郭亞南 梁國標 陳安健 王遠亮 王欣 梁天才 杜洋 杜江 李浩 余浪

(遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院泌尿外科，貴州 遵義 563000)

腎臟感染結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)后，一方面MTB可直接侵襲并損傷腎臟，另一方面機體產(chǎn)生的免疫炎癥反應也會加重腎臟損傷，損害腎功能。自噬是真核生物普遍存在而又重要的一種生命現(xiàn)象，自噬的主要作用是降解自身受損的細胞器以及胞漿內(nèi)某些大分子物質(zhì)，產(chǎn)生能量、氨基酸及核苷酸等物質(zhì)，在維持細胞穩(wěn)態(tài)和細胞生命活動等方面起重要作用。研究表明，自噬可殺滅病原體[1]，自噬在結核病的先天性和獲得性免疫反應中發(fā)揮著突出作用，能直接降解MTB[2-4]，而MTB可自分泌一些物質(zhì)抑制自噬[5-6]。由于死亡的分枝桿菌可能增加炎癥反應，在腎結核治療過程中結核病灶會進一步發(fā)展破壞腎正常的組織結構，部分病人的病情可能會惡化。目前，腎組織感染結核桿菌后自噬在結核分支桿菌感染中的作用及其機制尚不清楚，值得進一步探討。所以通過檢測自噬相關基因LC3 、Beclin-1及促纖維化因子CTGF在結核腎組織中的表達變化，對腎結核中自噬的表達和意義以及自噬和腎組織纖維化的關系進行初步探討，為腎結核防治提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1組織標本和分組 所取標本來自2013年1月至2014年4月期間我科室手術切除的結核腎臟、腎結石并無功能腎臟及正常腎組織標本，各組6例。分別取各組腎組織(約1 mm3)用戊二醛浸泡制作電鏡標本，各組部分腎組織采用4 %多聚甲醛浸泡固定備HE染色和免疫組織化學檢測，部分腎組織裝入無霉EP管并液氮凍存，備RT-PCR檢測LC3基因表達。收集各組患者尿液備檢。

1.2實驗方法

1.2.1HE染色觀察腎組織病理變化 取4 μm厚石蠟切片脫蠟至水；蘇木素染色5 min，流水沖洗10 min；鹽酸乙醇(1%)分化30 s；流水浸泡15 min；伊紅液復染2 min。

1.2.2尿IFN-γ含量測定 采用Chemistry Analyser AU5400全自動生化分析儀測定各組患者尿液IFN-γ含量，測出后根據(jù)稀釋比例計算出各組尿液中IFN-γ原始濃度值。

1.2.3免疫組織化學法檢測各組LC3、Beclin-1、CTGF的表達 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，微波修復抗原(LC3 約10 min，Beclin-1和CTGF各 15 min)后自然冷卻，PBS液沖洗15 min；LC3每張切片按1∶100(Beclin-1、CTGF一抗?jié)舛确謩e為1∶50、1∶400，香港Abcam公司)的比例添加一抗稀釋液，陰性對照以PBS液代替一抗，4 ℃孵育20 h； PBS液沖洗10 min×2次，滴加二抗(抗鼠/兔通用型，上海基因科技有限公司)20 μL，37 ℃孵育30 min，PBS液沖洗5 min×3次；DAB顯色液顯色(上?；蚩萍加邢薰?；蘇木素復染。各蛋白陽性表達呈黃色或棕黃色顆粒，陰性對照組無陽性顆粒。固定采圖軟件參數(shù)，于400倍視野下每張切片隨機采集6個視野，應用Leica Qwin圖像處理系統(tǒng)采集圖像。每張圖像應用Image-proplus 6.0圖像分析軟件測量積分光密度(IOD)進行相對定量分析。

1.2.4各組腎組織超微結構檢測 各組腎組織(約1 mm3)經(jīng)戊二醛和鋨酸固定后制成超薄切片(60～70 nm)，4%醋酸鈾液染色30 min后于透射電鏡(日本日立公司)下觀察腎組織的變化。

