鄭 虹，杜 可，韓艷麗，鄧加聰

（1.福建師范大學(xué)福清分校海洋與生化工程學(xué)院，福建福清350300；2.現(xiàn)代設(shè)施農(nóng)業(yè)福建省高等學(xué)校工程研究中心，福建福清350300）

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，我國(guó)對(duì)石油的需求日益膨脹，我國(guó)已成為第二大能源消耗國(guó)。據(jù)有關(guān)國(guó)際能源資料統(tǒng)計(jì)和專家預(yù)言，全球適合于經(jīng)濟(jì)開(kāi)采的石油以及天然氣資源只能再開(kāi)采30～50年，而煤炭也只夠開(kāi)采300年[1]，因此尋找可再生的替代能源己迫在眉睫。

由于乙醇燃燒只產(chǎn)生水和二氧化碳，對(duì)環(huán)境不會(huì)造成污染，是一種清潔能源，而且生物燃料乙醇作為一種可再生能源[2-4]，具有很大的市場(chǎng)潛力。釀酒酵母是乙醇生產(chǎn)中最常用的發(fā)酵菌株，但是乙醇耐受性往往成為限制釀酒酵母乙醇產(chǎn)量的重要因素[5-6]，因此選育耐高溫、耐高糖、耐高濃度乙醇的酵母菌株對(duì)于提高乙醇產(chǎn)率具有重要意義[7-11]。彭源德等[12]通過(guò)初篩、復(fù)篩和紫外誘變，篩選到1株編號(hào)為S-132的耐受性優(yōu)良的酒精酵母，該酵母具有耐40℃高溫和耐16%vol乙醇的能力。

本研究采用自然分離篩選的方法，從分離樣品中獲得耐高溫、耐高糖、耐高濃度乙醇的酵母菌，為酒精生產(chǎn)節(jié)能降耗提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

混合菌粉，由龍巖沉缸酒廠提供；蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖、瓊脂粉、三苯基四氮唑鹽酸鹽（TTC）等實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

YPD液體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨20、酵母浸粉10、葡萄糖20，自然pH值。

平板分離培養(yǎng)基：YPD瓊脂培養(yǎng)基。

初篩培養(yǎng)基（g/L）：TTC上層培養(yǎng)基，TTC 0.5，葡萄糖5。

TTC下層培養(yǎng)基：YPD瓊脂培養(yǎng)基。

YFM發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖150，酵母浸粉5，pH值5.0。

斜面保藏培養(yǎng)基：YPD瓊脂。

1.2 主要儀器

SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；DHG-90 70A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；THZ-C型臺(tái)式恒溫振蕩器，太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；W-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；GSP-9050MBE型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；TGL-16M型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌粉的富集培養(yǎng)及菌株分離篩選

取1 g混合菌粉，接種于YPD液體培養(yǎng)基，30℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h；用無(wú)菌蒸餾水將菌液稀釋至 10-7、10-8、10-9，取上述梯度稀釋液0.1 mL涂布于平板分離培養(yǎng)基，30℃倒置培養(yǎng)24 h；將分離得到的具有酵母菌典型菌落的菌株接種于試管斜面，備用。

1.3.2 高產(chǎn)酒精酵母的初篩

將上述挑選到的單菌落，點(diǎn)接于TTC下層平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24 h，待長(zhǎng)出菌落后倒入TTC上層培養(yǎng)基，30℃下放置3 h，挑取顏色變深紅的菌落接種于YPD試管斜面，編號(hào)、培養(yǎng)，4℃冰箱保存，備用。

1.3.3 高產(chǎn)酒精酵母的復(fù)篩

將初篩得到的菌株接種于YPD試管斜面，30℃活化培養(yǎng)24 h；將活化后的菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基，以30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h；將培養(yǎng)后的種子液按5%接種量接種于YFM發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃靜置發(fā)酵72 h，觀察菌株產(chǎn)氣泡的快慢及產(chǎn)量，并測(cè)定發(fā)酵液中酒精含量。

