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        金黃色葡萄球菌生物傳感檢測(cè)方法研究

        2019-06-27 19:15:58楊麗霞
        食品安全導(dǎo)刊 2019年5期
        關(guān)鍵詞:金黃色葡萄球菌

        摘 要:本文的目的是建立一種運(yùn)用電化學(xué)免疫傳感器快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法。該傳感器采用微間隙陣列電極作為基礎(chǔ)電極,運(yùn)用雙抗夾心酶聯(lián)免疫反應(yīng)和酶催化銀沉積反應(yīng)實(shí)現(xiàn)分析信號(hào)放大。該方法特異性良好,對(duì)非目標(biāo)菌株無(wú)交叉反應(yīng),檢出限為104CFU/mL,線性范圍為104~108CFU/mL,傳感器的電導(dǎo)率與金黃色葡萄球菌濃度之間的線性關(guān)系較好,線性相關(guān)系數(shù)R2=0.947。本研究證明,電化學(xué)免疫傳感器快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌法具有檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn),為金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)工作提供了一種有效手段。

        關(guān)鍵詞:微間隙陣列電極傳感器 金黃色葡萄球菌 酶催化銀沉淀

        金黃色葡萄球菌是革蘭式陽(yáng)性球菌中最為常見的一種,其廣泛存在于自然界,可引起食物中毒、腦膜炎、骨髓炎、心內(nèi)膜炎等疾病[1]。金黃色葡萄球菌是細(xì)菌性食物中毒事件的主要誘發(fā)因子[2],因此準(zhǔn)確快速地檢測(cè)金黃色葡萄球菌對(duì)食品安全檢測(cè)工作來(lái)說(shuō)非常重要。目前,針對(duì)金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法主要是微生物培養(yǎng)法,但需要增菌、分離、生化鑒定等步驟,檢測(cè)時(shí)間通常在4天以上[3]。該方法基于致病菌的生長(zhǎng)代謝,操作復(fù)雜且檢測(cè)周期較長(zhǎng),無(wú)法滿足現(xiàn)場(chǎng)快速、準(zhǔn)確檢測(cè)的要求。本研究擬運(yùn)用金黃色葡萄球菌特異性單、多克隆抗體,在微間隙陣列電極上包被多克隆抗體用于捕獲目標(biāo)物,當(dāng)目標(biāo)物存在時(shí),單克隆抗體特異性識(shí)別目標(biāo)物就會(huì)形成三明治結(jié)構(gòu)的免疫復(fù)合物,體系中的堿性磷酸酶可將銀離子還原,而形成的銀單質(zhì)沉淀在電極表面及其間隙中。與此同時(shí),電極間的電導(dǎo)率與銀單質(zhì)的沉淀量呈線性關(guān)系,可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的定量分析[4]。本方法具有精準(zhǔn)快速、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn),可用于金黃色葡萄球菌及其它食源性致病菌的快速檢測(cè)。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試劑

        金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、沙門氏菌[CMCC(B)50115]、大腸桿菌O157:H7(ATCC 43889)、副溶血性弧菌(ATCC 17802)、阪崎腸桿菌(CICC 21561)、蠟樣芽胞桿菌[CMCC(B)63303]、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(ATCC 19115)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853),以上菌株均購(gòu)買自相應(yīng)的菌種保藏中心。

        抗金黃色葡萄球菌多克隆抗體、單克隆抗體,購(gòu)自上?;墼派锟萍加邢薰?;堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AP)標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、抗壞血酸磷酸酯(ascorbic acid 2-phosphatase,AAP),購(gòu)自sigma公司;AgNO3、甘氨酸,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

        主要儀器:CHI760D電化學(xué)工作站,上海辰華儀器公司;LRH-250F數(shù)顯恒溫器,上海一恒科技有限公司;微間隙陣列電極傳感器件,實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)[4]。

        1.2 菌液準(zhǔn)備

        菌種活化后,菌液用麥?zhǔn)媳葷峁軠y(cè)定其濃度,滅活后用生理鹽水稀釋制備成不同濃度的菌懸液。

        1.3 試驗(yàn)方法

        微間隙陣列電極用無(wú)水乙醇和超純水清洗后晾干;工作芯片用5μg/mL金黃色葡萄球菌多克隆抗體包被;加入1%脫脂奶粉溶液200μL,在37℃恒溫孵育1h,封閉芯片表面未結(jié)合抗體的位點(diǎn);加入滅活菌液100μL,37℃孵育1h;加入5μg/mL金黃色葡萄球菌單克隆抗體100μL,37℃孵育30min;加入AP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 100μL,37℃孵育30min;加入含1mmol/L AAP和5mmol/L AgNO3的底物溶液100μL,37℃避光孵育10min,用超純水清洗3次,晾干后待測(cè)。