1.2.5real-time PCR(RT-PCR)檢測腎組織LC3mRNA的表達 (1)提取腎組織總RNA：將測定好純度的RNA樣本用DEPC水(0.1%)稀釋成終濃度為50ng/μL的RNA。(2)逆轉錄合成cDNA(試劑盒購自大連寶生物工程有限公司)：在祛酶反應管中依次加入2.0 μL 5×Prime Script Buffer、0.5 μL Prime Script RT Enzyme Mix Ⅰ、0.5 μL Oligo dT Primer(50 μM)、0.5μL Random 6 mers(100 μM)、6 μL Total RNA 4.0 μL、Rnase Free dH2O，總量共10.0 μL。按37 ℃15 min(逆轉錄)，85 ℃ 5 s(逆轉錄酶的失活反應)，4 ℃，forever進行逆轉錄。(3)實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測LC3mRNA的表達(試劑盒購自大連寶生物工程有限公司)：在0.2 mL反應管中依次加入10.0 μL SYBR Premix Ex TaqTMII(2×)、0.8μL LC3PCR Forward Primer(10 μM)、0.8μL LC3PCR Reverse Primer(10 μM)、2.0 μL cDNA、6.4 μL ddH2O，總量共20.0 μL。以β-actin為內(nèi)參，同樣在無酶PCR反應管中依次加入10.0 μL SYBR Premix Ex TaqTMII(2×)、0.8 μL β-actinPCR Forward Primer(10 μM)、0.8 μL β-actinPCR Reverse Primer(10 μM)、2.0 μL cDNA、6.4 μL ddH2O，總量共20.0 μL。LC3 PCR Forward Primer：5’TACGAGCAGGAGAAAGACGAGGAC，Reverse Primer：5’GGTAGAGGCAGCTCAGTTCAGGA，擴增片段長度為165bp。β-actin Forward Primer：5’TACGAGCAGGAGAAAGACGAGGAC，Reverse Primer：5’CTCGGCCACATTGTGAACTTTG。擴增片段長度為198 bp。按以下條件進行PCR擴增反應：預變性(95 ℃，30 s，1 Cycle)；PCR反應(95 ℃，5 s；退火溫度60 ℃，30 s，40 Cycles)；融解和延伸(55 ℃，10 s，81 Cycles)。(4)相對定量法測定每個樣本β-actin、LC3基因擴增的Ct值：取基因(目的/內(nèi)參)3個復孔Ct值的平均值；計算Ct =Ct average(目的/內(nèi)參)，并取平均值；計算各組△Ct=Ctaverage樣本-Ctaverage內(nèi)參，△△Ct=△Ct樣本-△Ct正常對照組，以2-△△Ct值對LC3基因的表達進行相對定量。

2 結 果

2.1各組尿IFN-γ含量比較 正常組(13.65±0.99) IU/mL，結石組(17.59±1.16) IU/mL，結核組(20.61±1.20) IU/mL。結核組和結石組尿IFN-γ含量顯著高于正常組(P<0.05)，而結核組IFN-γ含量又顯著高于結石組(P<0.05)。

2.2各組腎組織病理變化 正常組的腎小管、腎小球結構正常；結核組的腎組織結構破壞嚴重，可見大量上皮樣細胞增生結節(jié)，其內(nèi)見朗格漢斯巨細胞形成，中央可見干酪樣壞死，結節(jié)周圍見淋巴細胞，部分腎小管、腎小球明顯萎縮、減少，部分腎小管擴張，間質(zhì)見大量纖維組織增生；結石組的部分腎小管萎縮、硬化，部分腎小管擴張伴蛋白管型形成，系膜細胞增生，間質(zhì)見大量纖維增生，伴大量淋巴細胞、中性粒細胞浸潤。見圖1。