1.3.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酒精酵母產(chǎn)酒精能力的影響

將復(fù)篩得到的菌株，接種于YPD試管斜面，30℃活化培養(yǎng)24 h；挑取1環(huán)接種于YPD液體培養(yǎng)基，以30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h；按5%接種量接種于100 mL YFM發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃下靜置發(fā)酵，每隔12 h取樣測(cè)定發(fā)酵液的酒精度和OD600。

1.3.5 耐受性試驗(yàn)

（1）耐高溫試驗(yàn)

將復(fù)篩得到的菌株，接種于YPD試管斜面，30℃活化培養(yǎng)24 h；挑取1環(huán)接種于YPD液體培養(yǎng)基，以30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h；按5%接種量接種于100 mL YFM發(fā)酵培養(yǎng)基，于不同溫度下（30℃、35℃、40℃、45℃、50℃）靜置發(fā)酵72 h；測(cè)定發(fā)酵液的酒精度和OD600。

（2）耐乙醇試驗(yàn)

將復(fù)篩得到的菌株，接種于YPD試管斜面，30℃活化培養(yǎng)24 h；挑取1環(huán)接種于YPD液體培養(yǎng)基，以30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h；按5%接種量接種于100 mL YFM發(fā)酵培養(yǎng)基，40℃下靜置發(fā)酵72 h，測(cè)定發(fā)酵液的酒精度和OD600。乙醇起始濃度分別為 0、4%vol、8%vol、12%vol、16%vol、20%vol。

（3）耐糖性試驗(yàn)

將復(fù)篩得到的菌株，接種于YPD試管斜面，30℃活化培養(yǎng)24 h；挑取1環(huán)接種于YPD液體培養(yǎng)基，以30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h；按5%接種量接種于100 mL YFM發(fā)酵培養(yǎng)基，40℃下靜置發(fā)酵72 h，測(cè)定發(fā)酵液的酒精度和OD600。葡萄糖起始濃度為 100 g/L、150 g/L、200 g/L、250 g/L、300 g/L、350 g/L。

1.3.6 酒精的測(cè)定方法

酒精濃度的測(cè)定采用酒精比重計(jì)法測(cè)定[11-12]。

2 結(jié)果與討論

2.1 高產(chǎn)酒精酵母菌的分離篩選

從混合菌粉中分離篩選出50株單菌落，經(jīng)TTC培養(yǎng)基初篩，獲得5株顏色較深的菌株，菌株編號(hào)為 S-21、S-31、S-36、S-37、S-40。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 TTC培養(yǎng)基初篩

將初篩得到的5株酵母菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同酵母菌產(chǎn)酒精能力的比較

由表1可見(jiàn)，菌株生物量、產(chǎn)酒精和產(chǎn)氣能力有一定的差異，生物量變化：S-21＞S-36＞S-40＞S-31＞S-37；產(chǎn)酒精能力為：S-21＞S-36＞S-40＞S-37＞S-31；產(chǎn)氣能力為：S-21=S-40＞S-36=S-37＞S-31；其中菌株S-21、S-36、S-40的OD600值和產(chǎn)酒精能力均分別在1.3和8.0%vol以上，而且產(chǎn)氣量也比較多。因此綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇菌株S-21、S-36、S-40進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酒精酵母發(fā)酵性能的影響

將菌株S-21、S-36、S-40接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，每隔一段時(shí)間取樣測(cè)定發(fā)酵液的OD600，探索培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酵母菌發(fā)酵及生長(zhǎng)性能的影響。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酵母菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酒精性能的影響

由圖2可見(jiàn)，菌株S-21、S-36、S-40的生物量和產(chǎn)酒精能力均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升后降的趨勢(shì)；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為72 h時(shí)，3株菌株的生物量和酒精度均達(dá)到最大值，分別為2.289、2.245、2.393和8.4%vol、9.4%vol、8.9%vol，之后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株的生物量和發(fā)酵液中的酒精度減少?？赡芤?yàn)殡S著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)成分的消耗及廢棄物的積累，不利于菌株的生長(zhǎng)；同時(shí)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中，發(fā)酵液中酒精的揮發(fā)，導(dǎo)致越到后面，發(fā)酵液中的酒精度反而越低。因此，3株菌株的最適發(fā)酵時(shí)間均為72 h。

