張會(huì)梅 孫亞磊 王艷玲 鐘英杰 魏秀麗 付海寧 欒明娜 龐云露 蔣貽海 徐恩民

摘要：采用高效液相法對(duì)柴芍口服液指標(biāo)性成分芍藥苷含量進(jìn)行測(cè)定。色譜柱：ZorbaxSBC18（4.6mm×250mm，5μm）;流動(dòng)相：乙腈+0.05%磷酸溶液（14∶86）;流速：1.0mL/min;柱溫：35℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm。經(jīng)精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率等驗(yàn)證，在該色譜條件下能夠達(dá)到對(duì)柴芍口服液的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：柴芍口服液;高效液相色譜;芍藥苷

中圖分類號(hào)：S815.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）05-0144-04

本研究中的新中獸藥柴芍口服液由柴胡、白芍、枳實(shí)、甘草4味中藥組方，經(jīng)提取制備而成，具有透解郁熱、調(diào)和肝脾的功效，主治由霉菌毒素導(dǎo)致的雞肝損傷。柴胡的主要有效成分為五環(huán)三萜類柴胡皂苷a-f和揮發(fā)油，具有鎮(zhèn)靜、解熱鎮(zhèn)痛、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等功能[1];白芍中含有豐富的單萜苷類化合物，以芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、羥基芍藥苷和氧芍藥苷等為主，具有多途徑抑制自身免疫反應(yīng)，以及抗炎、止痛、保肝等多種藥理作用[2];枳實(shí)主要含有黃酮類、生物堿類、揮發(fā)油類等成分，具有調(diào)節(jié)腸胃運(yùn)動(dòng)、調(diào)節(jié)子宮功能、升壓、強(qiáng)心、抗氧化、抗菌、鎮(zhèn)痛、抗血栓等藥理作用[3];甘草的活性成分是三萜皂苷和黃酮類化合物，具有抗?jié)?、抗炎、解痙、抗氧化、抗病毒、抗癌、抗抑郁、保肝、祛痰和增強(qiáng)記憶力等多種藥理活性。芍藥苷為柴芍口服液中的重要有效成分。參照文獻(xiàn)[4]，本試驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)本品中芍藥苷含量進(jìn)行檢測(cè)，并提供方法學(xué)研究資料。

1材料與方法

1.1藥品及對(duì)照品

柴芍口服液（批號(hào)：20180601），濰坊諾達(dá)藥業(yè)生產(chǎn)。

芍藥苷：中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度96.4%，批號(hào)：110736-201438。

1.2儀器與試劑

Agilent1260高效液相色譜儀（G1311C四元泵，G1329B自動(dòng)進(jìn)樣儀，G1316A柱溫箱，G4212B二極管陣列檢測(cè)器，Agilent化學(xué)工作站）;Agilent1200高效液相色譜儀（G1322A脫氣機(jī)，G1311A四元泵，G1329A自動(dòng)進(jìn)樣儀，G1315D二極管陣列檢測(cè)器，Agilent化學(xué)工作站）。

AS20500B型超聲波清洗儀：天津AutoScienceCo.Ltd.;DHG-9101.2S型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋DK-S2.4：上海三發(fā)科學(xué)儀器公司;BT125D型電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

試劑：甲醇（色譜純）：MercKKGaA;乙腈（色譜純）：美國(guó)Tedia天地試劑公司;磷酸為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3方法

1.3.1色譜條件

色譜柱：ZorbaxSBC18（4.6mm×250mm，5μm）;流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸溶液（14∶86）;流速：1.0mL/min;柱溫：35℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：230nm;進(jìn)樣量10μL。液相色譜梯度洗脫見表1。

1.3.2樣品及對(duì)照品溶液的制備

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取芍藥苷對(duì)照品適量，加14%乙腈制成80μg/mL的溶液，即得。

供試品溶液的制備：精密量取本品1mL，置50mL量瓶中，用14%乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2結(jié)果與分析