2.3免疫組化檢測各組腎組織中LC3、Beclin-1以及CTGF蛋白的表達 LC3：正常組腎小管上皮細胞和腎小球內(nèi)皮細胞胞漿只有少量表達；結核組和結石組腎小管上皮細胞胞漿有大量表達，腎小球內(nèi)皮細胞僅有少量表達。Beclin-1：正常組腎小球內(nèi)皮細胞和腎小管上皮細胞胞漿只有少量表達；結核組和結石組腎小球內(nèi)皮細胞胞漿有大量Beclin-1蛋白表達，腎小管上皮細胞僅有少量表達。CTGF：正常組腎小管上皮細胞核僅有少量表達，而結核組和結石組腎小管上皮細胞核均有大量CTGF蛋白表達。見圖2。LC3、Beclin-1以及CTGF蛋白的相對定量結果顯示，在結核組和結石組中三種蛋白的 IOD值均明顯高于正常組(P<0.05)，而三者在結核組和結石組之間卻無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組腎組織LC3、Beclin-1以及CTGF蛋白的相對表達量

注：與正常組比較，*P<0.05；與結石組比較，#P>0.05。

2.4腎組織超微結構的變化 正常組電鏡下腎小管、腎小球結構正常，細胞質(zhì)內(nèi)細胞器結構及分布正常，未見明顯雙層膜形成的自噬體(圖3A)。結核組腎小球臟層細胞足突部分融合，基底膜增厚，部分細胞皺縮、壞死，胞漿腫脹，部分細胞破裂，細胞核染色質(zhì)邊集，核碎裂，線粒體腫脹，線粒體嵴變平、消失；見大量獨立雙層膜結構包裹部分胞質(zhì)成分、溶酶體等細胞器形成的自噬體(圖3B箭頭所示)，間質(zhì)見大量膠原纖維(圖3C箭頭所示)。結石組腎小球臟層細胞足突部分融合，基底膜增厚，細胞核染色質(zhì)邊聚，線粒體腫脹，失去正常線粒體嵴結構，胞質(zhì)中出現(xiàn)獨立雙層膜結構，且延伸包裹部分胞質(zhì)成分、溶酶體等細胞器形成自噬體(圖3D箭頭所示)，間質(zhì)見大量膠原纖維(圖3E箭頭所示)。

2.5各組腎組織LC3mRNA的表達量比較 正常組為(1.18±0.13)，結石組為(0.32±0.08)，結核組為(0.35±0.09)。結石組、結核組腎組織LC3mRNA的表達量低于正常組(P<0.05)。

2.6相關性分析 對腎組織LC3、Beclin-1蛋白與CTGF表達結果行相關分析，結果顯示，CTGF與LC3和Beclin-1蛋白表達均呈正相關(r=0.43、0.593，P<0.05)。

3 討 論

腎結核由感染MTB而致病，其致病物質(zhì)主要是脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和多糖等成分，而機體對這些成分產(chǎn)生的免疫反應與結核病密切相關。本研究結果顯示，腎結核以及結石梗阻致腎功能損害時腎組織結構均破壞嚴重，主要表現(xiàn)為腎小球臟層細胞足突部分融合，胞漿腫脹，細胞破裂，核碎裂，線粒體腫脹，胞質(zhì)中出現(xiàn)大量自噬體，間質(zhì)膠原纖維形成。因此，臨床上如何有效減輕MTB所致的組織毀損對腎結核的防治具有重要意義。研究[7]發(fā)現(xiàn)，細菌細胞壁的脂多糖能引起新生小鼠心肌細胞發(fā)生自噬，也可作為抗原分子促進MHC II類抗原加工并遞呈給免疫細胞增強細胞免疫，從而限制活性氧(ROS)的損傷作用。而ROS也可誘導與Vps34-Beclin-l復合體相關的自噬，通過下調(diào)自噬抑制基因 Atg4的表達達到增強自噬的目的[8]。MTB感染宿主后，吞噬泡吞噬MTB形成自噬體并與溶酶體融合能分解MTB[9]。

