于10mL容量瓶中與5mL濃度為40μg/mL的DPPH標(biāo)準(zhǔn)液混合，乙醇定容，山莓葉揮發(fā)油濃度依次為0、93、232.5、460、930μg/mL。517nm處動(dòng)態(tài)測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到DPPH·殘留量。繪制不同濃度的揮發(fā)油與DPPH混合物中DPPH殘留率的變化曲線。

DPPH·殘留率=[DPPH·]T/[DPPH·]T0×100%式中：[DPPH·]T為某一時(shí)刻DPPH·的質(zhì)濃度;[DPPH·]T0為DPPH·的起始質(zhì)量濃度。

各自稱取5.00mg蘆丁、Vc于分別100mL容量瓶，無水乙醇定容，即得蘆丁、Vc儲(chǔ)備液。分別取0、0.5、1、1.5、2.0、2.5mL儲(chǔ)備液于10mL容量瓶，與5mL濃度為40μg/mL的DPPH標(biāo)準(zhǔn)液混合，乙醇定容，即分別得蘆丁、Vc系列溶液為0、2.5、5、7.5、10、12.5μg/mL，搖勻。在517nm處的吸光度，繪制不同濃度的Vc、蘆丁與DPPH混合物中DPPH殘留率的變化曲線。

2.4刃天青顯色法檢測山莓葉揮發(fā)油抑菌活性菌懸液的制作：各細(xì)菌株在實(shí)驗(yàn)室活化后繼代培養(yǎng)，并于冰箱內(nèi)4℃下保存一部分。用之前先將各細(xì)菌株在NA培養(yǎng)基上活化，且以MHB繼代培養(yǎng)菌株2～3代，并在試驗(yàn)的前一天繼代培養(yǎng)一次，以保證菌的生長能力達(dá)到最佳。用分光光度計(jì)測定每株細(xì)菌菌液的OD600（大腸桿菌在OD600=0.1時(shí)的菌濃約為108CFU/mL，其他細(xì)菌參照此數(shù)值）。用MHB培養(yǎng)基將菌液稀釋到1×108CFU/mL的濃度。取5mL菌液和7.5mL的刃天青指示劑儲(chǔ)備液混勻，用排槍吸取100μL菌液加入96孔板，除無菌對(duì)照孔外。

供測試樣品和陽性對(duì)照的儲(chǔ)液的配制：將揮發(fā)油于-10℃條件下靜置24h，冷凍分層，分離上下層。用乙醇將揮發(fā)油、冷凍后揮發(fā)油的上下層及標(biāo)準(zhǔn)品配制成最大濃度為1.00mg/mL的儲(chǔ)液，然后以倍比稀釋，共配制1.00～1.95μg/mL十個(gè)濃度儲(chǔ)備液。將上述儲(chǔ)備液加入96孔板，每孔2μL;留無菌對(duì)照孔和生長對(duì)照孔。

刃天青指示劑配制成750μg/mL儲(chǔ)備液，分別取取5mLMHB培養(yǎng)基和7.5mL的刃天青指示劑儲(chǔ)備液混勻，用排槍吸取100μL加入96孔板的無菌對(duì)照孔。

最低抑菌濃度（MIC）的測定：將96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)。每5～6小時(shí)觀察一次，有細(xì)菌生長的孔逐漸由藍(lán)色變粉，其中無菌的陰性對(duì)照孔為藍(lán)色，細(xì)菌陽性對(duì)照空為亮紅色，以發(fā)生顏色變化的前一孔為最低抑菌濃度（MIC）值。

3結(jié)果與分析

3.1山莓葉揮發(fā)油的提取水蒸氣蒸餾法提取山莓葉得到揮發(fā)油0.2325g，山莓葉揮發(fā)油的得率為0.03875%。

3.2山莓葉揮發(fā)油化學(xué)成分分析山莓葉揮發(fā)油總離子流圖如圖1所示，其組成成分及相對(duì)含量見表1。由表1可知，確定了其中的19種成分，占總揮發(fā)油總量的98.49%，其中主要成分為4-甲基-2，5-二叔丁基苯酚（45.46%），2，3-二甲基戊烷（19.79%），2-甲氧基-4-乙烯基苯酚（18.09%），2，5-十八碳二炔酸甲酯（2.54%）紫蘇醛（1.66%）等。

3.3山莓葉揮發(fā)油DPPH法抗氧化活性分光光度法測定DPPH標(biāo)準(zhǔn)系列溶液在517nm處的吸光值，結(jié)果見圖2，作線性回歸分析，得到線性回歸方程為y=0.0351x+0.0445，相關(guān)系數(shù)R2=0.9991，表明DPPH自由基濃度與其吸光度呈即顯著正相關(guān)關(guān)系。

山莓葉揮發(fā)油、Vc和蘆丁對(duì)DPPH自由基均有清除能力，隨著樣品濃度的增加，清除效果越好，而且山莓葉揮發(fā)油和Vc的清除速度比蘆丁要快，如圖3、圖4、圖5所示，當(dāng)DPPH·自由基殘留率為50%時(shí)，山莓葉揮發(fā)油濃度為121.9μg/mL、Vc濃度為4.8μg/mL、蘆丁為6.3259μg/mL，由此可知山莓葉揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基的清除能力明顯低于Vc和蘆丁，山莓葉揮發(fā)油對(duì)DPPH抗氧化活性相對(duì)較弱。

3.4山莓揮發(fā)油抑菌活性刃天青顯色抑菌活性測試結(jié)果見表2，表明山莓葉揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、痢疾志賀氏菌、沙門氏菌、蘇云金桿菌均有一定的抑菌作用，而且對(duì)痢疾志賀桿菌的最低抑菌濃度（MIC）達(dá)到31.25μg/mL。揮發(fā)油冷凍下層對(duì)痢疾志賀氏桿菌的最低抑菌濃度（MIC）為15.6μg/mL，低于卡拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品。

4討論

通過GC-MS技術(shù)對(duì)湘西張家界山莓葉揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定分析，可知其主要成分為酚類及其含氧衍生物（63.55%），烷烴類（19.79%），酯類（2.54%）醛類（1.66%）等，比較周雙德測定的山莓葉揮發(fā)油的主要成分烷類（62.71%）、酯類（7.57%）、酚類（2.6%）、醇類（2.17%），程怡測定的主要成分烷類（37.4%）、醇類（16.33%）、酯類（6.52%）、酚類（2.6%）、測定成分及含量均存在差異，有待進(jìn)一步研究。DPPH法結(jié)果表明湘西山莓揮發(fā)油抗氧化能力相對(duì)弱于蘆丁和Vc。此外，刃天青96孔板微量稀釋顯色法與K-B紙片法相比較，分析方法靈敏，結(jié)果穩(wěn)定，需要的試劑和樣品量少，適合植物提取分離所得少量樣品的抑菌活性篩選，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)山莓葉揮發(fā)油對(duì)痢疾志賀桿菌的最低抑菌濃度達(dá)到15.6μg/mL，比卡拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品抑菌效果更好，是一種潛在的抗菌藥源，有待進(jìn)一步研究開發(fā)。綜上所述山莓葉揮發(fā)油具有一定的抗氧化和良好的抑菌能力，作為天然抑菌劑和抗氧化劑具有良好的開發(fā)前景，同時(shí)也為湘西山莓開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2019-02-15編輯：程鵬飛）