2.1系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

取試驗(yàn)藥品（批號(hào)：20180601），按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按建立的色譜條件進(jìn)樣分析6次，記錄色譜圖。結(jié)果（表2）：理論板數(shù)n>3000，芍藥苷與最鄰近峰的分離度R>1.5，試驗(yàn)系統(tǒng)可靠有效。

2.2專屬性試驗(yàn)

按照樣品的制備方法，制備缺失芍藥苷的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液，分別精密吸取陰性對(duì)照溶液與芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液各10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果：陰性樣品的圖譜中（圖1），在與供試品圖譜中芍藥苷（圖2）的色譜峰位置上（Rt=12.756）無干擾，說明本方法測(cè)定芍藥苷專屬性良好。

2.3線性關(guān)系考察

精密稱定20.24mg芍藥苷，置50mL量瓶中，加入14%乙腈溶液，溶解后稀釋定容至刻度，得含芍藥苷401.76μg/mL的對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液適量，用14%乙腈稀釋，得分別含芍藥苷16.07、40.18、80.35、160.70、200.88、401.76μg/mL的系列對(duì)照品溶液。

按建立的色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜圖與峰面積，結(jié)果見表3。以芍藥苷峰面積為縱坐標(biāo)，芍藥苷的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線（n=6）（圖3）?；貧w方程：y=12.465x+21.147，R2=0.9997。表明芍藥苷含量在16.07～401.76μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4精密度試驗(yàn)

按供試品溶液制備方法，制備批號(hào)20180601的供試品溶液。按建立的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積值，結(jié)果見表4。按芍藥苷峰面積計(jì)算RSD值等于0.87%（n=6），說明儀器的精密度良好。

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品（批號(hào)：20180601），按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按上述色譜條件分別于0、2、4、6、8、12h進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積值，結(jié)果見表5。按芍藥苷峰面積計(jì)算RSD等于0.37%（n=6），說明樣品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品（批號(hào)：20180601），按供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，根據(jù)峰面積值計(jì)算芍藥苷含量，結(jié)果見表6。按芍藥苷含量計(jì)算RSD等于0.43%（n=6），說明方法重復(fù)性良好。

2.7回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量的同一批號(hào)樣品（批號(hào)：20180601）0.5mL共6份，分別置于50mL的容量瓶中，分別加入25mL芍藥苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液（90.89μg/mL），加入14%乙腈定容至刻度，按供試品溶液制備方法制備供試品，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過后，吸取10μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。結(jié)果見表7：芍藥苷的平均回收率為101.81%，RSD為0.73%（n=6）。

2.8耐用性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品（批號(hào)：20180601），按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，分別考察流動(dòng)相比例變化（±2%）、柱溫變化（±5℃）、流速相對(duì)值變化（±20%）、同一類型不同廠牌色譜柱對(duì)樣品色譜行為的影響，記錄色譜圖。觀察芍藥苷峰和臨近峰的基線分離情況，并計(jì)算各條件下芍藥苷含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果見表8：在各條件下，芍藥苷峰與臨近峰達(dá)到基線分離。并且在流動(dòng)相比例、柱溫有小的變動(dòng)、換用同一類型不同廠牌色譜柱時(shí)，均不影響含量測(cè)定結(jié)果。

3結(jié)論

柴芍口服液是由四逆散經(jīng)過提取而制成的制劑。在含量測(cè)定部分，以柴芍口服液中的芍藥苷為指標(biāo)成分，通過色譜條件的優(yōu)化，建立了理論塔板數(shù)高、分離度好的色譜條件。經(jīng)過精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性考察及加樣回收率試驗(yàn)等方法學(xué)驗(yàn)證，該方法具有較高的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，能夠達(dá)到對(duì)新中獸藥柴芍口服液中芍藥苷的含量檢測(cè)要求。

參考文獻(xiàn)：

[1]謝東浩，蔡寶昌，安益強(qiáng)，等.柴胡皂苷類化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，23（1）：63-65.

[2]高小榮，田庚元.白芍化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志，2006，15（6）：416-418.

[3]張紅，孫明江，王凌.枳實(shí)的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中藥材，2009，32（11）：1787-1790.

[4]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[M].2015版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，267，786.