LC3和Beclin-l蛋白是自噬標志性蛋白，X.H.Liang等[10]研究發(fā)現(xiàn)Beclin-1廣泛分布于人類組織中。本研究顯示在結核腎、結石梗阻后腎組織中LC3和Beclin-l蛋白的表達水平無明顯差別，但明顯高于正常腎組織，提示結核腎組織中自噬活性明顯升高，這可能對限制腎結核病變的發(fā)展有一定作用。然而，另有研究[11]發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞中MTB 分泌的Hsp16.3可通過降低 LC3 的表達干擾自噬體的形成，從而阻礙自噬清除MTB，這或許是MTB免疫逃逸的一個機制。本研究發(fā)現(xiàn)，結核腎及結石梗阻腎組織中LC3mRNA的表達水平較正常組低，結合LC3蛋白表達結果表明結核腎及結石梗阻腎組織中自噬基因的轉錄水平受到抑制，而自噬蛋白的表達卻被明顯上調(diào)。本研究證實，腎結核及結石梗阻致腎功能損害時尿中IFN-γ顯著增高，并與腎組織LC3和Beclin-l蛋白的表達呈正相關，表明IFN-γ可上調(diào)LC3和Beclin-l蛋白的表達增強自噬。在上述兩種病理情況下，雖然自噬基因的轉錄水平受到抑制，但由于IFN-γ的作用，自噬活性增強。我們認為，在腎結核中這一現(xiàn)象可能是腎臟局部微環(huán)境針對炎癥反應應答的一種適應性的保護性反應。這種適應性調(diào)節(jié)有可能限制部分細菌的生長，但其作用有限，無法控制細菌對腎組織的進一步毀損。因此，這為腎結核感染的防治提供了新的思路，即通過促進腎組織的自噬達到減輕細菌感染所致的組織毀損。研究[12]證實IFN-γ能上調(diào)自噬。孫立等[13]研究發(fā)現(xiàn)，結核腎組織中IFN-γ參與MTB的免疫應答過程，且表達增強。IFN-γ可顯著激活巨噬細胞吞噬和殺傷病原體的能力[14]。臨床上針對耐藥肺結核通過吸入IFN-γ的輔助免疫治療在臨床實驗中已取得進展[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，結核腎組織中重要自噬靶點是腎實質(zhì)細胞，通過對自噬靶點的外源性干預可能對腎結核的治療具有積極意義。

研究[16]證實，結締組織生長因子(CTGF)是各種腎臟病纖維化的重要調(diào)節(jié)因子。正常組織中有少量CTGF表達，當發(fā)生疾病時CTGF則大量表達[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，腎結核和結石梗阻后CTGF表達明顯，主要表達于腎小管上皮細胞核。觀察超微結構也發(fā)現(xiàn)，結核腎和結石梗阻后腎組織間質(zhì)中有大量膠原纖維形成，表明腎結核及結石梗阻后腎組織CTGF表達的增強可促進腎組織纖維化。研究[18]發(fā)現(xiàn)，自噬可誘導CTGF表達以及促進肌成纖維細胞的分化。通過對CTGF和LC3、Beclin-1蛋白表達結果的相關分析，發(fā)現(xiàn)CTGF和LC3及 Beclin-1蛋白的表達呈正相關，推測自噬可促進腎纖維化。

綜上所述，腎組織感染MTB后，腎小管上皮細胞及腎小球內(nèi)皮細胞是重要的自噬靶點，這為通過對自噬的調(diào)節(jié)從而達到有效防治腎結核的目的提供了新的思路。本研究僅初步探討了自噬在晚期結核腎及結石梗阻的腎組織中表達的變化，在腎臟結核感染和非特異性感染情況下，腎組織自噬活性明顯增強，這可能是腎臟局部微環(huán)境針對炎癥反應應答的一種適應性的保護性反應，但是自噬在腎結核發(fā)展不同階段的具體作用和機制仍需進一步探討。

自噬在結核腎組織中的表達及意義

注：A.正常組；B.結核組；C.結石組。

圖1各組腎組織病理改變(HE，×400)

圖2 各組腎組織LC3、Beclin-1以及CTGF蛋白的表達變化(IHC，×400)

注：A.正常組；B. 結核組；C.結核組；D.結石組；E.結石組。

圖3各組腎組織超微結構改變(×10000)