2.3 酒精酵母耐受性的實(shí)驗(yàn)

2.3.1 酒精酵母耐高溫試驗(yàn)

將活化后的菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，在不同溫度下培養(yǎng)72 h，測(cè)定各菌株發(fā)酵液的OD600和酒精度，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)酵母菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酒精性能的影響

由圖3可見(jiàn)，不同菌株的生物量和產(chǎn)酒精能力有一定的差異。菌株S-21、S-36、S-40的生物量和酒精產(chǎn)量均隨著培養(yǎng)溫度的升高呈先升后降的趨勢(shì)；在同一溫度下，菌株S-36的生物量和酒精度均高于菌株S-21和S-40；當(dāng)發(fā)酵溫度為40℃時(shí)，菌株S-21、S-36、S-40的生物量和酒精產(chǎn)量均達(dá)到最高，菌株S-21、S-36、S-40的生物量分別為2.023、2.170、1.833，而酒精產(chǎn)量分別為8.3%vol、9.6%vol、8.5%vol，表明菌株S-21、S-36、S-40均為較好的耐高溫酵母菌株。

2.3.2 酒精酵母乙醇耐受試驗(yàn)

將活化后的菌株接種于含有不同乙醇濃度的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，40℃下培養(yǎng)72 h，測(cè)定各菌株發(fā)酵液的OD600，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同乙醇濃度對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響

由圖4可知，隨著發(fā)酵培養(yǎng)基中乙醇濃度的增加，菌株S-21、S-36、S-40的生物量均隨著培養(yǎng)基中乙醇濃度的增加逐漸減少，表明高濃度的乙醇會(huì)抑制酵母菌的生長(zhǎng)發(fā)育；當(dāng)乙醇濃度一致時(shí)，菌株S-36的生物量均高于菌株S-21和菌株S-40，說(shuō)明菌株S-36的生長(zhǎng)繁殖情況比其余兩株菌好，對(duì)乙醇具有更好的耐受性?？傊闟-21、S-36、S-40均具有較好的乙醇耐受性。

2.3.3 酒精酵母糖濃度耐受試驗(yàn)

將活化后的菌株接種于含有不同葡萄糖濃度的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，40℃下培養(yǎng)72 h，測(cè)定各菌株發(fā)酵液的OD600和酒精度，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，菌株S-21、S-36、S-40的生物量和酒精度均隨著培養(yǎng)液中葡萄糖濃度的增加呈先升后降的趨勢(shì)；在同一葡萄糖濃度的發(fā)酵液中，菌株生物量和酒精度的大小順序均為S-36＞S-21＞S-40；當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度從150 g/L上升到200 g/L時(shí)，3株菌的生物量和酒精產(chǎn)量均大幅度上升，當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖初始濃度為200 g/L，3株菌的生物量和酒精度均達(dá)到最大值，菌株S-21、S-36、S-40的生物量分別為2.029、2.134、2.016，而酒精產(chǎn)量分別為 8.5%vol、9.7%vol、8.2%vol，當(dāng)葡萄糖濃度從200 g/L到300 g/L，3株菌的生物量和酒精度變化均不大?？傊?株菌均有較好的耐糖性。

表2 初始葡萄糖濃度對(duì)酵母菌生長(zhǎng)和酒精產(chǎn)量的影響

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò)酵母菌的分離試驗(yàn)，初步篩選、復(fù)篩，探究培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酵母菌發(fā)酵性能的影響以及酵母菌的耐受性等一系列試驗(yàn)可得出以下結(jié)論：

（1）經(jīng)過(guò)酵母菌的富集培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)，通過(guò)TTC平板顯色實(shí)驗(yàn)，篩選得到5株顯色較深的酵母菌，然后經(jīng)過(guò)產(chǎn)氣和產(chǎn)酒精能力復(fù)篩最終得到菌株S-21、S-36、S-40這3株產(chǎn)氣和產(chǎn)酒精能力較強(qiáng)的酵母菌。

（2）對(duì)這3株菌的耐受性實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)這3株菌可耐40℃高溫，耐200 g/L高糖，耐20%vol高乙醇濃度的能力。