        將微間隙陣列電極傳感器的電極與電化學(xué)工作站的工作電極連接,采用線性掃描伏安法在0~50mV點(diǎn)位范圍檢測(cè)。

        1.4 特異性分析

        以金黃色葡萄球菌為陽(yáng)性對(duì)照,以沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7等標(biāo)準(zhǔn)菌株作為特異性檢測(cè)菌株,以PSBT做空白對(duì)照,從而驗(yàn)證方法的特異性。

        1.5 靈敏度分析

        將金黃色葡萄球菌滅活菌液稀釋為1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108CFU/mL等5個(gè)濃度梯度,以PBST作為陰性對(duì)照,通過(guò)檢測(cè)電導(dǎo)信號(hào)確定方法的檢測(cè)靈敏度。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 檢測(cè)方法特異性

        使用微間隙陣列電極傳感器檢測(cè)了8種致病菌,以測(cè)試該方法的特異性,不同菌種檢測(cè)的電導(dǎo)值變化見圖1。由圖1可見,只有加入金黃色葡萄球菌懸液的傳感器電導(dǎo)率變化明顯,空白對(duì)照和非目標(biāo)菌株的電導(dǎo)率變化不明顯,說(shuō)明該方法對(duì)金黃色葡萄球菌的特異性較高,且與其他菌株無(wú)交叉反應(yīng)。

        2.2 檢測(cè)方法靈敏度

        金黃色葡萄球菌濃度在104~108CFU/mL范圍內(nèi)變化時(shí),其LSV響應(yīng)曲線見圖2。由圖2可知,菌液濃度越高,其電導(dǎo)值越大,該方法的檢測(cè)限為104CFU/mL。同時(shí),金黃色葡萄球菌濃度越高,檢測(cè)到的電導(dǎo)率越大,二者之間呈線性關(guān)系(如圖3),其線性方程為:電導(dǎo)率(pS)=1169LogC(CFU·mL-1)-1141,R2=0.947。

        3 結(jié)論

        本文采用微間隙陣列電極作為基礎(chǔ)電極,結(jié)合雙抗夾心免疫反應(yīng)構(gòu)建了電化學(xué)免疫傳感器,通過(guò)電化學(xué)分析,實(shí)現(xiàn)了對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,該方法特異性良好,檢測(cè)靈敏度可達(dá)104CFU/mL,檢測(cè)電導(dǎo)率和菌濃度呈正相關(guān),線性相關(guān)系數(shù)為0.947。本方法利用堿性磷酸酶的催化作用,使銀離子還原成銀單質(zhì)沉淀在電極之間,相鄰的電極被導(dǎo)通從而在有外加電壓時(shí)產(chǎn)生電流信號(hào),電化學(xué)信號(hào)放大系統(tǒng)具有靈敏度高、高效、背景干擾低等優(yōu)點(diǎn)。免疫反應(yīng)采用雙抗夾心法,包被抗體為多克隆抗體,能有效捕獲目標(biāo)菌株,識(shí)別抗體為單克隆抗體,有效提高了該方法的特異性。該方法將電化學(xué)生物傳感技術(shù)與免疫學(xué)方法有效結(jié)合,可以將封閉好的芯片真空干燥后密閉保存,現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)只需加增菌液的后續(xù)步驟,從而縮短了檢測(cè)時(shí)間,可以滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要。

        參考文獻(xiàn):

        [1] Ding Tian, Shim Young-Hwan, Choi Na-Jung, et al. Mathematical modeling on the growth of Staphylococcus aureus in sandwich. Food Sci Biotechnol, 2010,19(3):763-768.

        [2] Argudín M–, Mendoza MC, Rodicio MR. Food poisoning and Staphylococcus aureus enterotoxins. Toxins 2010,2: 1751–1773.

        [3] Murakami T. Filter-based pathogen enrichment technology for detection of multiple viable foodborne pathogens in 1 day. J Food Prot, 2012,75:1603–1610.

        [4] 楊麗霞,邱華麗,周金沙等.基于微間隙陣列電極傳感器檢測(cè)副溶血性弧菌的方法初探.食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào).2017,8(8):3151-3155.

        基金項(xiàng)目:國(guó)家公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目(編號(hào):201310130);長(zhǎng)沙市科技計(jì)劃項(xiàng)目(kq1801151)。

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